JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada cerrahi timpanik membran delinmesi ve otoskop görselleştirme ve davranışsal değerlendirme ile doğrulama yoluyla çoğaltılabilir iletim kaybı indüksiyonu oluşturmak için bir protokol sayılmaktadır.

Özet

İletim seli (CHL) insanlarda yaygın bir işitme bozukluğudur. Protokolün amacı kemirgenlerde CHL indüklemek için basit bir cerrahi işlem tanımlamaktır. Protokol, timpanik membran delinme ile CHL'yi göstermektedir. CHL cerrahisinin doğrulanması otoskop muayenesi ve davranışsal değerlendirme ile clap startle yanıtı ile yapıldı, hem çoğaltılabiliyor hem de güvenilir, ve işitme kaybı nın meydana geldiğini gösteren basit yöntemlerdir. Basit CHL prosedürü, işitme kaybı araştırmalarında farklı takipçiliklere karşı tekrarlanabilirliği ve esnekliği nedeniyle avantajlıdır. Cerrahi bir yaklaşımla CHL'yi indüklemenin sınırlamaları, cerrahi prosedürü gerçekleştirmek için öğrenme eğrisi ve odyolojik muayenede güven ile ilişkilidir. CHL ile işitme bozukluğu nun saptanması, işitme kaybının nöral bulgularını ve davranışsal sonuçlarını kolayca incelemenizi sağlar.

Giriş

Çocuklarda ve yetişkinlerde işitme kaybı prevalansı sırasıyla %19,51 ve %15,22'dir. Ancak, anormal işitme taraması olan tüm yenidoğanların yaklaşık %39.3'ü Hastalık Kontrol Merkezleritarafındanrapor edildiği gibi iyileştirici tedavi almazlar 3 . İşitme kaybı yaygın olarak çalışılan bir durumdur ve kemirgen normal işitme ve işitme ile ilgili bozukluklar4,5,6,7,8,9 çalışmak için sağlam bir modeldir ,10,11,12,13,14,15. İletken işitme kaybı (CHL) gibi işitme bozuklukları işitsel korteks te kısa süreli sinaptik depresyonda artışa yol açar4, hangi frekans modülasyon algılama eşikleri ile ilişkili sığ psikometrik eğimler ile sonuçlanır 5. Malleus, timpanik membran (TM) delinmesi veya kulak tıkacının cerrahi olarak çıkarılması/yer değiştirmesi ile iletken işitme kaybı modelleri kolayca kullanılır ve işitme kaybı modeli5,14 hızlı indüksiyon sağlar ,15,16,17,18. Bu protokol ve yöntemin amacı kemirgenlerde basit ve tekrarlanabilir bir CHL modeli göstermektir.

Mevcut protokol ucuzdur (tüm araçlarla birlikte 300 USD) ve farklı araştırma arayışları için kolayca değiştirilebilir. Sıçan orta kulak anatomisi ayrıntılı değerlendirmeler olmuştur19,20,21,22,23, cerrahi yaklaşımlar24, otitis medya modelleri25, 26,27 ve TM delinme rejenerasyon16,17,18,28,29,30, çalışma için ideal bir model yapma işitme kaybı. Burada, basit bir CHL indüksiyon prosedürü sıçanda alkış ürktü yanıtı ile otoskop ve davranışsal değerlendirme ile doğrulama ile açıklanmıştır, daha sonra işitme kaybı ek sekel keşfetmek için kullanılabilir. CHL işlemi TM'nin cerrahi delinmesi ile indüklenir. CHL prosedürünün doğrulanması, TM'nin yokluğunu belirlemek için otoskop görselleştirme ile gerçekleştirilir. Davranışsal değerlendirme yüksek desibel (dB) ses basıncı seviyesi (SPL) el çırpma ile gerçekleştirilir. Bu yöntem daha önce çeşitli kemirgenlerde uygulanmıştır. Bu çoğaltmak kolaydır, sağlam psikometrik farklılıklar ve nöral fizyolojik tepkiler değişiklikler üretir4,5,16,17,18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışma ve prosedürler, Hong Kong City Üniversitesi, Hong Kong Üniversitesi ve Hong Kong Özel İdari Bölgesi Sağlık Bölümü hayvan araştırma etik komiteleri tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvanlar

  1. İki aylık Sprague-Dawley (SD) sıçanları kullanın (N = 90, 200-250 g).
    NOT: Kemirgenler Hong Kong Üniversitesi akredite Laboratuvar Hayvan Birimi tarafından sağlanmıştır.
  2. Laboratuvar Hayvan Araştırma Birimi'nde sıçanları sabit 25 °C sıcaklık ve %60-70 nem altında muhafaza edin.
  3. Ev kemirgenler 12/12-h ışık / karanlık döngüleri yiyecek ve içme suyu erişimi ile, reklam libitum.
  4. CHL ameliyatından en az bir gün önce barınma ortamına acclimate kemirgenler.
  5. Ketamin ve ksilazin bir kokteyl ile kemirgen almak ve anestezik (80-100 mg /kg: 5-10 mg /kg, sırasıyla) intraperitoneal enjeksiyon yoluyla (ketamin 1.0 mL ile ketamin 0.5 mL ksylazine son konsantrasyon olarak).
    NOT: 23-25G iğneli 1 mL şırınga kullanın. 30 dk anestezi için sıçanın vücut ağırlığını n yaklaşık 100 g'lık bir ağırlıkta yaklaşık 0,2 mL enjekte edin.
  6. Ağrı hissi doğrulamak ve uygun anestezi doğrulamak için parmak çimdik gerçekleştirin. Derin parmak sıkışmasına tepki (arka ekstremitenin çekilmesi ile) yetersiz anestezi olduğunu gösterir.

2. Cerrahi kurulum

  1. Ameliyata başlamadan önce tüm ekipmanları otoklav veya sıcak cam boncuk sterilizatörde sterilize edin. Cerrahi bölgeyi %70 etanol ile temizleyin.
  2. İşleme başlamadan önce lateks eldiven ve laboratuvar önlüğü kullanın.
  3. Temiz tezgahüzerine steril bir cerrahi örtü yerleştirin(Şekil 1A).
  4. Kulak iltihabını en aza indirmek için ameliyat öncesi mikro makas ve otoskopu sterilizeedin (Şekil 1B).
  5. Mikro makas ve otoskopu steril alana yerleştirin.
  6. Kemirgeni cerrahi alana ve cerrahla aynı hizaya yerleştirin.
  7. CHL'nin cerrahi indüksiyonuna devam edin.

3. İletim işitme kaybının cerrahi indüksiyonu

  1. Kuyruk ve kemirgen başını eğilimli bir pozisyonda hizalanmış yerleştirin, cerraha en yakın baş.
  2. Sağlıklı timpanik membran sağlamak için kemirgenin sol ve sağ kulağını otoskop altında görselleştirin (Şekil 2a). CHL indüksiyonundan önce sağlıklı durumu doğrulamak için her kemirgenin hem sağ hem de sol kulağını değerlendirin.
  3. Kulak sarkaç kapmak ve dış işitsel kanal uzatmak (yani, kulak kanalı, dış işitsel meatus, burada işitsel kanal) iç karanlık ve derinlik tarafından kararmış olmasına neden. Burada işitsel kanal TM yüzeyine dik olarak yapılır.
    NOT: İşitsel konservenin şimdi doğrudan paralel olduğundan ve TM'nin mikro makas takma ekseniyle dik açı oluşturduğundan emin olun. Işıksız siyah bir tüp olarak görselleştirilecektir. Bazen işitsel kanalın kafatasının düzlemsel yüzeyine yaklaşık 15° hafif bir açıyla eğilmesi gerekir. Bu, cerrah elinin TM yüzeyine dik olmasını sağlar.
  4. İşitsel kanalın ortasındaki mikro makasları, işitsel kanalın dokusunu kesmemeye veya çentiklememeye dikkat ederek tanıtın ve belirsizlik merkezinden yaklaşık olarak yaklaşık olarak 5 mm ilerleyin ve TM'nin merkezinden yavaşça ilerleyin.
    NOT: Mikro makas uçları TM'yi deldiğinde TM delinmesi bir pop sesi ile doğrulanabilir. Haşhaş sesi videoda yaklaşık 2 dk 52 s olarak duyulabilir. Bu bir makas sesi değil; Bu bir TM delinme sesi. Analiz sonrası ölçülen gibi, "pop" yaklaşık olarak 20 dB SPL yüksek frekanslı mikrofon tarafından kaydedilen arka plan ses daha büyüktür. Bu ölçüde "pop" ses doğrulamak için gerek yoktur, otoskop görselleştirme yeterlidir. Araştırmacının her CHL prosedürü sırasında bir 'pop' sesi duyulmasını sağlama pratiği ne zaman gerekebilir.
  5. Hemen yay yüklü mikro makası açın ve tm başkanının TM'den uzak bir şekilde yer değiştirmesini sağlamak için TM'yi deldikten sonra üç kez döndürün (sadece malleus deplasmanı isteniyorsa).
  6. Mikro makası çıkarın ve görselleştirme için kemirgeni otoskopun altına yerleştirin.
    NOT: Cerrahi işlem den sonra önemli bir kanama olmaması gerektiğini belirtmek gerekir. Kemirgeni ötenazi yapın ve kanama olursa davranışsal değerlendirmeye devam etmeyin.
  7. Karşı kulakta yukarıdaki gibi devam ederek bilateral CHL'yi indükler.

4. Otoskop görselleştirme

  1. Kemirgen orta kulak görselleştirmek için küçük çaplı bir spekulum kullanarak bir otoskop ile başarılı bir CHL cerrahisi onaylayın.
  2. Otoskop altında CHL cerrahi işlem öncesi ve sonrası her kemirgen leri değerlendirin. CHL indüksiyonu sonrası normal TM(Şekil 2a)ve hasarlı TM 'nin doğrulanması(Şekil 2b).
  3. Kemirgen için ameliyat sonrası bakım
    1. Sıcak bir lamba altında ev kafesi kemirgen yerleştirin.
    2. Kemirgen sonrası CHL indüksiyonuna uyun, kemirgen hakları kendisine kadar.
    3. Bilinci kurtarmak ve iyileşme için ev kafesine kemirgen yerleştirmek için kemirgene glikoz (dekstroz/tuzlu) serum enjekte edin.
      NOT: CHL ameliyatından sonra 5 mL tuzlu su enjekte etmek için 10 mL şırıngalı 23G iğne kullanın.
    4. Kemirgeni 24 saatlik iyileşme süresi boyunca iki kez anti-bakteriyel Enrofloksasin 0.05 mg/kg ile kas içi enjekte edin.
    5. Ameliyat sonrası ağrı davranışı veya semptomları için kemirgeni düzenli olarak gözlemleyin.

