Частые проб крови кончик хвоста у мышей для оценки пульсирующего лютеинизирующего гормона

Резюме

Здесь мы представляем протокол выборки кончик хвоста крови для частых проб в безудержной мышей. Этот метод полезен для оценки шаблонов пульсирующего лютеинизирующего гормона и могут быть адаптированы для анализа других циркулирующих факторов.

Аннотация

В многих эндокринных систем циркулирующих факторов или гормоны не освобождаются непрерывно, но выделяется как дискретный импульс в ответ на освобождение фактор. Одной точки выборки меры недостаточны для полного понимания биологической значимости секреторной шаблон пульсирующего гормонов при нормальных физиологических условиях или в условиях регуляции. Лютеинизирующий гормон (ЛГ) синтезируется клетками передней гипофиза gonadotrope и выделяется в шаблоне пульсирующего, которая требует частого сбора образцов крови для оценки импульса. Это не было возможным в мышей до недавно, благодаря развитию пробирного LH высок чувствительности и улучшения в технике для частых низким объемом проб, первоначально описанные Стейн и коллег. ¹ здесь мы описываем протокол для коллекции образцов частыми периферической крови от мышей с достаточной обработки акклиматизации обнаружить пульсирующего секрецию ЛГ. Текущий протокол подробности Расширенный Акклиматизационный период, который позволяет оценки стабильная и непрерывная импульсов ЛГ в течение нескольких часов. В этом протоколе кончик хвоста обрезается и кровь собирается из хвоста, с помощью ручной дозатор. Для оценки пульсирующего LH gonadectomized мышей, серийный образцы, собранные каждые 5-6 мин на 90-180 мин важно, сбор крови и измерение надежные импульсов LH может быть достигнуто в awake, свободно себя мышей, учитывая адекватной обработки Акклиматизация и усилия для сведения к минимуму экологических стрессоров. Достаточные акклиматизация может быть достигнуто в течение 4-5 недель до сбора крови. Этот протокол освещаются успехи в методологии для обеспечения сбора образцов цельной крови для оценки пульсирующего шаблонов секреции ЛГ через несколько часов в мышь, мощный животной модели нейроэндокринной исследований.

Введение

Гонада функция млекопитающих зависит от секреции гонадотропина, лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона, от гипофиза. Гонадотропинов выделяется в либо пульсирующего или защитному шаблон в ответ на гипоталамические секрецию гонадолиберин (GnRH). Синтез и секрецию ЛГ и ФСГ, регулируются через эндокринной и паракринными Аутокринный действий из различных молекул, включая гипоталамуса ГнРГ, половых стероидных гормонов и activin ингибин follistatin системы, а также множество физиологические условия, включая стресс и энергетического баланса. ²

Пульсирующего шаблон ЛГ в крови возникает из довольно резкий сброс LH в периферической крови, следуют примерно экспоненциального ликвидации. Важные особенности структуры включают частоту каждого разряда LH и амплитуда LH ответ, оба из которых диктуются, в частности, освобождение ГнРГ. должное трудности в сборе гипоталамо гипофизарной портала крови для измерения пульсирующего ГнРГ, отбора проб и измерения LH используется в качестве прокси для регулирования GnRH гипоталамо гипофизарно гонадной оси. Таким образом критический информация кодируется в частоты и амплитуды импульсов ЛГ, которые не могут быть определены от одного образца.

Анализ пульсирующего секреции ЛГ исторически была ограничена крупных млекопитающих (людей, приматов и овцы) из-за их объем большой крови и терпимости для сбора образцов частые крови. В грызунов частые крови была ограничена крыса и через обретение предсердий катетер. ^{3 , 4} относительно низкая стоимость и доступность генетических (например cre-lox, ТРИФОСФАТЫ) и сложные нейронные цепи (например Оптогенетика, chemogenetics) манипуляций сделать мышей организма привлекательная модель; Однако достижение частые крови и последующего анализа концентрации ЛГ до недавно, оказалась недостижимой. Эта монументальная задача был впервые предложен Стейн и коллег. ¹ с, то, несколько лабораторий начали использовать частые крови и ультра-чувствительных LH анализов для оценки пульсирующего секреции ЛГ в различных экспериментальных парадигм. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} следует отметить, что преследование практический метод сбора несколько образцов крови от мышей в прогресс для по крайней мере 40 лет¹⁰ с несколько уточнений, сделанные по пути. ^{11 , 12}

Оценки структур пульс LH (т.е. частота и амплитуда) представляет основных изысканности в мониторинг базальной гонадотропин секреции в этой генетически шансов справиться с возникающими животной модели. Традиционно концентрации ЛГ в мышей были определены в образце одной крови. Один слабость точечные пробы является очень переменный набор данных, потому что концентрация LH естественно колеблются во время каждого импульса. Еще одним недостатком является, что изолированных измерений изначально пропустить важную информацию, переданное моделей пульс секрецию ЛГ. Таким образом метод для сбора образцов частые крови в свободно себя, безудержной мышей (за исключением Деликатное обращение во время отбора проб) предоставлять более полную информацию и окажется полезным для многих лаборатории изучения пульсирующего гормон регулирования.

