Einfache chirurgische Induktion von leitfähigem Hörverlust mit Verifikation mit Tooskop-Visualisierung und Verhaltens-Clap-Start-Antwort bei Ratten

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung einer reproduzierbaren leitfähigen Hörverlustinduktion mittels chirurgischer tympanischer Membranpunktion und Verifikation durch Tooskopvisualisierung und Verhaltensbeurteilung durch Klatscher-Erde vor.

Zusammenfassung

Leitfähiger Hörverlust (CHL) ist eine vorherrschende Hörbehinderung beim Menschen. Das Ziel des Protokolls ist es, ein einfaches chirurgisches Verfahren zur Induktion von CHL bei Nagetieren zu beschreiben. Das Protokoll demonstriert CHL durch tympanische Membranpunktion. Die Überprüfung der CHL-Chirurgie erfolgte durch Otoscope-Untersuchung und Verhaltensbeurteilung durch Klatsch-Erlaufreaktion, sowohl reproduzierbar als auch zuverlässig, und es sind einfache Methoden zum Nachweis von Hörverlust aufgetreten. Das einfache CHL-Verfahren ist aufgrund seiner Reproduzierbarkeit und Flexibilität gegenüber unterschiedlichen Tätigkeiten in der Hörverlustforschung von Vorteil. Die Grenzen der Induktion von CHL durch einen chirurgischen Ansatz sind mit der Lernkurve verbunden, um den chirurgischen Eingriff durchzuführen und das Vertrauen in die audiologische Untersuchung. Die Induzieren einer Hörbehinderung durch CHL ermöglicht es, die neuronalen Manifestationen und Verhaltensergebnisse von Hörverlust leicht zu studieren.

Einleitung

Die Prävalenz des Hörverlusts bei Kindern und Erwachsenen beträgt etwa 19,5%¹ bzw. 15,2%^2. Allerdings erhalten etwa 39,3 % aller Neugeborenen mit einem abnormalen Hörscreening keine Abhilfe, wie von den Centers for Disease Control³gemeldet. Hörverlust ist ein weithin untersuchter Zustand, und das Nagetier ist ein robustes Modell, um normale Hör- und Hörstörungen zu studieren^{4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15}. Hörstörungen wie leitfähiger Hörverlust (CHL) führen zu einer Zunahme der kurzfristigen synaptischen Depression im auditiven Kortex⁴, was zu flacheren psychometrischen Hängen führt, die mit Frequenzmodulationserkennungsschwellen verbunden sind. ⁵. Leitfähige Hörverlustmodelle durch chirurgische Entfernung/Verschiebung der Malleus-, Tympanopinmembranpunktion (TM) oder Ohrstöpsel sind einfach zu verwenden und ermöglichen eine schnelle Induktion des Hörverlustmodells^{5,14 ,15,16,17,18}. Ziel des vorliegenden Protokolls und verfahrens ist es, ein einfaches und reproduzierbares CHL-Modell bei Nagetieren zu demonstrieren.

Das vorliegende Protokoll ist kostengünstig (mit allen Werkzeugen 300 USD) und leicht für verschiedene Forschungszwecke darsen. Die Ratte hatte detaillierte Bewertungen der Mittelohranatomie^{19,20,21,22,23}, chirurgische Ansätze²⁴, Modelle in Otitis media^{25, 26,27} und TM Punktionsregeneration^{16,17,18,28,29,30}, so dass es ein ideales Modell zum Studieren Hörverlust. Hier wird ein einfaches CHL-Induktionsverfahren mit Überprüfung durch Otoscope und Verhaltensbeurteilung mit Klatsch-Erlaufreaktion bei Ratten beschrieben, die dann verwendet werden können, um zusätzliche Folgevon Hörverlust zu untersuchen. Das CHL-Verfahren wird durch chirurgische Punktion des TM induziert. Die Überprüfung des CHL-Verfahrens erfolgt durch Totoskopvisualisierung, um das Fehlen des TM zu bestimmen. Die Verhaltensbeurteilung erfolgt durch einen hohen Dezibel (dB) Schalldruckpegel (SPL) Handklatschen. Diese Methode wurde bereits bei einer Vielzahl von Nagetieren angewendet. Es ist einfach zu replizieren, produziert robuste psychometrische Unterschiede und Veränderungen in neuronalen physiologischen Reaktionen^4,5,16,17,18.

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Protokoll

Die vorliegende Studie und die Verfahren wurden von den Ethikkommissionen der Stadtuniversität Hongkong, der Universität Hongkong und des Gesundheitsministeriums der Sonderverwaltungsregion Hongkong genehmigt.