5. Davranışsal değerlendirme (CHL indüksiyonunun doğrulanması) - clap startle yanıtı

  1. Korozyon CHL (otoskop onayından sonra) 24 saat ameliyat sonrası davranışsal değerlendirme clap-startle-test oluşan.
  2. CHL indüklenen sıçanı normal bir farenin yanına iki ayrı bitişik kafese yerleştirin.
  3. Kemirgenleri sessiz bir odaya yerleştirin.
  4. Kemirgenlerden yaklaşık 0,5 m uzakta durun ve birkaç kez eşit aralıklı sürelerde alkışlayın (5 alkış seçilmiş ve 1 saniye boyunca aralıklı).
    NOT: El çırpma tarafından üretilen alkış ürkme , yüksek frekanslı mikrofon tarafından kaydedilen arka plan sesinden 40 dB SPL daha büyük olarak ölçülür.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Basit CHL işlemi 90 sıçanüzerinde uygulandı ve bu gruptan 2'sinde önemli kanama lar vardı ve 2'sinde davranışsal alkış ürktültüði gibi ertesi gün işitme kaybı yoktu. Bu dört fare atıldı. Fareler komplikasyonlar nedeniyle tartışmada nedenlerle açıklandığı gibi atılmalıdır. TM delinmesi ve/veya malleus deplasmanı/çıkarılması(Şekil 2B)indükleyen chl ortaya çıkar, bu da davranışsal belirtilere neden olur (örneğin CHL - ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Sıçanda otoskop görselleştirme ve davranışsal clap startle yanıtı kullanılarak doğrulama ile CHL'nin basit bir cerrahi indüksiyonunu tanımlıyoruz. Burada fare yöntemini göstermekteyiz ve daha önce bu yöntem gerbillere ve farelere uygulanmıştır. Yöntem kolayca diğer kemirgenler için kabul edilebilir. CHL indüksiyon uyupasyon işitsel kortikal değişikliklerve psikofizik davranış bulguları4,5,16,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir mali veya olmayan çıkar çatışması beyan.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Hong Kong Araştırma Hibeler Konseyi, Erken Kariyer Programı, Proje #21201217 C. L. tarafından desteklenmiştir, proje beyin haritalama güdümlü elektrofizyoloji ile işitme ve gürültü kirliliği araştırma uygulamalarıiçin . Biz Posgrado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México Instituto de Neurobiología (UNAM), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) México FaM Manno için Lisansüstü Bursu 578458 için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Latex, polyvinyl or nitrile glovesAMMEXUse unpowdered gloves 8-mil
Micro spring scissors (see Fig. 1b)RWD Life ScienceS11035-088.0 cm total length, with 3.5mm cutting edge, or similar micro forceps. Standard tweezers with spring action will suffice
Otoscope mini 3000HEINE D-008.70.120MStandard LED otoscope will suffice
Rat or mouseJAX labsAny small rodent 
Small rodent cageTecniplast1284LNeed two cages to separate CHL rodent from hearing rodent. If rodents are in direct contact with one-another, they will startle each other. Cage dimensions 365 x 207 x 140 mm, floor area: 530 cm2/82.15 in2

Referanslar

  1. Shargorodsky, J., Curhan, S. G., Curhan, G. C., Eavey, R. Change in prevalence of hearing loss in US adolescents. The Journal of the American Medical Association. 304 (7), 772-778 (2010).
  2. Lucas, J. W., Schiller, J. S., Benson, V. Summary health statistics for U.S. adults: National health interview survey, 2001. National Center for Health Statistics. Vital and health statistics. 10 (218), 1-134 (2004).
  3. Gaffney, M., Green, D. R., Gaffney, C. Newborn hearing screening and follow-up: Aare children receiving recommended services? Public Health Reports. 125 (2), 199-207 (2010).
  4. Xu, H., Kotak, V. C., Sanes, D. H. Conductive hearing loss disrupts synaptic and spike adaptation in developing auditory cortex. The Journal of Neuroscience. 27 (35), 9417-9426 (2007).
  5. Buran, B. N., et al. A sensitive period for the impact of hearing loss on auditory perception. The Journal of Neuroscience. 34 (6), 2276-2284 (2014).
  6. Finck, A., Sofouglu, M. Auditory sensitivity of the Mongolian gerbil. The Journal of Auditory Research. 6, 313-319 (1966).
  7. Finck, A. Auditory sensitivity of the Mongolian Gerbil (Merionesunguiculatus). The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (60), 1579(1967).
  8. Finck, A., Schneck, C. D., Hartman, A. F. Jr Development of auditory function in the Mongolian gerbil. The Journal of the Acoustical Society of America. 46 (1A), 107(1969).
  9. Ryan, A. Hearing sensitivity of the Mongolian gerbil, Meriones Unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59, 1222-1226 (1976).
  10. Dallos, P., Harris, D., Ozdamar, O., Ryan, A. Behavioral, compound action potential, and single unit thresholds: relationship in normal and abnormal ears. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (1), 151-157 (1978).
  11. Kelly, J. B., Potash, M. Directional responses to sounds in young gerbils (Meriones unguiculatus. Journal of Comparative Psychology. 100 (1), 37-45 (1986).
  12. Heffner, H. E., Koay, G., Heffner, R. S. Behavioral assessment of hearing in mice--conditioned suppression. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8, Unit 8.21D (2006).
  13. Heffner, R. S., Koay, G., Heffner, H. E. Audiograms of five species of rodents: implications for the evolution of hearing and the perception of pitch. Hearing Research. 157 (1-2), 138-152 (2001).
  14. Lupo, E. J., Koka, K., Thornton, J. L., Tollin, D. J. The effects of experimentally induced conductive hearing loss on spectral and temporal aspects of sound transmission through the ear. Hearing Research. 272 (1-2), 30-41 (2011).
  15. Liberman, M. C., Liberman, L. D., Maison, S. F. Chronic conductive hearing loss leads to cochlear degeneration. PLoS One. 10 (11), e0142341(2015).
  16. Tucci, D. L., Cant, N. B., Durham, D. Conductive hearing loss results in a decrease in central auditory system activity in the young gerbil. Laryngoscope. 109, 1359-1371 (1999).
  17. Tucci, D. L., Cant, N. B., Durham, D. Effects of conductive hearing loss on gerbil central auditory system activity in silence. Hearing Research. 155, 124-132 (2001).
  18. Cook, R. D., Hung, T. Y., Miller, R. L., Smith, D. W., Tucci, D. L. Effects of conductive hearing loss on auditory nerve activity in gerbil. Hearing Research. 164, 127-137 (2002).
  19. Albuquerque, A. A., Rossato, M., Oliveira, J. A., Hyppolito, M. A. Understanding the anatomy of ears from guinea pigs and rats and its use in basic otologic research. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 75, 43-49 (2009).
  20. Li, P., Gao, K., Ding, D., Salvi, R. Characteristic anatomical structures of rat temporal bone. Journal of Otology. 10, 118-124 (2015).
  21. Judkins, R. F., Li, H. Surgical anatomy of the rat middle ear. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 117, 438-447 (1997).
  22. Hellström, S., Salén, B., Stenfors, L. E. Anatomy of the rat middle ear. A study under the dissection microscope. Acta Anatomica (Basel). 112, 346-352 (1982).
  23. Albiin, N., Hellström, S., Salén, B., Stenfors, L. E., Wirell, S. The vascular supply of the rat tympanic membrane. The Anatomical Record. 212, 17-22 (1985).
  24. Li, P., Ding, D., Gao, K., Salvi, R. Standardized surgical approaches to ear surgery in rats. Journal of Otology. 10, 72-77 (2015).
  25. Johansson, U., Hellström, S., Anniko, M. Round window membrane in serous and purulent otitis media. Structural study in the rat. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 102, 227-235 (1993).
  26. Magnuson, K., Hellström, S. Early structural changes in the rat tympanic membrane during pneumococcal otitis media. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 251, 393-398 (1994).
  27. Hellström, S., Salén, B., Stenfors, L. E. The site of initial production and transport of effusion materials in otitis media serosa. A study on rat middle ear cavity. Acta Oto-Laryngologica. 93, 435-440 (1982).
  28. Shen, Y., et al. Scaffolds for tympanic membrane regeneration in rats. Tissue Engineering Part A. 19, 657-668 (2013).
  29. Wang, A. Y., et al. Rat model of chronic tympanic membrane perforation: Ventilation tube with mitomycin C and dexamethasone. International Journal of PediatricOtorhinolaryngology. 80, 61-68 (2016).
  30. Stenfeldt, K., Johansson, C., Hellström, S. The collagen structure of the tympanic membrane: collagen types I, II, and III in the healthy tympanic membrane, during healing of a perforation, and during infection. Archives of Otolaryngology--Head & Neck Surgery. 132, 293-298 (2006).
  31. Zhao, H., et al. Temporary conductive hearing loss in early life impairs spatial memory of rats in adulthood. Brain and Behavior. 8, e01004(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 152letken i itme kaybOtoskopDavran sal clap rkme yan tKemirgenTimpanik membran delinmesiMalleus kald rma yer de i tirme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır