JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kynurenine yolu (KP) neuroactive metabolitleri değişiklikler psikiyatrik hastalıklarda karıştığı. Bir değişmiş kynurenine yolu metabolizma vivo içinde Rodents fonksiyonel sonuçları araştıran yeni tedavi yaklaşımları aydınlatmak yardımcı olabilir. Geçerli protokol fareler bir akut kynurenine mücadelesine etkisini araştırmak için biyokimyasal ve davranışsal yaklaşımlar birleştirir.

Özet

Triptofan bozulma kynurenine yolu (KP) psikiyatrik bozukluklar karıştığı olmuştur. Özellikle, astrocyte elde edilen metaboliti kynurenic asit (KYNA), bir antagonisti her iki N-metil-d-aspartat (NMDA) ve α7 (α7nACh) nikotinik asetilkolin reseptörü, sağlık ve hastalığında bilişsel süreçlerde karıştığı olmuştur. Şizofreni hastalarının beynindeki KYNA düzeyleri yüksek olarak, bir arıza glutamatergic ve kolinerjik reseptörler nedensel bilişsel işlev bozukluğu için hastalığın psikopatoloji bir çekirdek etki alanı ile ilgili olabilir inanılıyor. KYNA şizofreni ile bireylerde pathophysiologically önemli bir rol oynayabilir. Kemirgen beyinde endojen KYNA doğrudan bioprecursor kynurenine hayvanlarla davranarak yükseltmek mümkündür ve preklinik çalışmalar sıçanlarda akut yükselmeler KYNA öğrenme ve bellek süreçlerinin etkisi olabilir göstermiştir. Geçerli protokol bu deneysel yaklaşım ayrıntılı olarak açıklar ve kan kynurenine düzeyleri ve beyin KYNA oluşumu, (yüksek performanslı sıvı kromatografi kullanarak) bir) bir biyokimyasal analiz birleştirir b) davranışsal soruşturma için test hipokampal bağımlı bağlamsal bellek (pasif kaçınma paradigma) ve c) bir değerlendirme uyku-uyanıklık davranış [telemetric kayıtları birleştirerek electroencephalogram (EEG) ve electromyogram (EMG) sinyalleri] sıçanlarda. Birlikte ele alındığında, yüksek KYNA, uyku ve biliş arasında bir ilişki okudu ve bu protokol ayrıntılı olarak kynurenine yükselme ve KYNA oluşumu içinde vivo sıçanlarda işlevi sonuçlarını anlamak için deneysel bir yaklaşım açıklar. Bu iletişim kuralı değişimleri gözden geçirmek elde edilen sonuçlar KP ve KYNA uyku ve biliş sağlık ve hastalık Birleşik Devletleri oransal önemli roller hizmet hipotez test edecek.

Giriş

KP esansiyel amino asit triptofan1yaklaşık % 95'i aşağılayıcı için sorumludur. Memeli beyninde astrocytes alınan kynurenine neuroactive küçük molekül KYNA öncelikle enzim kynurenine aminotransferaz (KAT) II2tarafından metabolize. KYNA bir antagonisti NMDA ve α7nACh reseptörleri beyin2,3,4, görür ve ayrıca aril hidrokarbon reseptör (AHR) ve G-protein de dahil olmak üzere reseptörlerinin sinyal hedefleri reseptör 35 (GPR35) birleştiğinde5 ,6. Deneysel hayvan yükselmeler KYNA beyinde bilişsel performansları bir dizi davranışsal deneyleri2,7,8,9,10 zarar gösterilmiştir . Böylece daha fazla rol astrocyte kaynaklı moleküllerin uyku Nörobiyoloji oransal destekleme KYNA bilişsel işlevler tarafından etkileyen uyku-uyanıklık davranış11, oransal olarak önemli bir rol oynar gelişmekte olan bir hipotez öneriyor ve biliş12.

Klinik olarak, yükselmeler KYNA içinde beyin omurilik sıvısı ve otopsi beyin dokusu içinde şizofreni13,14,15,16, zayıflatıcı bir psikiyatrik bozukluk ile hastalardan bulunmuştur tarafından bilişsel bozuklukları ile karakterizedir. Şizofreni hastalarında da sık sık hastalık17şiddetlendirmek uyku bozukluğu tarafından boğulmuş. Uyku ve biliş, öğrenme ve hafıza, özellikle arasında bir ilişkisi oransal KP metabolizması ve KYNA rolünün anlaşılması şizofreni ve diğer fakir bu sonuçların tedavisi için yeni tedavilerin gelişmesine neden olabilir psikiyatrik hastalıklar.

KP metabolitleri ölçümü için güvenilir ve tutarlı bir yöntem çeşitli kuruluşlardan ortaya çıkan araştırma KP biyoloji bilimsel anlayış içine entegre edilebilir sağlamak önemlidir. Halen, kynurenine fare plazma ve KYNA sıçan beyin tarafından yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ölçmek için yöntemler açıklanmaktadır. Yapar bir fluorimetric tespitinde huzurunda Zn2 +kullanın, Shibata18 ve daha yakın zamanda adapte ve bırakmak için sonrası sütun reaktifi olarak 500 mM çinko asetat ile derivatize için en iyi duruma getirilmiş tarafından geliştirilen ilk mevcut iletişim kuralı endojen, nanomolar miktarda KYNA beyin11algılama.

Mevcut protokolünde açıklandığı gibi de novo endojen KYNA üretimi teşvik için doğrudan bioprecursor kynurenine intraperitoneally enjekte edilir (IP) içinde rats. KYNA üretim derecesini belirlemek için biyokimyasal değerlendirmeler ile birlikte, bir kynurenine etkileri bağımlı hipokampal bellek (pasif kaçınma paradigma) meydan ve uyku-uyanıklık mimarisi (EEG ve EMG sinyalleri) de incelenen11. Bu teknikleri bir arada sıçanlarda kynurenine meydan vivo biyokimyasal ve fonksiyonel etkisini incelenmesi için izin verir.

Protokol

Deneysel Protokolümüze Maryland Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları için Ulusal Sağlık Enstitüleri'nın kılavuzu izledi.

Not: Yetişkin erkek Wistar rats (250-350 g) tüm deneylerde kullanılıyordu. Hayvanların ayrı tabur biyokimyasal analiz, Davranışsal deney ve uyku-uyanıklık kayıtları için kullanılmıştır. Hayvanlar bir ısı kontrollü tesis Maryland Psikiyatri Araştırma Merkezi'nde yer alan. Onlar ışıkları ile 12/12 h koyu döngüsü üzerinde zeitgeber zaman (ZT) 0 ZT 12 ışıkları tutuldu ve. Hayvanlar yiyecek ve su ad libitum erişim deneyler sırasında aldı. Tesis tam Akreditasyon laboratuvar hayvan bakımı için Amerikan Kurumu akredite.

1. mayi Kynurenine yönetim e doğru Rats

Not: Bu protokol için kynurenine ZT 0 (ışık aşama başlangıcı) verildi ve doku ZT 2 ve ZT 4 zamanlı kurs kynurenine metabolizması için belirlemek için denizden çıkarıldı. Serum enjekte hayvanlar bir denetim olarak kullanılmıştır. Örneğin, bir sıçan 500 gr ağırlığında ve istenilen doz 100 mg/kg'dır, fare kynurenine, 10 mg/mL solüsyon 5 mL enjeksiyon almanız gerekir.

  1. L-kynurenine sülfat ("kynurenine") tartmak ve 20 mL Cam şişe yerleştirin. Kynurenine buz üzerinde her zaman tutmak için emin olun.
  2. İstenen konsantrasyon ulaşmak ve pH 7,6 1 N sodyum hidroksit (NaOH) kullanarak için ayarlamak için serum ekleyin. Girdap ve kynurenine tamamen çözülmüş kadar çözüm solüsyon içeren temizleyicide.
    Uyarı: tüm öneri önlemleri NaOH işlerken izleyin.
    1. Örneğin, 10 mg/mL solüsyon elde etmek için kynurenine 200 mg tartmak ve cam şişede yerleştirin. 15 mL serum fizyolojik ve girdap ekleyin ve (5-10 s, 1/8 inç çap microtip için 20 kHz) solüsyon içeren temizleyicide erimesi. NaOH kullanarak, çözüm pH ayarlayın. Son olarak, serum 20 ml sesini ayarlamak için kullanın.
  3. Deneysel her fare tartmak ve hayvanın vücut ağırlığı ve istenilen tedavi dozu dayalı her enjeksiyon hacmi hesaplamak. Dikkatli bir şekilde hayvan ev kendi kafesinden çıkarmak, çözüm intraperitoneally enjekte ve hayvan onun kafes dönmek.