1. Tiere

1. Verwenden Sie Sprague-Dawley (SD) Ratten von zwei Monaten (N = 90, 200-250 g).
   HINWEIS: Nagetiere wurden von der akkreditierten Labortiereinheit der Universität Hongkong zur Verfügung gestellt.
2. Halten Sie die Ratten in der Labortierforschungseinheit unter einer konstanten Temperatur von 25 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 60-70 % auf.
3. Haus Nagetiere in 12/12-h Licht/Dunkel-Zyklen mit Zugang zu Nahrung und Trinkwasser, ad libitum.
4. Akklimatisieren Sie Nagetiere mindestens einen Tag vor der CHL-Operation an die Wohnumgebung.
5. Das Nagetier an der Scruff abholen und das Nagetier mit einem Cocktail aus Ketamin und Xylazin (80-100 mg/kg: 5-10 mg/kg) mittels intraperitonealer Injektion anbemaßen (1,0 ml Ketamin als Endkonzentration mit 0,5 ml Xylazin kombinieren).
   HINWEIS: Verwenden Sie eine Spritze mit einer 23-25G-Nadel von 1 ml. Injizieren Sie ca. 0,2 ml pro 100 g Körpergewicht der Ratte für 30 min Anästhesie.
6. Führen Sie die Zehenprise aus, um das Schmerzempfinden zu überprüfen und die richtige Anästhesie zu bestätigen. Eine Reaktion auf tiefe Zehenkneifung (durch Entzug der Hinterbeine) deutet auf eine unzureichende Anästhesie hin.

2. Chirurgische Einrichtung

1. Sterilisieren Sie alle Geräte in einem Autoklaven oder heißglasperlensterilisierer vor Beginn der Operation. Reinigen Sie den Operationsbereich mit 70% Ethanol.
2. Verwenden Sie Latexhandschuhe und Labormantel, bevor Sie mit dem Eingriff beginnen.
3. Legen Sie einen sterilen chirurgischen Vorhang auf die saubere Bank (Abbildung 1A).
4. Sterilisieren Sie Mikroscheren und ein Tooskop vor der Operation, um Ohrinfektionen zu minimieren (Abbildung 1B).
5. Die Mikroschere und das Otoscope in den sterilen Bereich legen.
6. Platzieren Sie das Nagetier im chirurgischen Bereich und in Ausrichtung mit dem Chirurgen.
7. Fahren Sie mit der chirurgischen Induktion von CHL fort.

3. Chirurgische Induktion von leitfähigem Hörverlust

1. Legen Sie den Schwanz und den Kopf des Nagers in einer anfälligen Position ausgerichtet, Kopf am nächsten an den Chirurgen.
2. Visualisieren Sie das linke und rechte Ohr des Nagetiers unter dem Tooskop, um eine gesunde tympanische Membran zu gewährleisten (Abbildung 2a). Bewerten Sie sowohl das rechte als auch das linke Ohr jedes Nagetiers, um den gesunden Zustand vor der CHL-Induktion zu überprüfen.
3. Schnappen Sie sich die Ohrhelix und verlängern Sie den äußeren Gehörgang (d.h. Gehörgang, externer Auditfleisch, hierin auditiver Kanal), um das Innere durch Tiefe verdunkelt und geschwärzt zu machen. Hier wird der Gehörgang senkrecht zur Oberfläche des TM hergestellt.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Gehörwinkel jetzt direkt parallel ist und das TM einen rechten Winkel mit der Einschubachse der Mikroschere bildet. Es wird als schwarze Röhre ohne Licht visualisiert werden. Manchmal muss der Gehörgang in einem leichten Winkel, etwa 15° zur planaren Oberfläche des Schädels geneigt werden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Hand des Chirurgen senkrecht zur Oberfläche des TM ist.
4. Führen Sie die Mikroschere in der Mitte des Gehörgangs ein, wobei Sie darauf achten, das Gewebe des Gehörgangs nicht zu überspringen oder zu nicken, und leicht vorgehen, etwa 5 mm vom Zentrum der Dunkelheit entfernt, wobei sie sanft durch die Mitte des TM nach vorne geschoben wird.
   HINWEIS: Die TM-Punktion kann durch einen Pop-Sound bestätigt werden, wenn die Mikroscherenspitzen das TM punktieren. Der Knaller ton ist im Video bei ca. 2 min 52 s zu hören. Dies ist kein Scherenklang; dies ist ein TM Punktionssound. Wie nach der Analyse gemessen, ist der "Pop" etwa 20 dB SPL größer als Hintergrundton, wie von einem Hochfrequenzmikrofon aufgezeichnet. Es besteht keine Notwendigkeit, den "Pop"-Sound in diesem Ausmaß zu überprüfen, die Otoscope-Visualisierung ist ausreichend. Der Prüfer muss möglicherweise üben, dass bei jedem CHL-Verfahren ein "Pop" gehört wird.
5. Öffnen Sie sofort die federbelastete Mikroschere und drehen Sie dreimal nach dem Punktieren des TM, um eine Verschiebung des Kopfes des Malleus weg vom TM zu gewährleisten (nur wenn eine Malleusverschiebung gewünscht ist).
6. Entfernen Sie die Mikroschere und legen Sie das Nagetier zur Visualisierung unter das Otoscope.
   HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass nach dem chirurgischen Eingriff keine signifikanten Blutungen auftreten sollten. Euthanisieren Sie das Nagetier und gehen Sie nicht zur Verhaltensbeurteilung, wenn Blutungen auftreten.
7. Induzieren Bilateral CHL durch verfahren wie oben in das gegenüberliegende Ohr.

4. Tooskop-Visualisierung

1. Bestätigen Sie eine erfolgreiche CHL-Operation mit einem Otoscope mit einem kleinen Durchmesser Spekulum, um das Nagetier-Mittelohr zu visualisieren.
2. Bewerten Sie jedes Nagetier vor und nach dem CHL-Opastungsverfahren unter dem Otoscope. Sicherstellen der Bestätigung des normalen TM (Abbildung 2a) und beschädigten TM nach CHL-Induktion (Abbildung 2b).
3. Postoperative Pflege des Nagers
   1. Legen Sie das Nagetier in den heimischen Käfig unter eine warme Lampe.
   2. Beobachten Sie die Nagetier-Induktion nach der CHL, bis das Nagetier selbst rechte.
   3. Injizieren Sie das Nagetier mit Glucose (Dextrose/Saline) Serum, um das Bewusstsein wiederzuerlangen und das Nagetier zur Genesung in den Hauskäfig zu legen.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine 23G-Nadel mit einer 10 ml Spritze, um 5 ml Kochchen nach einer CHL-Operation zu injizieren.
   4. Injizieren Sie das Nagetier über intramuskuläre mit antibakteriellem Enrofloxacin 0,05 mg/kg zweimal während der 24 h Erholungsphase.
   5. Beobachten Sie das Nagetier regelmäßig auf Schmerzverhalten oder Symptome nach der Operation.

5. Verhaltensbeurteilung (Validierung der CHL-Induktion) - Klatsch-Erlaufreaktion

1. Corroborate CHL (nach Otoscope-Bestätigung) 24 h nach der Operation mit der Verhaltensbeurteilung bestehend aus dem Klatsch-Start-Test.
2. Legen Sie die CHL-induzierte Ratte neben eine normale Ratte in zwei separate angrenzende Käfige.
3. Legen Sie die Nagetiere in einen stillen Raum.
4. Stehen Sie ca. 0,5 m von den Nagetieren entfernt und klatschen Sie mehrmals in gleichmäßigen Abstandsdauern (5 Klatschen wurden ausgewählt und über 1 Sekunde verteilt).
   ANMERKUNG: Die Klatsch-Erprob, die durch das Handklatschen erzeugt wird, gemessen bei 40 dB SPL größer als Hintergrundton, wie von einem Hochfrequenzmikrofon aufgezeichnet.

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Ergebnisse

Das einfache CHL-Verfahren wurde an 90 Ratten durchgeführt und aus dieser Gruppe 2 hatte signifikante Blutungen und 2 hatten keinen Hörverlust am nächsten Tag, wie durch Verhaltensklatsch-Erlauf beurteilt. Diese vier Ratten wurden verworfen. Ratten sollten aufgrund von Komplikationen verworfen werden, wie es in den Gründen in der Diskussion beschrieben wird. Die Induzieren von TM Punktion und/oder Malleusverschiebung/-entfernung (Abbildung 2B) löst CHL a...

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Diskussion

Wir beschreiben eine einfache chirurgische Induktion von CHL mit Verifikation mit Tooskop-Visualisierung und Verhaltens-Klatsch-Erlauf-Reaktion bei Ratten. Hier zeigen wir die Methode auf Ratte und zuvor wurde diese Methode auf Gerbils und Mäuse angewendet. Die Methode kann leicht auf andere Nagetiere übernommen werden. Die Induktion von CHL ermöglicht die Untersuchung einer subtilen Form von Hörverlust, die sich in auditiven kortikalen Veränderungen und psychophysischen Verhaltensbefunden manifestiert

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Latex, polyvinyl or nitrile gloves	AMMEX		Use unpowdered gloves 8-mil
Micro spring scissors (see Fig. 1b)	RWD Life Science	S11035-08	8.0 cm total length, with 3.5mm cutting edge, or similar micro forceps. Standard tweezers with spring action will suffice
Otoscope mini 3000	HEINE	D-008.70.120M	Standard LED otoscope will suffice
Rat or mouse	JAX labs		Any small rodent
Small rodent cage	Tecniplast	1284L	Need two cages to separate CHL rodent from hearing rodent. If rodents are in direct contact with one-another, they will startle each other. Cage dimensions 365 x 207 x 140 mm, floor area: 530 cm2/82.15 in2