Здесь мы описываем протокол для коллекции часто (каждые 6 мин) кровь образцов от бодрствования, необузданный мышей. Важно отметить, что мы включить обработку акклиматизации протокол, который позволяет для надежной и непрерывного обнаружения пульсирующего секреции ЛГ в пробах цельной крови собрали более длиной время до и после оценки острой проблемой может быть определено, Например, ответ психосоциального стресса иммобилизации и сдержанность. Эффективное assay для концентрации ЛГ пробах цельной крови была описана ранее; ¹ настоящий Протокол ориентирован на метод для сбора образцов крови для измерения пульса LH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Метод, описанный здесь согласна с национальных институтов здоровья животных ухода и использования руководящих принципов и уполномочили институциональный уход животных и использования Комитетом в университете Калифорнии, Сан-Диего.

1. акклиматизации к обработке

1. Процедуры обработки
   1. Место мыши клетки в кабинете биобезопасности. Удалите первую мышь из клетки и место на подходящей поверхности (например чистой клетке крышкой) в пределах шкафа биобезопасности.
   2. Нежно сдерживать мыши на рабочей поверхности, удерживая основание хвоста с указательный палец и большой палец одной руки. Затем твердо инсульта вентральной поверхности хвост от основания до кончика хвоста, с указательным и большим пальцем другой руки. Повторите это поглаживание 6 раз (т.е. 1 комплект) и вернуть его клетки мыши.
   3. Подождите 6 мин и повторите шаг 1.1.2.
      Примечание: В общей сложности, шаг 1.1.2 будет повторяться 4 раза за мыши (то есть 4 наборы 6 ударов), так что каждая мышь будут получать в общей сложности 24 хвост штрихов на каждый день обработки.
2. Частоты ежедневной обработки
   1. С пяти до двух недель до дня запланированной крови коллекции обрабатывайте мышей, как описано в шаге 1.1, пять дней в неделю (мышей в субботу или воскресенье до последние две недели акклиматизации не обрабатываются).
   2. Если экспериментального лечения период выборки будет включать в себя любую дополнительную обработку (например scruffing или внутрибрюшинной инъекции), акклиматизироваться мышей к этой деятельности обработки во время каждого сеанса обработки.
      Примечание: Для акклиматизации процедур инъекций, используйте притупляются иглы для выполнения инъекции Шам.
   3. В течение двух недель до дня запланированной крови коллекции обрабатывайте мышей, как описано в 1.1, семь дней в неделю.
   4. По крайней мере за две недели до дня запланированной крови коллекции, Дом мышей в парах, чтобы свести к минимуму сбои в мышей во время выборки.

2. Подготовка пробирки

1. Подготовить сверхчувствительная LH аналитического буфера в стеклянной бутылке: 0,2% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% Tween-20 в PBS [0,2 г KCl, 8 г NaCl, 1,44 г Na₂HPO₄ (безводный), 0,24 г х₂PO₄, ультрачистая вода 1 Л, рН 7,4, фильтра и автоклав] , хранить при 4° C. ¹
   Примечание: Объем сверхчувствительная LH аналитического буфера должен быть подготовлен могут рассчитываться на основе на количество образцов и от объема выборки, как указано ниже (2.2 и обсуждение)
2. Подготовка трубки для сбора крови (0,6 мл microcentrifuge трубки). Метки трубы и аликвота аналитического буфера (57 мкл буфера за тюбик; Обратите внимание, этот объем может меняться в зависимости от объема крови собранных или соотношение крови в буфер желаемого). Трубы могут быть готовым дней впереди выборки, хранить при 4 ° C.