2. Kynurenine ölçümleri kullanarak yüksek performanslı sıvı kromatografi

  1. Doku koleksiyonu
    Not: Bu protokol için kynurenine ZT 0 (ışık aşama başlangıcı) verildi ve doku ZT 2 ve ZT 4 zamanlı kurs kynurenine metabolizması için belirlemek için denizden çıkarıldı. Serum enjekte hayvanlar bir denetim olarak kullanılmıştır.
    1. Hayvan ötenazi için karbon dioksit kullanın. Solunum belirtileri 1dk için kesildiği tarih var sonra ikincil ötenazi yöntemi tarafından işten çıkarma uygulayın.
    2. Bütün gövde kan toplamak için tek kullanımlık bir huni K320 μL içeren bir 15 mL tüp içine koyun-EDTA (0,5 M). Kan vücuttan tüp drenaj izin vermek. Ters Çevir'i tekrar tekrar EDTA sağlamak için tüp boyunca karıştırılır.
    3. Baş aşağı kafatası ortaya çıkarmak için orta hat üst deriyi kesme Makası kullanarak. Arkadaki kafatası ve arka kafatasından öne kesti omurilik için açılışında herhangi bir aşırı boyun kas kaldırın.
      1. Kafatası iki tarafı açık beyin ortaya çıkarmak için yavaşça çekin ve beyin forseps ile çok zarar vermemek için dikkatli bir şekilde çıkarın. Olfaktör ampuller bir tıraş bıçağı ile kaldırın ve beyin yarım aşağı orta hat kesilmiş. Forseps kullanarak, hemibrain faiz (yani, hipokampus ve korteks) bölgelere incelemek.
    4. Alüminyum folyo Kuru buz üzerinde tüm disseke beyin parçaları yerleştirin. Sonra dokuyu tamamen dondurdu, 20 mL plastik şişe aktarın ve-80 ° C'de depolayın
    5. 10 dk. süpernatant (plazma) kaldırın ve bunları-80 ° C'de saklamak önce yeni santrifüj tüpleri içine aktarmak için 300 x g , tüm gövde kan santrifüj kapasitesi
  2. Numune hazırlama
    1. Plazma: tedavi hayvanlardan toplanan
      1. Plazma ile dondurulmuş tüp çözülme (bkz. Adım 2.1 doku koleksiyonu için) ıslak buz üzerinde.
      2. Bir yeni santrifüj tüpü Ultrasaf Su (1:2 kynurenine, 1:10 KYNA için) ile örnek sulandırmak. İçin 100 μL seyreltilmiş örnek 25 μL % 6 perklorik asit ekleyin.
        Uyarı: tüm öneri önlemleri perklorik asit taşıma sırasında izleyin.
      3. Girdap tüm örnekleri, sonra santrifüj kapasitesi onları 12.000 x g 10 min için de. Bir kez bitmiş, 100 μL süpernatant ile (her tüp) kaldırmak ve kynurenine veya KYNA belirlenmesi için bir küçük 0.25 mL microcentrifuge tüp içine koyun.
    2. Beyin: tedavi hayvanlardan toplanan
      1. Tüpler (bkz. Adım 2.1 doku koleksiyonu için) donmuş beyin örnekleri ile kuru buza koyun. Tek tek her beyin örnek üzerinde kesin bir analitik denge tartın. Tüp dönün ve kuru buza koyun.
      2. Sonra tüm örneklerini tartılır, tüpler ıslak buz üzerine taşıyın. Sulandırmak her örnek 1:10 w/v Ultrasaf Su ile ve bir sonicator (5-10 s, 1/8 inç çap microtip için 20 kHz) kullanarak lunaparkçı. Örneğin, beyin dokusunun 100 mg için 900 μL ultrasaf su ekleyin.
      3. Her seyreltilmiş aliquot 100 μL örnek için yeni bir tüp ve % 25 perklorik asit 25 μL ile acidify. Girdap, sonra 12.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi.
      4. Santrifüjü sonra süpernatant ile 100 μL çıkarın ve KYNA tayini için küçük 0.25 mL microcentrifuge tüpler içine yerleştirin.
  3. HPLC kurulum ve çalıştırma
    1. 50 mM sodyum asetat mobil faz hazırlayın. 6,81 g sodyum asetat trihidrat Ultrasaf Su 1 litre içinde çözülür. PH 6.2 buzul asetik asit kullanarak için ayarlamak ve sonra vakum filtre bu temiz cam. Sodyum asetat mobil faz temiz bir 1 L cam şişe aktarın.
    2. 500 mM çinko asetat hazırlayın. O zaman vakum filtre 54.88 g çinko asetat Ultrasaf Su, 500 ml geçiyoruz. Bir temiz 500 mL Cam şişe aktarın. Ultrasaf Su ile 1 L şişe ve HPLC sınıf Asetonitril bir 500 mL şişe doldurun.
