Um Orbital agitando a cultura de células de mamíferos em vasos em forma do produzir agregados uniformes

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para a utilização dos recipientes em forma de O, especializados para culturas de suspensão de agregados celulares, com agitação orbital. As células HEK293 crescidas neste saco mais formam agregados homogêneos do que aquelas cultivadas em vasos de cultura convencional.

Resumo

Culturas de suspensão de agregados de células de mamíferos são necessárias para diversas aplicações nas áreas médicas e biotecnológicas. O método baseado em saco descartável é uma das técnicas mais simples para a produção em massa dos agregados celulares, mas ele não protege as culturas contra excesso de agregação, que ocorre quando eles se juntam na parte inferior central da embarcação cultura. Para resolver este problema, desenvolvemos um forma de O prato e um saco em forma de O, nenhum dos quais contém uma região central. Agregados, cultivados em vaso de qualquer cultura em forma de O estavam visivelmente mais uniformes no tamanho do que agregados cultivados em vasos convencionais. Análise histológica mostrou que agrega em pratos de cultura convencional contido necróticos núcleos provavelmente causados por uma alimentação pobre de oxigênio. Em contraste, agregados que foram cultivados no saco em forma de O, mesmo aqueles com diâmetros semelhantes e agregados em pratos de cultura convencional, não mostrou núcleos necróticos. Estes resultados sugerem que a forma de O saco fornece oxigênio suficiente para os agregados devido a permeabilidade do oxigênio do material saco. Portanto, propomos que este saco de romance permeável ao gás em forma de O cultura é apropriado para a produção em massa dos agregados uniformes que são necessários em várias áreas biotecnológicas.

Introdução

Cultura de células de suspensão desempenha um papel importante na produção celular para medicina regenerativa¹ e recombinante da proteína de produção² porque é fácil de crescer e atingir célula de alta densidade, às vezes até mais de 10⁷ células / mL⁵. ³ células de ovário de hamster chinês (CHO) e células renais embrionárias humanas 293 (HEK293)⁴ ter sido crescidas na cultura de suspensão, e células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) recentemente têm sido cultivadas em sistemas de cultura de suspensão para regenerativa terapias de^6,1,7. O uso de culturas de suspensão deverá aumentar no futuro.

Na cultura de suspensão, algumas linhas de célula não crescem como células únicas e devem, portanto, formar agregados. Por exemplo, hPSCs não pode sobreviver em condições de suspensão sem formar agregados. No entanto, este requisito para o crescimento agregado apresenta dificuldades para culturas de suspensão uniforme. Uma dificuldade é a formação de agregados de uniformes no início do período da cultura, que determina a eficiência da suspensão cultura⁸. Outra dificuldade é a transferência de massa de nutrientes em agregados. Em particular, o suprimento de oxigênio limita o tamanho máximo dos agregados, e um suprimento de oxigênio pobre causa necrose no centro de agregados⁹. Consequentemente, as culturas de suspensão de agregados de células são mais difíceis de obter do que as culturas convencionais de suspensão. No entanto, culturas de suspensão são cruciais para biomédicos e aplicações da biotecnologia.

Vasos de agitação orbitais são um dos sistemas mais simples de cultura suspensão que realizar misturas de meio de cultura sem a agitação do impulsor. Tensão de cisalhamento do rotor e o fluxo médio dinâmico é o grande problema da cultura de suspensão porque provoca danos de célula e diferenciação. Para atingir a agitação com uma baixa tensão de cisalhamento, indústrias e pesquisadores desenvolveram uma variedade de nave orbital tremendo sistemas^2,10.

No entanto, os navios convencionais de cultura não são projetados para orbital culturas a tremer. No orbital tremendo vasos, células gravitam centro-fundo dos vasos por um tipo de fluxo médio conhecido como o "paradoxo de folha de chá de Einstein"¹¹, que faz com que a agregação não homogênea de células. O fluxo circular, causado por uma força centrífuga e uma fricção entre o meio de cultura e um navio, varre as células para o centro de^11,12. Além disso, sacos convencionais de cultura para cultura de massa são em forma de quadrado, que não é adequado para agitação orbital.

Neste estudo, nós desenvolvemos um saco de romance de cultura apropriado para orbital culturas a tremer. A novidade deste saco é sua forma-O que não tem uma região do centro, para que as células sejam impedidas de reunião na região inferior do centro. Também demonstrámos a manipulação desses vasos com uma cultura HEK293 para demonstrar a possibilidade destes sacos para aplicações biotecnológicas.

Protocolo

1. preparação das células e dos materiais

1. Cultive as células HEK293 no meio de águia de Dulbecco modificado com um soro fetal bovino 10% (FBS) e 1% não aminoácidos essenciais. Ajuste o pH do meio de cultura para 6,8-7,6.
2. Após o cultivo de 5 a 7 d, dissociar as células com uma solução de ácido 0,25% tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA-tripsina) e propagar novamente as células em 5.000-10.000 células/cm².

2. a propagação das células em um saco em forma do

1. Dissociar as células conforme descrito na etapa 1.2 e ressuspendê-los em 2-5 mL de meio de cultura.
2. Filtre a suspensão através de um filtro de célula (40 µm) para recolher uma suspensão de célula única.
3. Contar o número de células por coloração azul trypan e contador automático de células e então prepare-se 20 mL da suspensão celular (2,0 x 10⁵ células/mL).
4. Conecte uma seringa de 50ml preso sem um êmbolo, a entrada do saco em forma de O (Figura 1a).

Figura 1: esquemáticas imagens e fotos de navios em forma de O. (a1) Esta é uma imagem esquemática de uma forma de O saco. (a2) Esta é uma foto de uma forma de O saco. (b1) Esta é uma imagem esquemática de um prato em forma de O. (b2) Esta é uma foto de um prato em forma de O. O diâmetro interior e exterior do saco em forma de O são 90 mm e 20 mm, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Pipete a suspensão celular preparado para o forma de O saco através da seringa preso.
6. Substitua a primeira seringa preso com uma seringa limpa. Adicione 55 mL de ar limpo, através da seringa limpa para expandir o saco completamente.
7. Fixar o tubo de entrada e feche a entrada. Finalmente, remova a braçadeira do tubo.
8. Incube as celulas no saco em forma de O agitando-los em 45 rpm em condições de 37 ° C e 5% de CO₂.

3. média mudança (opcional)

1. Transferi a suspensão de células para um tubo de 50 mL através da entrada.
2. -Centrifugar por 2 min a 200 x g, à temperatura ambiente e em seguida aspirar o sobrenadante.
3. Adicionar 20 mL de meio de cultura e ressuspender as células.
4. Adicione as ressuspensão de células para o saco em forma de O seguir etapas 2.4-2.7.
5. Incube as celulas no saco em forma de O agitando-los em 45 rpm em condições de 37 ° C e 5% de CO₂.

4. recolha das células do saco

1. Transferi a suspensão de células para um tubo de 50 mL através da entrada.
2. Lave o interior do saco com 20 mL de tampão fosfato cálcio/magnésio-free salina [PBS(-), pH = 7,4-7,6] e, em seguida, drenar o conteúdo para um tubo para coletar as células restantes do saco.
3. Centrifugar a suspensão de células coletadas por 3 min a 200 x g, à temperatura ambiente e em seguida, Aspire o sobrenadante.
4. Adicionar 10 mL de PBS(-) e lavar os agregados.
5. Centrifugá-los durante 3 min a 200 x g, à temperatura ambiente e em seguida, Aspire o sobrenadante para coletar os agregados.
6. Adicionar 4 mL de PBS e 1 mL de tripsina e incube-os com os agregados por 10 min a 37 ° C para dissociar as celas para contagem (opcional).

5. preparação de um prato em forma de O (opcional)

Nota: Ver Figura 1b para uma imagem esquemática do prato em forma de O.

1. Cortar o fundo de um prato de 60 mm ou 35 mm, com uma faca quente e utilizá-lo como um prato interno.
2. Coloque o prato de 60 mm de ponta-cabeça no centro de um prato de 100 mm.
   Nota: Uma folha de guia pode ajudar a decidir a posição do prato 60 mm.
3. Se necessário, ponha ciclohexanona viscosidade-ajustada a comissura de dentro do prato de 60 mm.
4. Secar o prato em forma de O por alguns dias e sterilize por raios gama ou etileno gás de óxido.

Resultados

De acordo com nossas medições, agregados, crescidos no prato convencional variaram diâmetros após 5 d de agitação orbital. Em contraste, agregados, cultivados em vasos em forma de O para 5D tinham muito mais diâmetros uniformes. A cultura de prato convencional mostrou pequenos agregados (50-200 µm), Considerando que as culturas nos vasos em forma de O não continha qualquer pequenos agregados (Figura 2a). De acordo com a medição do tamanho baseada em imagem, a cultura de prato convencional mostrou dois picos diferentes (Figura 2b1), indicando um grande desvio de tamanho de agregação. Este resultado implícito que agregados no prato convencional foram crescendo sob duas condições diferentes na cultura do mesma, que poderia resultar em qualidade de celular heterogênea. Por outro lado, agregados em vasos em forma de O mostrou um pico único e menos desvio em diâmetro do que aqueles no prato convencional (Figura 2b2 e 2b3), sugerindo que tais agregados de qualidade mais uniforme.

Figura 2: morfologias e diâmetros dos agregados cultivados em várias embarcações. Estes painéis mostram imagens (um) brightfield e (b) histogramas dos agregados cultivadas em ou (a1 e b1) um convencional prato, (a2 e b2), uma forma de O prato, ou (a3 e b3) um forma de O saco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Hematoxilina e eosina coloração de seções cruzadas agregadas revelou que agregados crescidos no prato convencional algumas células denucleated e núcleos necróticos (Figura 3a). No entanto, agregados, cultivados em vasos em forma de O não mostrou qualquer núcleos necróticos (Figura 3b e 3C). Em particular, agregados, crescidos no saco em forma de O eram tão grandes quanto aqueles no prato convencional ainda não tinha qualquer núcleos necróticos (Figura 3C). Estes resultados sugeriram que o saco permeável ao gás fornecido oxigênio suficiente para a cultura.

Figura 3: cortes transversais de agregados em várias embarcações. As secções transversais são 12 µm de espessura e foram preparados a partir de amostras congeladas. As seções foram coradas com hematoxilina e eosina, para visualizar as células. (um) a célula agregados crescidos em uma cultura de suspensão convencional mostraram núcleos necróticos. Agregados de células cultivados em (b) uma forma de O prato ou (c) um forma de O saco mostraram necrose muito pouco em seus núcleos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Contagem de células mostrou que mais de 85% das células sobreviveram para 5D da cultura de suspensão em cada navio (figura 4a). A densidade de célula final foi de aproximadamente 1,5-2,0 x 10⁶ células/mL. Embora não houve diferença significativa, a taxa de crescimento no saco em forma de O foi maior do que aqueles em outros vasos (figura 4b). As taxas específicas de crescimento das células o prato convencional, o forma de O prato e o forma de O saco entre dia 2 e dia 5 foram 0,018 0,025 e 0,020 h^-1, respectivamente.

Figura 4: viabilidade e crescimento celular. Estes painéis mostram a (uma) célula viabilidade e (b) célula densidade de células HEK293 em vários vasos de cultura após 2 d da cultura (dia 2) e 5 d da cultura (dia 5). Os valores mostrados representam a média dos resultados de 3 experimentos independentes. Os valores para cada experimento foram calculados de células manchadas de azul de trypan contadas com um contador automático de células. As barras de erro indicam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar Figura 1: distribuição em 2 formatos diferentes de prato em diferentes condições de agitação de esferas. Este painel mostra a distribuição de grânulo durante várias condições de agitação (30, 40 e 45 rpm) em um convencional e O em forma de prato. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Neste estudo, nós desenvolvemos O em forma de vasos e realizada uma cultura de suspensão HEK293 neles para uma formação de agregados de uniforme e expansão. A placa de cultura convencional, um orbital tremendo cultura produziu dois diâmetros diferentes de agregados, Considerando que observamos agregados uniformes nos vasos em forma de O (Figura 1). De acordo com a observação da distribuição dos grânulos corados nas condições de agitação orbitais, grânulos reúnem-se em baixo o centro de um prato de cultura convencional. Esse encontro presumivelmente causado a diferença na densidade celular, levando a vários tamanhos de agregados. Alternativamente, grânulos foram distribuídos no prato em forma de O que não tem a região centro-inferior (Supplemental Figura 1). Esta distribuição provavelmente faz com que os agregados de tamanho uniformemente em vasos em forma de O. Outro — amplamente utilizado — abordagem para produzir agregados uniformes é o cultivo em poços da microplaca, mas esta abordagem tem alguns problemas, tais como em fornecer um meio de cultura sem agregados caindo fora os micropoços¹³. No caso de O em forma de vasos, agregados uniformes podem ser produzidos em uma cultura de suspensão simples.

A orbital agitando a cultura é um sistema de cultura popular utilizado para células de mamíferos. Existem vários métodos de cultura para a produção em massa de células de mamíferos, tais como o tanque mexido biorreator¹⁴, onda-acenou sacos¹⁵e garrafas de giro. Culturas de agitação orbitais não incluem um rotor interno para agitar o meio, ao contrário do tanque mexido biorreator não. Esta funcionalidade é semelhante à onda-acenou sacos e garrafas rotativas. Estes sistemas de cultura livre de rotor podem evitar danos celulares da força de cisalhamento em torno os impulsores e perceber a baixa tensão de cisalhamento na cultura de suspensão. Especialmente, agitação orbital sistemas de cultura são eficazes para a produção em massa de células sensíveis, tais como células de mamíferos devido à sua alta escalabilidade e baixa tensão de cisalhamento.

O em forma de vasos podem melhorar o problema remanescente da cultura de agitação orbital na formação de agregados. No orbital sistemas de cultura a tremer, flutuantes células migram para o centro e o fundo do navio, que é conhecido como o "paradoxo de folha de chá de Einstein"¹¹. Esta migração faz com que a agregação não homogênea e não-uniforme produção agregada em orbital convencional tremer os navios. Neste estudo, vasos em forma de O evitar a concentração de células no centro-fundo dos vasos, que especula-se como a razão de agregação uniforme em orbital agitando O em forma de vasos.

Análise histológica mostrou que os agregados no prato convencional denucleated células (Figura 2a). Em contraste, as células denucleated não apareceu nos agregados de vasos em forma de O (Figura 2b e 2C). É possível que estas células denucleated foram causadas por uma escassez de substratos tais como glicose, glutamina e oxigênio⁹. De acordo com a medição do tamanho, agregados nos vasos em forma de O tinham homogêneos diâmetros inferiores a 400 µm. Em contraste, em um prato convencional, alguns agregados tinham um diâmetro superior a 400 µm, e estes agregados incluíam denucleated células. Este resultado sugere que a criação de agregados de tamanho homogêneo em vasos em forma de O é eficaz no controle de qualidade dos agregados. Além disso, também é especulado que a oxigenação através do filme de polietileno gás-permeável impedido o aparecimento de células denucleated no saco em forma de O.

Estes experimentos mostraram a possibilidade destes vasos em forma de O como um sistema simples para a produção de agregados de uniformes. Embora outros sacos de cultura para cultura de suspensão foram desenvolvidos¹⁵, os sacos de cultura são em forma de quadrado, que impede que a cultura de meter-se efetivamente em agitação orbital. O saco neste estudo tem um romance ronda forma apropriada para agitação orbital para produzir agregados com um tamanho homogêneo. Essa característica dos vasos é importante para controlar as condições e a grande reprodutibilidade das células na produção em massa. A possível aplicação da embarcação em forma de O é generalizada. Ele pode ser usado quando a produção de proteínas recombinantes de células e para a medicina regenerativa ao lidar com células-tronco.

Em conclusão, nós desenvolvemos um romance em forma de O saco apropriado para a produção de agregados de células uniforme com uma cultura de agitação orbital. A bolsa mostra possibilidades para várias aplicações biomédicas, tais como na medicina regenerativa.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293	RIKEN Bio resorce centre	RCB1637
DMEM, high glucose, pyruvate	GIBCO	11995040
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	GIBCO	10437-028
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	GIBCO	11140050
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO	25200056
Dulbecco's PBS (–)	Cell Science & Technology Institute	1102P05
Cell Strainer 40µm	CORNING	352340
50 mL Syringe	TERUMO	SS-50ESZ
Shaker	AS ONE	2-1987-02
Centrifuge Tube 50 mL	AS ONE	1-3500-02
Automated cell counter	BioRad	TC20