3. крови коллекции

1. Подготовка крови коллекции материалов.
   1. Подготовка кабинета биобезопасности для использования и организовать следующие материалы в капот или на корзину поблизости: 10 мкл Пипетка (набор 3 мкл или объем коллекции желаемого крови), наконечники, отходы Бен используемые наконечники, таймер, распечатка с поголовья и образец чисел ( для заметок по вопросам отбора проб или животного) лед ведро с трубки для сбора крови, ножницы и небольшие марлевые (2 "x 2").
      Примечание: «подсчитать» функция таймер лаборатории полезна, потому что он не имеет звуковой сигнал, который может нарушить мышей
   2. Используйте постоянный маркер для обозначения хвоста каждой мыши (у основания) для оказания помощи с быстрой идентификации правильной мыши во время выборки.
2. Отсечение хвост и до крови коллекции подготовки.
   1. В 45 мин до начала сбора крови удалите первую мышь от его клетки и место на подходящей поверхности (чистой клетке крышка хорошо работает) в пределах биобезопасности кабинета.
   2. Используйте острые, стерильные ножницы для удаления 1-2 мм кончик хвоста мыши, после асептического подготовки (т.е. скраб с алкоголем и Бетадин).
      Примечание: Это может быть достигнуто спать животных с мягким сдержанности или под изофлюрановая наркозом.  Кроме того обезболивание может быть предоставлена по рекомендации местных IACUC.
   3. Осторожно погладить хвост мыши, как описано выше (1.1.2; 1-2 мазки обычно достаточно) до капли крови форм на кончике хвоста.
   4. Использование пипетки с чистой наконечником для сбора 3 мкл крови от кончика хвоста и отказаться от кончика пипетки с кровью.
   5. Перед возвращением мыши к своей клетке, убедитесь, что поток крови был остановлен. При необходимости, приложите нежное давление стерильной марлей.
   6. Повторите шаги 3.2.1 - 3.2.5 для всех мышей. Последующие крови могут быть собраны, твердо гладил хвост мыши до капли крови форм на кончике хвоста.
      Примечание: Если капельку крови не формируют после фирмы штрихов, хвост можно вонзилась с марлевый тампон, смоченный в солевой раствор. Сгустки скорее формы во время менее частой выборки (т.е. > 15 мин интервалами). После того, как сгусток очищается из Вены, выборка может продолжаться.
   7. Продолжать собирать 3 мкл крови от каждой мыши, как описано выше каждые 6 мин для приблизительно 45 минут в течение этого периода подготовки до крови. Отказаться от кончика кровь и пипетки.
3. Забор крови
   1. Соберите 3 мкл крови от кончик хвоста, как описано выше. Соблюдайте осторожность для обеспечения принятия весь 3 мкл пример в наконечник пипетки (без пузырей или загрязнение постельные принадлежности). Извлечь образец крови в Пробирной буфер в обозначенные трубку. Mix инверсии и возвращения трубки в лед.
   2. Перед возвращением мыши к своей клетке, убедитесь, что поток крови был остановлен. При необходимости, приложите нежное давление стерильной марлей.
   3. Повторите шаги 3.3.1 - 3.3.2 для каждой мыши, каждые 6 минут, в течение заданной выборки. Контролировать каждое животное для признаки бедствия (например частично закрытые веки, сгорбленная позиции [не вызваны другими лечения] или отсутствие реакции на обращения) и прекратить выборки, в случае необходимости.
      Примечание: Поведенческие расстройства или других осложнений, которые требуют прекращения выборки происходят крайне редко в нашей лаборатории.
   4. Если животных не являются умерщвлены после забора крови, убедитесь, что поток крови из кончик хвоста полностью остановился. Стереть любой пролитой крови от внутри каждого животного клетка (или изменения клеток) и вернуть животных клеток в стойку корпус.

4. образец обработки и анализа

1. Хранить образцы крови при-20 ° C до анализа.
   Примечание: LH assayed в пробах цельной крови разбавляют в Пробирной буфера; до хранения или анализа требуется не разделение сыворотки или плазмы.
2. Образцов крови, сверхчувствительная ELISA, как описано ранее значения¹ и доклад в нг/мл цельной крови после коррекции для разбавления образца тома в assay buffer.
3. Определите ЛГ импульсов в наборе данных. Вычисления и сравнения амплитуды импульса среднего и частота пульса (или интервал между пульс) в зависимости от набора данных.
   Примечание: Опубликованных критериев^13,14 и программы для обнаружения LH импульсов^15,16 доступны.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Представитель LH пульс модели от 4 мыши приведены в Рисунок 1 (перепечатано из Ян et al., 2017 данных). LH была измерена в частые крови для определения реакции на вызов острый психологический стресс. Взрослых самок мышей C57/Bl6 были ovariectomized и обрабатываются к?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы описываем протокол для частых крови коллекции образцов цельной крови кончик хвоста для оценки пульсирующего секреции ЛГ у мышей. Этот протокол позволяет сбор проб для выявления острых изменений в пульсирующего секреции ЛГ, после воздействия психосоциального стресса и хорошо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosaftey cabinet	Lab Products Inc	L/F-B
Bovine serum albumin	Sigma	A5403
Tween-20	Sigma	P2287
KCl	Sigma	P9333
NaCl	Sigma	S7653
Na2HPO4 (anhydrous)	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P5655
Ultrapure water	Millipore		Purified and filtered water
Broome Rodent Restraint Device	Harvard Apparatus	52-0460	Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.
DynPeak	n/a	n/a	http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001