    3. Mobil faz, Ultrasaf Su ve % 100 Asetonitril içine ayrı ayrı HPLC makineden emme boru yerleştirin. Pompa ayrı ayrı mobil faz sonrası sütunu olan ve derivatization önce bir araya getiren bir peristaltik pompa ile çinko asetat çözüme.
    4. Kontrol panelinin üstünde belgili tanımlık makine kullanarak, %5 Asetonitril ve %95 0.5 mL/dak Ultrasaf Su temel ve istikrarlı basınç elde etmek 20-30 dakikadır çalıştırılmasına izin çalıştırmak için program.
    5. İstikrarlı bir temel üzerine kuran, çözüm kompozisyon % 5 Asetonitril ve % 95 sodyum asetat mobil faz olarak değiştirin. 30 dakikadır equilibrate.
    6. Floresans dedektörü lamba açmak ve ısınmak sağlar.
    7. Bu arada, aynı zamanda bir debi 0.1 mL/dak sonrası sütun pompa açmak yaklaşık 500 psi istikrarlı bir baskısı yaklaşık 20 dk sonra ulaşmak izin vermek.
    8. Standartları hazırlamak.
      1. KYNA için 1 mM hisse senedi çözüm ile başlar ve 5 standart konsantrasyonları hazırlamak için seyreltik (yani, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1 nM ve 500 pM).
        Not: Bu 200 fmoles 20 μL enjeksiyon başına 10 fmoles kadar uzanan bir standart eğri üretecektir.
      2. Kynurenine için 1 mM hisse senedi çözüm ile başlar ve 5 standart konsantrasyonları hazırlamak için seyreltik (yani, 10 mikron, 5 mikron, 2,5 μm kalınlığında, 1 mikron ve 500 nM).
        Not: Bu 200 pmoles 20 μL enjeksiyon başına 10 pmoles kadar uzanan bir standart eğri üretecektir.
    9. Örnek sıra parametrelerini kontrol etmek ve birden fazla örnekleri autoinjections için izin HPLC sistemi yazılımı kurun.
      1. "Örnek çalıştırmak" ekranında zaman, "dosya" ve "Create yeni örnek küme için" aşağı sürükleyin. Yeni pencere açıldığında, "Boş" seçin. Tek tek bütün standartları (bkz. Adım 2.3.8) veya örnekleri çalışması gereken sırayla listelenmektedir.
      2. "İşlev" sütununda standartları ve örneklere belirleyin. Standartları başlangıç ve sıra sonunda denetlesinler. Her 5 örnekleri arasında su enjekte.
      3. Her örnek için çalışma süresi 15 dk. 20 enjekte μL örnek için standartlar ve plazma hazırlık ayarla veya beyin homogenate hazırlık örnekten 30 μL alma.
      4. Kynurenine için uyarma için uyarma ve emisyon dalga boylarında (bağımlı değerlendirildi bileşik için) ayarla: 365 nm, emisyon: 480 nm ve tutma zamanı: ~ 6 dk ve KYNA için uyarma için: 344 nm, emisyon: 398 nm ve tutma zamanı: ~ 11 dk.
      5. Bir kez tüm parametrelerini ayarlamak ve makine equilibrated, sıra çalıştırın.
      6. Verileri ölçmek için "Proje göz atın" ekranına gidin. "Örnek" Ayarlar"sekmesi altında sayısal için Ayarla örnek üzerinde çift tıklatın. Tüm enjeksiyonlar listesinden tüm standartları üzerine gelin ve sağ tıklatın. Yeni pencerede, "Süreci" yı seçin, sonra "Nasıl" yanındaki "Kalibre ve Quantitate" seçmek için aþaðý açýlan menüsünü kullanın:.
      7. Tüm standartlara daha vurgulamak, sağ tıklayın ve "İnceleme" seçin. Chromatograms açtığınızda, "Entegre" ve sonra "her standart; kalibre" için üst düğmelerini kullanın Bu otomatik olarak standart eğri oluşturur.
      8. "Örnek" Ayarlar"sekmesine dönün ve örnek sette çift tıklatın. Ardından, tüm standartları vurgulayın. Süreç, ama onun yerine, "Quantitate" açılır menüsünden seçerek yukarıda tekrarlayın. Tüm örneklerini yeniden vurgulayın, sonra sağ tıklatın ve "Gözden geçirme" seçin. Chromatograms açtığınızda, "Entegre" için üst düğmelerini kullanın ve ardından "Quantitate" her örnek.
        Not: Bu her örnek önceden oluşturulmuş standart eğri dayalı konsantrasyon çıktısı.

3. pasif kaçınma paradigma

Not: Bu davranış deneyler akut kynurenine meydan okuma ile bizim biyokimyasal bulgular göre dizayn edilmiştir. Beyin KYNA bir artış en üst düzeye çıkarmak için kynurenine (100 mg/kg) ZT 0, antrenmandan önce 2 h, ZT 2'de gerçekleşen aracılı hipokampal öğrenme sınamak için pasif kaçınma paradigma olarak yönetiliyordu. Cihaz bir Giyotin kapı tarafından ayrılmış ve ses yalıtımlı bir kutu içinde kontrol 2 eşit büyüklükte bölmeleri (21,3 cm yüksekliğinde, 20,3 cm genişliğinde ve 15.9 cm derin) oluşur. Test cihazları iki bölmeleri "hafif yan" ve "karanlık yüzü" denir. Hafif yan duvarlarının açıktır ve denemeler sırasında bir ışık daha fazla aydınlatmak için bu bölümü açılır gerekir. Karanlık bölme duvarları tamamen bir karartma durumu korumak için kaplıdır.

  1. 1. gün: eğitim deneme
    1. Test önce aparatı % 70 etanol ile temizleyin.
    2. Hayvanlar test odasına getir.
    3. Yavaşça deneysel hayvan cihazları ve yakın hafif yan içine yerleştirin ve aparatı kapı ve ses yalıtımlı kutusu mandalı.
    4. İlişkili Yazılım kullanarak, deneme başlayın. Ana ekrandan, "Dosya" ve sonra "Açık oturum" açılır menüsünden seçin. Yeni pencerede doğru prosedür ve cihaz seçilir emin olun ve "Kapat" ı tıklatın. Sonra "Yapılandırma" ve sonra "Sinyaller" seçin. Yeni pencerede doğru cihazı seçin ve "Sorun"'yi tıklatın.
      Not: Yazılımın aparatı hafif tarafında açmak ve iki bölmeleri arasında Giyotin kapı açmak için bir ışık başlatacaktır. Bir Zamanlayıcı başlatılacak.
    5. Hayvan tam olarak girdiği zaman aparatı, Giyotin kapı kapanacak ve kaçınılmaz ayak şok ve karanlık yüzü (0.56 mA 1 için s) teslim edilecektir.
    6. Kayıt hayvan koyu yuvası girmeden önce geçen süreyi.
    7. Hayvan şok aldıktan sonra 30 izin s kurtarma zaman hayvan cihazları çıkarmadan önce.
    8. Ev onun kafes hayvan arkada bir yer.
    9. Sonraki hayvan ile deneme başlamadan önce aparat temiz bir ıslak havlu ve herhangi bir dışkı Pellet dispose ile silin.
    10. Bütün hayvanlar eğitim almış sonra onları hayvan tesise geri.
  2. 2. gün: deneme testi
    1. Hayvanlar eğitim deneme sonra 24 saat test odasına getir. İlk hayvan için test deneme aparatı hafif yan içine yerleştirerek, kapanış kapı ve ses geçirmez kutu bağlantıIı başlar ve.
    2. Önceki gün aynı yazılım komutlarını kullanarak test deneme başlatmak; ışık cihazları hafif yan dönecek ve iki bölmeleri arasında Giyotin kapı açılacaktır. Bir Zamanlayıcı başlatılacak.
    3. Hayvan koyu yuvası girdiğinde, Giyotin kapı kapanacak. Kayıt geçen süre.
      Not: Deneme yazılımı üzerinden en fazla 300 sonra sonlandırıldı hayvan test cihazları hafif tarafında kalırsa s.
    4. Ev onların kafes içinde yeri hayvan arka ve aparatı (3.1.9. adımda açıklandığı gibi) sonraki hayvan ile deneme başlamadan önce temiz.

4. analiz uyku

  1. Kablosuz EEG/EMG verici cerrahi implantasyon
    Not: Telemetric vericiler sterilize ve ameliyat öncesi hazırlanan gerekir.
    1. Bir tıraş bıçağı kullanarak, yavaşça kabloyu neden ortaya çıkarmak için plastik kaplama küçük uzunluğu çıkarın. Çözüm sterilize ile dolu bir 50 mL konik tüp vericileri koyun [Örneğin, Wavecide (%2.65 oxazolidin)].
      1. En az 12 h için dezenfeksiyon çözümde vericileri bırakın. Ardından, ameliyat öncesi çözüm atık bir kaba aktarın. Verici steril serum fizyolojik ile yıkayın.
    2. Ameliyat günü, bir anestezi odasında yerleştirerek önce hayvan tartın. %100 O2ile 3-%5 isoflurane neden.
    3. Başarılı bir anestezi üzerine hayvan kaldırmak ve dikkatle tıraş, arkadaki vücudun sadece biraz sol ve göğüs kafesi altındaki tıraş, üst baş ve boyun, hem de küçük bir yama saç kullanarak.
    4. Carprofen (5 mg/kg) ameliyat sonrası analjezi için subkutan yönetmek.
    5. Ameliyat sırasında hayvanın vücut ısısını korumak için hayvan altında 37 ° C'de ayarla termostatik kontrollü sıcak su ısıtma yastığını yerleştirin.
    6. Stereotaksik çerçevede, anestezik durumu korumak ve kafa dengelemek için kulak çubuklarını yerleştirmek için bir burun konisi üzerinde hayvan yer. Traş cilt temizleme bezi betadin fırçalayın ve % 70 etanol alternatif tarafından sterilize. Opthalamic merhem onları yağlamak için gözler için geçerlidir.
    7. Belgili tanımlık ilk kesme önce yeterli anestezi emin olmak için ayak-çimdik testi kullanın.
    8. Steril neşter kullanmadan, hemen arkasında gözleri boyun arkası aşağı üzerinden bir kesi olun. Kafatası ve dorsal serviks boyun kas maruz.
    9. Kafatası ortaya çıkarmak gerekirse, pamuk uçlu uygulayıcıları herhangi bir membran kaldırmak için kullanın. Mikro-bulldog kelepçeleri cilt kafatası uzak tutmak için kullanılabilir. Bulun ve bregma konumunu işaretleyin. 2 burr-delik ve metal vida 2.0 mm ön Ekle / + 1.5 mm lateral ve 7,0 mm arka /-1,5 mm bregma göre yanal. Tam 2 devrimler vidaları sıkıştırın. Gazlı bez bir parça ile maruz kafatası kapağı.
    10. Steril Cerrahi makas kullanırken, hemen altında kaburga vücut boşluğu içine bir kesi yapmak.
    11. Cerrahi sayfasında, implante olması verici seri sayısını kaydetmek emin olun.
    12. Vücut boşluğu içinde steril vericiyi yerleştirin. Tel neden hala vücut dışında olmalı.
    13. Absorbe dikiş tamamı neden belgili tanımlık kesme tek bir amaç için toplandı sağlanması kas duvar oluşturacak biçimde için kullanın.
    14. Gazlı bez başından kaldırın ve derinin hemen altında belgili tanımlık kesme yukarı kaldırın. Bir çift deri altına kadar steril hemostats--dan belgili tanımlık baş kesme yan kesi için çalıştırın. Herhangi bir yaralanma en aza indirmek için cilt üzerinde bastır.
      1. Hemostats vücut kesi görünür olduğunda, onları cerrahi makas ve dört vericisi ile hemostats yol kapmak kapsayabilir herhangi bir membran küçük. Böylece teller deri altında yatıyordu ve kafatasına kadar koşmak yavaş yavaş hemostats çizin.
    15. 2 hangi ilan-ecek var olmak bağlı kafatası belirleyin. Forseps kullanarak, tek elle ve diğer plastik kılıf sonuna hemen altında bir tel sonu kavramak. Telin üstünde bireysel döngüler sadece yapılabilir kadar çekin.
    16. Sıkı bir şekilde 3-4 x maruz tel metal vida biri etrafında sarın. Güvenli bir kez tel çözülüyor gelen önlemek ve herhangi bir ilave telden klibi için sıkıştırın. Bu ikinci kurşun ve vida ile yineleyin.
    17. Böylece onlar rahat kafatası karşı oturup her iki EEG müşteri adayları vücut boşluğu üzerinden çek.
    18. Diş çimento vidalar ve kortikal ilan, bir kap içinde maruz kafatası oluşturma kapsayacak şekilde kullanın. Diş yok çimento cilt veya kas için sopa ve hiçbir keskin kenarları oluşturulur emin olun. Diş çimento kurumasını sağlar.
      Not: Kap cilt üst üzerinde sütüre küçük olmalıdır.
    19. EMG müşteri adayları, tel ve plastik kılıf sonuna 4.1.15 adımda anlatıldığı gibi kavramak. Bireysel döngüler açıkça discernable olana tel germek.
    20. Bu çıkmaya izin vermeden önce 2-3 mm için sağ tarafında 22 G iğne boyun kas altında çalıştırın. Nonabsorbable dikiş kullanarak, tek, gevşek dikiş gömülü iğne çevresinde koyun.
    21. İçine iğne EMG tel iplik ve iğne EMG tel iplik kas altında izin dışarı çekin. Kabloyu yerinde kalır ve ekstra tel küçük kas ortaya emin olmak için dikiş sıkın.
    22. Müşteri adayının ikinci EMG, ilk kurşun aşağı yaklaşık 1 mm 4.1.20 ve 4.1.21 numaralı adımları yineleyin.
    23. Böylece onlar rahat kas karşı oturup her iki EMG müşteri adayları vücut boşluğu üzerinden çek.
    24. Nonabsorbable dikiş baş ve boyun kesi kapatmak için kullanın. Tüm ilave tel cilt vücudun altında tuck ve yara klip vücut kesi kapatmak için kullanın.
    25. Lidokain merhem hayvan postoperatif ağrı ile yardımcı olmak için her iki kesik sitelerine uygulanır.
    26. Hayvan hayvan anesteziden kurtarıldı kadar ısıtma yastığını üzerinde oturmak belgili tanımlık kafes bırakmak ev onun kafes dönün.
      Not: Hayvan kayıtları başlamadan önce 7-10 gündür kurtarmanız gerekir.
  2. EEG/EMG kaydı
    Not: Bu iletişim kuralı ' Biz serum veya kynurenine ZT 0, idare ve hayvanın uyku uyku modundan çıkarma düzenlerini 24 h için kaydedildi.
    1. Tüm uyku kayıtları nerede hayvanlar kayıt süresi için kesintiye olmayacak belirlenmiş bir odada tamamlayın.
    2. (İmplante EEG/EMG verici taşıyan) hayvan ev kafes bir alıcı biriminde yerleştirin. Bir mıknatıs kullanarak cerrahi olarak yerleştirilmiş verici açmak.
      Not: vericiyi aktif hale getirildiğinde bir ışık alıcı ünitesi üzerinde görünmelidir.
    3. EEG/EMG verileri ilişkili yazılım kullanarak kayıt kadar ayarla.
      1. "Deney" ve sonra "Create" açılır menüsünden seçin. Deneme adlandırın ve kaydedin. Sonra "Donanım" ve sonra "Düzenle MX2 yapılandırma" seçin.
      2. Yeni pencerede, deneyde kullanılan tüm vericileri seçin ve hangi alıcı pad her ile eşleştirilmiş gösterir. Hazır olduğunuzda, "Başlat Tüm sürekli" tuşuna basarak kaydı başlatın.
    4. Deneyler sona ermesi, "Dur tüm sürekli" ilişkili yazılım seçin ve mıknatıs kullanarak vericileri açmak.
    5. Kardiyak bir delik tarafından takip CO2 boğulma tarafından hayvanlara ötenazi. Verici kesik başın üst boyunca cerrahi makas ile yeniden açılması ve diş çimento ve boyun kas ücretsiz yol kesme tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın.
    6. Daha sonra vücut boşluğu açın, vericiyi bulmak ve yavaş yavaş vücuttan çıkarın.
  3. EEG/EMG Analizi
    1. İlişkili Yazılım uyku-uyanıklık verileri çözümlemek için kullanın. Programı açın ve "Yeni konumu Ekle" seçin. Yeni pencerede, skor yazılımı içine alınacak verileri seçin.
      Not: Bu deneme sırasında toplanan tüm ham dalga formu içeren yazılım içinde yeni bir dosya oluşturur.
    2. El ile uyanıklık Birleşik istenen deneyler için puan. Puanlama sonra toplam süre, nöbetleri sayısı ve çeşitli uyanıklık durumları [Hızlı göz hareketleri (REM), non - REM NREM ve uyku modundan çıkarma] ortalama ne dersin süresi gibi parametreleri analiz.
      Not: Analiz tüm kayıt üzerinde gerçekleştirilen veya belirli zaman ilgi için kısaltılmış. Burada, analiz ZT 0 ZT 2 arasındaki kayıt dönemi yapıldı.

