Memeli hücre kültür Tekdüzen toplamları üretmek için O şeklindeki damarlarının sallayarak bir Orbital

Özet

Burada yörünge sallayarak ile hücresel toplamları kültürleri süspansiyon için özel gemiler, O şeklinde kullanmak için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çantanın içinde yetiştirilen HEK293 hücreleri daha fazla form bu geleneksel kültür damarlarının yetiştirilen daha homojen toplamları.

Özet

Memeli hücre toplamları kültürleri süspansiyon tıbbi ve biyoteknolojik alanlarında çeşitli uygulamalar için gereklidir. Tek kullanımlık poşet tabanlı yöntemi bir hücresel toplamları seri üretim için basit teknikleri, ancak kültür kültür gemi alt ortasına de toplanıp oluşan aşırı toplama karşı koruma sağlamaz. Bu sorunu çözmek için O şeklinde bir çanak ve ikisi de bir merkez bölgesi içeren bir O şeklinde çanta geliştirdi. Ya O şeklindeki kültür gemi yetiştirilen toplamları boyutunda belirgin bir şekilde daha düzgün daha geleneksel damarlarının yetiştirilen toplamları. Histolojik analizler bu geleneksel kültür yemekleri toplar gösterdi nekrotik çekirdek büyük olasılıkla bir zavallı oksijen kaynağı tarafından neden olduğu yer. Buna ek olarak, O şeklinde çanta, hatta geleneksel kültür yemekleri, toplamları için benzer çaplarda yetiştirilmiştir toplamları nekrotik çekirdek belli etmedi. Bu sonuçlar O şeklinde çanta çanta malzeme oksijen geçirgenliği nedeniyle toplamları için yeterli oksijen sağlar öneririz. Biz, bu nedenle, bu roman gaz geçirgen O şeklindeki kültür çanta çeşitli biyoteknolojik alanlarında gerekli olan üniforma toplamları seri üretim için uygundur öneriyoruz.

Giriş

Süspansiyon hücre kültürü bir önemli rol oynar rejeneratif tıp¹ ve Rekombinant protein üretim² hücre üretimi büyütmek ve bazen 10'dan fazla⁷ hücre kadar yüksek hücre yoğunluğu elde etmek kolaydır çünkü / mL⁵. Çin hamster Over (CHO)³ hücreleri ve insan embriyonik böbrek hücreleri 293 (HEK293)⁴ süspansiyon kültüründe yetiştirilen ve insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için süspansiyon kültür sistemlerindeki büyümüş son zamanlarda yeniden üretim terapiler^1,6,7. Süspansiyon kültürler kullanımı gelecekte artması beklenmektedir.

Süspansiyon kültür, bazı hücre hatları tek hücreler olarak büyümek değil ve bu nedenle, toplamları oluşturması gerekir. Örneğin, hPSCs süspansiyon koşullarda toplamları kurma olmadan hayatta kalamaz. Ancak, bu gereksinim için toplanan büyüme tek tip süspansiyon kültürler için zorluklar sunar. Bir zorluk süspansiyon kültür⁸verimliliğini belirler ve kültürünün erken dönemde Tekdüzen toplamları oluşumdur. Başka bir zorluk içine toplamaları besinlerin kitle Transfer'dir. Özellikle, oksijen kaynağı toplamları en büyük boyutunu sınırlar ve zavallı bir oksijen nekroz toplamları⁹ortasında neden olur. Sonuç olarak, hücre toplamları kültürleri süspansiyon daha geleneksel süspansiyon kültürleri elde etmek zordur. Yine de, süspansiyon kültürler için çok önemlidir biyomedikal ve biyoteknoloji uygulamaları.

Yörünge sallayarak damarları kültür orta karışımları fan ajitasyon olmadan elde basit süspansiyon kültür sistemleri biridir. Hücre hasarı ve farklılaşma neden olur çünkü kesme stres fan ve dinamik orta akış süspansiyon kültürünün önemli sorundur. Ajitasyon daha düşük bir makaslama stres ile elde etmek için araştırmacılar ve Sanayi yörünge sallayarak geminin sistemleri^2,10çeşitli geliştirdik.

Ancak, geleneksel kültür damarları kültürler sallayarak orbital için tasarlanmamıştır. Damarları sallayarak, orbital içinde hücre hücre inhomogeneous toplama neden "Einstein'ın çay yaprak paradoksu"¹¹, bilinen orta akış türüne göre gemilerin merkezi-dibe doğru çekilmek. Dairesel akış merkezkaç kuvveti ve kültür orta ve bir gemi arasında sürtünme nedeniyle, hücre merkezi^11,12süpürür. Buna ek olarak, geleneksel kültür çanta kitle kültürü için kare şeklinde, hangi yörünge sallayarak için uygun değildir.

Bu çalışmada, kültürler sallayarak orbital için uygun bir roman kültür çanta geliştirdik. Bu çanta yenilik hücre alt merkezi bölge toplantıda engellenir bu yüzden Merkezi bölge yok onun O şekli olmasıdır. Biz de bu gemi biyoteknolojik uygulamaları için bu çanta olasılığını göstermek için bir HEK293 kültür ile işlenmesi göstermiştir.

Protokol

1. hücre ve malzemelerin hazırlanması

1. HEK293 hücreleri bir % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 esansiyel olmayan amino asitler ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal ortamda yetiştirmek. PH 6.8 7.6 kültür ortamına ayarlayın.
2. 5-7 d için kültür sonra % 0.25 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit solüsyonu (tripsin-EDTA) hücrelerle ayırmak ve 5,000-10,000 hücreler/cm²hücreleri reseed.

2. O şeklinde bir çanta hücrelerde tohumlama

1. 1.2. adımda açıklandığı gibi hücreleri ayırmak ve onları kültür orta 2-5 mL resuspend.
2. Hücre süspansiyon bir tek hücre süspansiyon toplamak için bir hücre süzgeç aracılığıyla (40 µm) filtre.
3. Hücreleri trypan mavi boyama ve otomatik hücre sayaç tarafından saymak ve sonra hücre süspansiyon (2.0) 10⁵ hücre/mL x 20 mL hazırlamak.
4. O şeklinde çanta (Şekil 1a) giriş klempe 50 mL şırınga bir dalgıç olmadan bağlanmak.

Şekil 1: şematik görüntü ve resimleri O şeklindeki damarlarının. (a1) Bu O şeklinde bir çanta şematik bir görüntüdür. (a2) Bu O şeklinde bir çanta bir resmi vardır. (b1) Bu O şeklinde bir yemeğin şematik bir görüntüdür. (b2) Bu bir O şeklindeki yemek bir resmi vardır. O şeklinde çanta dış ve iç çapını are 90 mm ve 20 mm, anılan sıraya göre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

5. Hazırlanan hücre süspansiyon O şekilli torba içine klempe şırınga pipette.
6. İlk klempe şırınga temiz bir şırınga ile değiştirin. Temiz hava 55 mL çanta tamamen genişletmek için temiz şırınga ekleyin.
7. Giriş tüpü kelepçe ve giriş kapatın. Son olarak, kelepçe tüpünden kaldırın.
8. O şeklinde çanta hücrelerde koşullarında CO₂37 ° C ve %5 45 RPM sallayarak kuluçkaya.

3. orta değiştirmek (isteğe bağlı)

1. Hücre süspansiyon koyu bir 50 mL tüp içine aktarın.
2. Vasıl 200 x g oda sıcaklığında 2 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
3. Kültür orta 20 mL ekleyin ve hücreleri resuspend.
4. Resuspended hücreleri aşağıdaki adımları 2,4-2,7 tarafından O şeklinde çanta ekleyin.
5. O şeklinde çanta hücrelerde koşullarında CO₂37 ° C ve %5 45 RPM sallayarak kuluçkaya.

4. toplama hücreleri çantasından

1. Hücre süspansiyon koyu bir 50 mL tüp içine aktarın.
2. Torbanın içi ile tamponlanmış fosfat kalsiyum/magnezyum-ücretsiz 20 mL serum fizyolojik yıkama [PBS(-), pH 7.4 7.6 =] ve sonra çantasından kalan hücreleri toplamak için bir tüp içine içeriği drain.
3. Toplanan hücre süspansiyon için 200 x g oda sıcaklığında, 3 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
4. PBS(-) 10 mL ekleyin ve agrega yıkayın.
5. Onları vasıl 200 x g oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi ve toplamları toplamak için süpernatant Aspire edin.
6. 4 mL PBS ve tripsin 1 mL ekleyin ve 10 dakika 37 ° C'de hücreler (isteğe bağlı) sayma için ayırmak için toplamları ile kuluçkaya.

5. (isteğe bağlı) bir O şeklindeki yemek hazırlanması

Not: Şekil 1b O şeklindeki çanak şematik bir görüntü için bkz.

1. 60 mm veya 35 mm çanak alt sıcak bir bıçak ile kesmek ve iç bir tabak olarak kullanmaktadır.
2. 60 mm çanak ters 100 mm çanak ortasına koymak.
   Not: Bir rehber sayfası 60 mm çanak konumunu karar vermek için yardımcı olabilir.
3. Gerekirse, viskozite-düzeltilir cyclohexanone 60 mm çanak içeriden komissür koymak.
4. O şeklindeki çanak için birkaç gün kuru ve gama ışını veya etilen oksit gaz tarafından sterilize.

Sonuçlar

Bizim ölçümlerine göre geleneksel çanak içinde yetişen toplamları yörünge sallayarak 5 d sonra çapları farklı. Buna ek olarak, O şeklindeki kapları 5 d yetiştirilen toplamları çok daha Tekdüzen çapları vardı. O şeklindeki damarları kültürde herhangi bir küçük toplamları (Şekil 2a) içermiyor, ancak geleneksel çanak kültür küçük toplamları (50-200 µm), gösterdi. Yansıma tabanlı boyutu ölçüm göre toplam boyutu geniş bir sapma gösteren iki farklı tepeler (Şekil 2b1), geleneksel yemek kültürü gösterdi. Bu sonuç geleneksel çanak toplamları türdeş olmayan hücre kalitesine neden aynı kültür, iki farklı koşullarda büyüyen edildi ima etti. Öte yandan, toplamları tek bir tepe gösterdi O şeklindeki gemiler ve daha az sapma daha fazla olan (2b şekil2 ve 2b3), geleneksel çanak çapı böyle toplamları-ebilmek var olmak daha fazla Tekdüzen kalitesini öne.

Şekil 2: türleri Morfoloji ve çapları toplamları çeşitli damarlarının büyüdü. Bu paneller bir O şeklindeki yemek, veya (a3 ve b3) (bir) aydınlık alan görüntüleri ve (b) çubuk ya (a1 ve b1) bir geleneksel yemek, (a2 b2) yetiştirilen ve toplamları göstermek O şeklinde bir çanta. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Hematoksilen ve eozin toplam kesit boyama toplamları geleneksel çanak içinde yetişen bazı denucleated hücreleri ve nekrotik çekirdek (Şekil 3a) olduğunu göstermiştir. Ancak, O şeklindeki damarlarının yetiştirilen toplamları çürümüş herhangi bir çekirdek (Şekil 3b ve 3 c) belli etmedi. Özellikle, O şeklinde çanta içinde yetiştirilen toplamları bu geleneksel tabak büyüklüğünde henüz çürümüş herhangi bir çekirdek (Şekil 3 c) yoktu. Bu sonuçlar gaz geçirgen çanta yeterince oksijen kültürüne sağlanan önerdi.

Şekil 3: kesit toplamları çeşitli damarlarının. Kesit 12 µm kalınlığında ve donmuş numuneler hazırlanmış edildi. Bölümleri Hematoksilen ve eozin hücreleri görselleştirmek için ile lekeli. geleneksel süspansiyon kültüründe yetiştirilen (bir) hücre toplamları nekrotik çekirdek gösterdi. Hücre toplamları büyümek ya da (b) bir çanak O şeklinde ya da (c) O şeklinde bir çanta onların göbek çok az nekroz gösterdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Hücre sayımları hücreleri % 85'den fazla her araç (4a rakam) süspansiyon kültürünün 5 d için hayatta kaldığını gösterdi. Son hücre yoğunluğu yaklaşık 1.5-2.0 x 10⁶ hücre/mL yapıldı. Anlamlı bir fark olsa da, O şeklinde çanta içinde büyüme oranı daha fazla diğer gemileri (Şekil 4b) olan daha yüksek. Geleneksel yemek, O şeklindeki çanak ve 2 gün ve 5 gün arasında O şeklinde çanta hücrelerde belirli büyüme oranları 0,018, 0,025 ve 0,020 h^-1, sırasıyla idi.

Şekil 4: hücre canlılığı ve büyüme. Bu paneller (bir) hücre canlılığı ve (b) hücre yoğunluğu HEK293 hücrelerin çeşitli kültür damarlarının 2 d Kültür (2 gün) sonra göster ve 5 d Kültür (5 gün). Gösterilen değerler 3 bağımsız deney sonuçları ortalamasını temsil eder. Her deneme için değerleri olan bir otomatik hücre sayaç sayılan trypan mavi lekeli hücreleri hesaplanır. Hata çubukları standart sapma gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 1: boncuk dağıtım çeşitli sallayarak koşullarda 2 farklı yemek biçimlerde. Bu panel boncuk dağıtım sırasında çeşitli sallayarak koşullar (30, 40 ve 45 rpm) geleneksel ve O şeklinde bir tabak gösterir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Bu çalışmada gemiler O şeklinde geliştirilen ve bir HEK293 süspansiyon kültürü içinde gerçekleştirilen bir üniforma toplamları oluşumu ve genişleme için. Biz O şeklindeki gemiler (Şekil 1) tek tip toplamları gözlenen ise geleneksel kültür tabakta kültür sallayarak bir orbital toplamları, iki farklı çaplarda üretilen. Yörünge sallayarak koşullarında lekeli boncuk dağıtımını gözlem göre boncuk bir geleneksel kültür tabak merkezi-alt toplamak. Bu toplama muhtemelen toplamları çeşitli boyutlarda önde gelen hücre yoğunluğu farklılığı neden oldu. Alternatif olarak, boncuk merkezi-alt bölge (Tamamlayıcı Şekil 1) sahip olmayan O şeklindeki yemeği dağıtıldı. Bu dağıtım muhtemelen O şeklindeki damarlarının birörnek boyutlu toplamları neden olur. Başka bir — yaygın olarak kullanılan — Tekdüzen toplamları üreten yaklaşımdır microwells içinde kültür ama bu yaklaşımın bazı sorunlar gibi dışarı microwells¹³bırakarak toplamları olmadan bir kültür ortamı sağlamak vardır. O şeklindeki gemiler söz konusu olduğunda, tek tip toplamları bir basit süspansiyon kültürde üretilebilir.

Kültür sallayarak orbital memeli hücreleri için kullanılan bir popüler kültür sistemidir. Karıştırılmış tank biyoreaktör¹⁴, dalga işaret etti çanta¹⁵, gibi memeli hücrelerinin seri üretim için çeşitli kültür Yöntem vardır ve şişe döner. Yörünge sallayarak kültürler orta karıştırma için bir iç fan dahil değildir, karıştırılmış tank biyoreaktör yapar. Bu özellik, çanta dalga işaret etti ve dönen şişe benzer. Bu fan-Alerjik kültür sistemleri çarklar çevreleyen kesme kuvvetleri hücresel hasarı önlemek ve düşük kesme stres süspansiyon kültürü farkındayız. Özellikle, yörünge sallayarak kültür sistemleri kendi yüksek ölçeklenebilirlik ve düşük kesme stres nedeniyle memeli hücreleri gibi duyarlı hücrelerin seri üretim için etkilidir.

Gemiler O şeklinde yörünge sallayarak kültür toplamları oluşumunda kalan sorunu artırabilir. Kültür sistemleri sallayarak, orbital içinde yüzen hücreleri "Einstein'ın çay yaprak paradoksu"¹¹bilinen gemi, alt ve merkezi göç. Bu inhomogeneous toplama ve düzgün olmayan toplu üretim geleneksel orbital damarları sallayarak neden olabilir. Bu çalışmada, hücre konsantrasyonu dibine Merkezi-hangi Tekdüzen toplama yörünge titreyen O şeklindeki damarlarının nedeni olarak düşünülmektedir gemiler, gemiler O şeklindeki engelledi.

Histolojik analizler geleneksel çanak toplamları denucleated hücrelerin (Şekil 2a) bulunan gösterdi. Buna ek olarak, denucleated hücreleri toplamları O şeklindeki gemiler (Şekil 2b ve 2 c) içinde görünmedi. Bu denucleated hücreleri glikoz, glutamin ve oksijen⁹gibi yüzeylerde yetersizliğinden kaynaklandığını mümkündür. Boyutu ölçüm göre homojen çapları 400 µm alt toplamları O şeklindeki damarları vardı. Buna ek olarak, geleneksel bir yemek, bazı toplamları 400 µm büyük bir çap vardı ve denucleated hücreleri bu toplamları dahil. Bu sonuç O şeklindeki damarlarının homojen ölçekli toplamları oluşturma toplamları kalite kontrolünde etkili olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, aynı zamanda gaz geçirgen polietilen film ile oksijenasyonu O şeklinde çanta içinde denucleated hücrelerinin görünümü engelledi düşünülmektedir.

Bu deneyler bu O şeklindeki gemiler olasılığı Tekdüzen toplamları üretmek için basit bir sistem olarak gösterdi. Diğer kültür çanta süspansiyon kültürü için Gelişmiş¹⁵olmasına rağmen o kültür çantaları etkili yörünge sallayarak karışık alıyorum gelen kültür engelleyen kare şeklindeki. Bu çalışmada çantada yuvarlak şekil için yörünge sallayarak homojen bir boyutu olan toplamları üretmek için uygun bir roman var. Bu gemiler koşulları ve hücre içinde yığın üretim yüksek tekrarlanabilirlik denetlemek için önemli özelliğidir. Mümkün O şeklinde geminin yaygın uygulamadır. Rekombinant proteinler hücrelerden ve rejeneratif tıp için kök hücreleri ile uğraşırken üretirken kullanılabilir.

Sonuç olarak, biz bir roman O şeklinde çanta bir yörünge sallayarak kültürü ile tek tip hücre toplamları üretmek için uygun geliştirilmiştir. Çanta gibi çeşitli Biyomedikal uygulamaları için olanaklar içinde rejeneratif tıp gösterir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293	RIKEN Bio resorce centre	RCB1637
DMEM, high glucose, pyruvate	GIBCO	11995040
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	GIBCO	10437-028
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	GIBCO	11140050
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO	25200056
Dulbecco's PBS (–)	Cell Science & Technology Institute	1102P05
Cell Strainer 40µm	CORNING	352340
50 mL Syringe	TERUMO	SS-50ESZ
Shaker	AS ONE	2-1987-02
Centrifuge Tube 50 mL	AS ONE	1-3500-02
Automated cell counter	BioRad	TC20