Sonuçlar

Bir mayi kynurenine enjeksiyon beyin KYNA yükseltmek için bir yöntem olarak kullanımını doğrulamak için doku HPLC analiz gerçekleştirildi. Standart eğrileri (Şekil 1) ilişkili yazılım kullanarak ve doku örnekleri miktar için izin inşa edildi. Temsilcisi chromatograms kynurenine ve KYNA için Şekil 2' de sunulmuştur. Kynurenine 6 dk saklama teker gözlendi ve KYNA 11 dk bir tutma zaman vardı. KP dynamics gözl...

Tartışmalar

Bir güvenilir değerlendirilmesi KYNA beyin için bir periferik kynurenine yönetim sonra birleştirmek ve biyokimyasal ve fonksiyonel deneyler yorumlamak çok önemlidir. Burada, yeni kullanıcıların, plazma kynurenine ve beyin KYNA sıçan ölçmek için etkili yöntemler kurmak için izin verir ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut. Kynurenine plazma ölçüm doğru enjeksiyon doğruladı ve beyin de novo sentezinde metaboliti KYNA ölçümü onaylar. Shibata18, huzurunda tam ol...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu da çalışmanın kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 NS102209) ve bir bağış Clare E. Forbes Trust tarafından finanse edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Wistar ratsCharles River Laboratoriesadult male, 250-350 g
L-kynurenine sulfateSai Advantium
ReproSil-Pur C18 column (4 mm x 150 mm)Dr. Maisch GmbH
EZ ClipsStoelting Co.59022
Mounting materials screwsPlasticsOne00-96 X 1/16
Nonabsorbable SuturesMedRep Express699BCP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12
Absorbable SuturesEthiconJ310H4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1
Dental CementStoelting Co.51458
Drill BitStoelting Co.5145510.45 mm
NameCompanyCatalog NumberComments
Alliance HPLC system
E2695 separation moduleWaters176269503
2475 fluorescence detectorWaters186247500
post-column reagent managerWaters725000556
Lenovo computerWaters668000249
Empower softwareWaters176706100
NameCompanyCatalog NumberComments
Passive avoidance box for rat
Extra tall MDF sound attenuating cubicleMedAssociatesENV-018MDInterior: 22" (W) x 22" (H) x 16" (D)
Center channel modulator shuttle box chamberMedAssociatesENV-010MC
Stainless steel grid floor for ratMedAssociatesENV-010MB-GF
Auto guillotine doorMedAssociatesENV-010B-S
Quick disconnect shuttle grid floor harness for ratMedAssociatesENV-010MB-QD
Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panelMedAssociatesENV-221M
Sonalert module with volume control for rat chamberMedAssociatesENV-223AM
SmartCtrl 8 input/16 output packageMedAssociatesDIG-716P2
8 Channel IR control for shuttle boxesMedAssociatesENV-253C
Infrared source and dectector array stripsMedAssociatesENV-256
Tabletop interface cabinet, 120 V 60 HzMedAssociatesSG-6080C
Dual range constant current aversive stimulation moduleMedAssociatesENV-410B
Solid state grid floor scrambler moduleMedAssociatesENV-412
Dual A/B shock control moduleMedAssociatesENV-415
2' 3-Pin mini-molex extensionMedAssociatesSG-216A-2
10' Shock output cable, DB-9 M/FMedAssociatesSG-219G-10
Shuttle shock control cable 15', 6MedAssociatesSG-219SA
Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 HzMedAssociatesSG-6080D
PCI interface packageMedAssociatesDIG-700P2-R2
Shuttle box avoidance utility packageMedAssociatesSOF-700RA-7
NameCompanyCatalog NumberComments
Sleep-Wake Monitoring Equipment
Ponehmah softwareData Sciences International (DSI)PNP-P3P-610
MX2 8 Source Acquisition interfaceData Sciences International (DSI)PNM-P3P-MX204
Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bitData Sciences International (DSI)271-0112-013
Dell 19" computer monitorData Sciences International (DSI)271-0113-001
Receivers for plastic cages, 8xData Sciences International (DSI)272-6001-001
Cisco RV130 VPN routerData Sciences International (DSI)RV130
Matrix 2.0Data Sciences International (DSI)271-0119-001
Network switchData Sciences International (DSI)SG200-08P
Neuroscore softwareData Sciences International (DSI)271-0171-CFG
Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EETData Sciences International (DSI)270-0134-001

Referanslar

  1. Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
  2. Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R., Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia - From Molecules to Behavior. , 423-443 (2016).
  3. Hilmas, C., et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications. Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).
  4. Perkins, M. N., Stone, T. W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).
  5. DiNatale, B. C., et al. Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling. Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).
  6. Wang, J., et al. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).
  7. Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine. Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).
  8. Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning. Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).
  9. Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits. Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).
  10. Pocivavsek, A., et al. Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory. Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).
  11. Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats. Sleep. 40 (11), (2017).
  12. Halassa, M. M., et al. Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss. Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).
  13. Erhardt, S., et al. Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).
  14. Linderholm, K. R., et al. Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).
  15. Sathyasaikumar, K. V., et al. Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).
  16. Schwarcz, R., et al. Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).
  17. Pocivavsek, A., Rowland, L. M. Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).
  18. Shibata, K. Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).
  19. Buzsaki, G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).
  20. Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning. Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).
  21. Yamashita, M., Yamamoto, T. Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition. Brain Research. 1675, 116-126 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Davransay 138kynurenic asitkynureninetriptofanbiliuykudavrans anEEGpasif ka nmahipokampusFluorometrik HPLC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır