Birden çok kemirgen beyin aynı anda Cryosectioning

Özet

Burada, donma ve beyin dokusu birden çok hayvanlardan tek beyin işleme için zaman kazandıran bir alternatif olarak bölüm için bir protokol mevcut. Bu immünhistokimya sırasında boyama değişkenliği azaltır ve zaman cryosectioning ve görüntüleme azaltır.

Özet

Histoloji ve immünhistokimya mikroskopik anatomi görselleştirmek ve proteinlerin biyolojik doku içinde yerelleştirmek için analiz rutin yöntemleri vardır. Neuroscience, yanı sıra diğer bilimsel alanları bir bolluk, bu teknikleri kullanılır. İmmünhistokimya slayt monte doku veya serbest yüzer bölümleri üzerinde yapılabilir. Slayt monte numune hazırlama bir zaman yoğun bir süreçtir. Aşağıdaki protokol için Megabrain adında bir teknik cryosection ve mount beyin dokusu tek bir donmuş blok birden çok beyin birleştirerek 90 %'e kadar geçen süre azalır. Ayrıca, bu teknik turda büyük bir histochemical çalışma boyama arasında görülen değişkenliği azaltmak. Geçerli teknik kemirgen beyin dokusu içinde aşağı akım immunohistokimyasal analizleri kullanarak için optimize edilmiş; Ancak, cryosectioning kullanan farklı bilimsel alanlar için uygulanabilir.

Giriş

Burada, iletişim kuralı için birden çok kemirgen aynı anda aşağı akım immunohistokimyasal yordamlar için beyin cryosection için geliştirilen Megabrain dediğimiz bir roman yöntemi mevcut. Tek slaytları içeren birden fazla hayvan dokudan üretimi için bir Megabrain sağlar. Bu teknik, aynı anda 9 yetişkin fare hemisferlerin veya 5 Yetişkin tam beyin, koronal bölümleri kesmek için en iyi duruma getirilmiş. Bu nedenle, en büyük immunohistokimyasal çalışmalar veya slayt monte beyin dokusu üzerinde hayvan büyük bir kohort yapılan diğer analizler uygulanabilir bir tekniktir.

İmmünhistokimya belirli antikor protein anlamak ve kendi ifade ve hücresel değişiklikler belirli doku^1,2,3' te karakterize ilgi karşı kullanımını gerektirir. İmmünhistokimya kullanımı nörolojik araştırma, beyin⁴hücresel ve moleküler anlamada yardım diğer bilimsel disiplinler arasında yaygındır. Büyük ölçekli çalışmalar birçok hayvan ve beyin bölümleri içeren kaynak ve zaman yoğun olabilir. Bu nedenle, Megabrain gelişimi çok yönlü bir mantığı var: süresini azaltmak için montaj ve sonuç olarak daha az reaktifler kullanırken doku, boyama cryosectioning geçirdim. Ayrıca, yeteneği süreci hızlandırmaya ve aynı birden çok beyin leke yuvarlak bazı parçalar, bir sınırlama immünhistokimya³boyama arasında değişkenlik hafifletmeye yardımcı olur. Buna ek olarak, bir Megabrain kesit bireysel donmuş kemirgen beyin kesit için alternatif bir zaman tasarrufu ve doku hayvanlar veya bile tedavi grupları arasında hızlı karşılaştırma mikroskobu teknikleri tarafından sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Megabrain tekniği bütün ve hemisected beyin erkek yetişkin C57Bl6 fareler⁵, juvenil Sprague-Dawley rat ve 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) takip x ile derin transcardially edildi yetişkin Sprague-Dawley rats kullanarak optimize edilmiştir % 4 paraformaldehyde⁶tarafından. Benzer sonuçlar diğer suşları, fare ve sıçan, her iki cinsiyette ve farklı yaş içinde gerçekleştirilebilir. Bu el yazması için verileri oluşturmak için çalışma Juvenil Sprague-Dawley rat kullanılan ve Arizona Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi ve deneysel hayvanlar için bakım kılavuzu ve laboratuvar kullanım göre için bakım Hayvanlar⁷.

1. Cryoprotection derin beyin

1. Aşağıdaki başarılı transcardial perfüzyon⁶, tam beyin^6,8 hayvanlardan toplamak ve 24 h için PBS içinde %4 paraformaldehyde 25 mL şişe içine yerleştirerek sonrası düzeltme.
   Uyarı: Toksik mendil sabitleştirici Paraformaldehyde olduğunu; özenle hallederim. Paraformaldehyde onun konsantrasyon ve cilt kimyasal duman başlık içinde tanımlayan özel olarak etiketlenmiş bir atık kaba aktarın ve kimyasal güvenlik tarafından veya düzgün bertaraf kadar kabine kimyasal atık deposunda personeli eğitimli.
2. Bir duman başlık, 24 saat geçtikten sonra beyin %4 paraformaldehyde bir spatula kullanarak kaldırın. Beyin flakon (yaklaşık 24 h) altına batar kadar beyin yaklaşık 20 mL 1 x Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS) % 15 sükroz çözümün bir şişe içine aktarın.
3. Beyin flakon (yaklaşık 24-48 h) altına batar kadar bu beyin yaklaşık 20 mL % 30 sükroz çözeltisi 1 x TBS içinde bir şişe aktarın.

2. beyin donma

1. 500 mL Cam kabı Kuru buzun içinde buz kovası bir yatak üzerinde yerleştirin. İsopentane (2 metil-bütan) 300-400 mL Cam kabı dökün.
2. -45 ° C ile -50 ° c arasında ulaşmak için isopentane sıcaklığını izin Yakından izlemek ve bu sıcaklık aralığı yordamı sabit tutarak bir termometre ile korumak. Sıcaklık okuma orta alt veya yan tarafında, kabı değil müessir süre ve çözüm alınır emin olun.
3. Benchtop üzerinde kalıp katıştırma tek kullanımlık doldurun (malzeme listesini görmek) en uygun kesme sıcaklık dolu yaklaşık 1/2 (Ekim; Tablo malzemelerigörmek) bileşik. Ekim hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun. Herhangi bir hava kabarcığı çıkarıp bir spatula veya iğne ile varsa.
4. İlk beyin % 30 sükroz şişe bir spatula ile kaldırın. Bu noktada, ya da beyin bütün veya hemisect çalışma tasarımına bağlı olarak dondurmak.
   1. Hemisected beyin hemisferlerin ayırmak için doku ile temiz bir kesme yapmak için yeni bir jilet kullanın. Çalışma için gerekli değil, beyincik ve olfaktör ampuller Bu aşamada kaldırın. Beyincik çalışma için gerekli değilse, bu düz bir alan beyin ayakta kalıp içine yardım için beynin arka sonunda kesmek için önerilmektedir. Çalışma sadece doku yerelleştirilmiş bir bölgeden gelen gerektiriyorsa, bir kemirgen beyin matris bilinen koordinatlarına göre beyin engellemek için kullanılabilir.
5. Beyin sistemi adlandırma bir sayısal ver. Şekil 1' de gösterildiği gibi bir diyagram çizin. Megabrain kalıp pozisyonu 1 olarak hangi beyin donmuştun yönünü hızlı tanımlaması yardım etmek için bir boşluk bırakarak pozisyonu 2, içinde bulundukları ilk beyin numarasını yazın.
6. Künt forseps veya cımbız kullanarak, beynini pozisyonu 1 yerleştirilmesi için alın. İlk yukarı bakacak şekilde kesilecek yan beyinle gelecek şekilde yönlendirin. OKT'yi beyne uygun konumda bağımsız olarak standları kadar konumunu ayarlamak için cımbız kullanarak indirin.
7. 2.3-2.5 kalan beyin/3 – 10 pozisyonda donmuş hemisferlerin için adımları yineleyin. Beyin/hemisfer simetrik bir düzen konumlandırma kaçının.
8. Megabrain kalıp tüm 9 beyinlerinde gözden geçirin. Bir kez beyin bağımsız olarak, dik ve düzgün yönlendirilmiş OCT'de ( Şekil 2Biçinde gösterildiği gibi) ayakta duruyorlar, (üst beyin kaplıdır kadar) daha fazla OCT kalıp için ekleyin. Yine, Ekim hiçbir görünür hava kabarcıkları olduğundan emin olun.
9. Forseps forseps kısmen OCT (Şekil 3A) sular altında olmak değil sağlanması kalıp, köşesinde tutmak için kullanın. Kalıp seviyesini korumak için dikkatli olmak isopentane (-50 ° C-45 ° C) içine kalıp alt böylece alt üçüncü kalıp batık. Burada herhangi bir kabarcıklar OCT'de doku (Şekil 3B) uzakta ve yüzeye yükselmeye izin vermek için basılı tutun.
10. Sonra 30 s, alt tüm kalıp isopentane ve serbest bırakmak--dan Megabrain bırakarak forseps, içine sular altında en az 3 dakikadır (Şekil 3 c). Bu kalıp, düzeyi, tutulur, böylece beyin dik ve eşit uzaklıkta kalır emin olun (şekil 3D).
11. 3 dakika sonra beyin (Şekil 3E) isopentane üzerinden kullanımı içeren dondurulmuş, kalıp kaldırmak için forseps OCT gömülü.
12. Hemen, kalıp ve içeriğini alüminyum folyo sarma ve hayvan numaraları veya Megabrain kimliği ile etiketleyin. Donmuş Megabrain doku çözdürme önlemek için mümkün olduğunca idareli dokun.
13. Bu Megabrain şimdi-20 ° C-dondurucu transfer ve en az 24 saat boyunca saklanır.
    Not: Burada Protokolü duraklatılmış ve Megabrain-ebilmek var olmak stok cryosectioning gerçekleşir kadar donmuş.

3. Megabrain Cryostat kesit hazırlanması

1. Cryostat kabin sıcaklığı-19 ° C'ye ayarla Devam etmeden önce bu sıcaklık ulaşacağından emin olun. Kesit boyunca, kabin sıcaklığı-18 ° C ile -20 ° c arasında kalmasını sağlamak
2. Megabrain-20 ° C dondurucudan alıp cryostat yerleştirin. Ayrıca, uygun boyut boyutları ve iki ince uçlu boya fırçaları chuck cryostat yerleştirin. Megabrain ve chuck cryostat cryostat sıcaklığa gelmek en az 15 dakika bırakın.
3. Uygun şekilde etiket Megabrain kimlik numarası ve slayt numarası ile slaytlar. Bu slaytları bir slayt üzerinde daha sıcak (35-45 ° C) yatıyordu.
4. Megabrain alüminyum folyo dan paketini açmak. Dikey olarak kalıp kalıp (Şekil 4A), Ekim bloğunun kolayca kaldırılmasına olanak köşeleri kesmek için jilet kullanın.
5. İnce bir tabaka (yaklaşık 3 mm kalınlığında), Ekim chuck dağıtmak.
6. Hızlı bir şekilde, parmak ve OKT arasında en az kişiyle, chuck, istenilen yönde Megabrain yerleştirin. Büyük forseps çözdürme en aza indirmek için bu adım için de kullanılabilir. Bölüm, Megabrain bırakın başlamadan önce chuck cryostat OCT tamamen dondurmak izin vermek 15-20 dakika içinde monte edilebilir.
7. Bir kez temel katmanın, Ekim dondurdu, OCT Megabrain kenarlarına etrafında 2 mm kalın bir tabaka uygulayın ve bu chuck üzerine taraftan yakalamak izin. Bu Chuck Megabrain sağlanmasına yardımcı olur. Yine, devam etmeden önce monte Megabrain chuck cryostat OCT dondurmak izin vermek 15-20 dk içinde bırakın.
8. Bir tıraş bıçağı taraf veya alt Chuck (Şekil 4B) herhangi bir aşırı OCT kaldırmak için kullanın.

4. Cryosectioning Megabrain

1. Başlamadan önce en az 20 mL 1 x PBS içeren bir ölçek erişilebilir olduğundan emin olun.
2. Chuck, Megabrain ile cryostat (Şekil 4B) chuck kafasına içine monte getirin.
3. Cryostat istediğiniz kalınlıkta kesmek için ayarlayın. Geçerli metodoloji 50 µm bölümlerine 10 µm için optimize edilmiştir.
4. Trim OKT ve doku koleksiyonu (Şekil 4 c) için istenen beyin bölgesi ulaşmak için gerektiği gibi doku.
5. Doku toplamak, sahne alanı'nda aittir dek anti-roll plaka indirin ve tek bir bölüm almak için cryostat ne zaman hazır. Yavaş yavaş kesitli Megabrain anti-roll plakasına bağlı olmayan ve sahneden Şekil 4 ddüşmek değil dikkatli olmak anti-roll plaka kapalı kaldırın).
6. Yavaşça boya fırçaları düz cryostat sahne alanı'nda (Şekil 5A) yalan kadar Megabrain bölümüne göz önüne sermek için kullanın. (Gerekirse, OCT haddeleme önlemek için boya fırçaları kullanarak düz tutun).
7. Daha sıcak slayttan slayt kaldırmak ve slayt etiket tarafı aşağı, Megabrain bölüm bölüm slayda sopa izin sahnede üzerinde gezdirin.
8. Hızlı bir şekilde slayttaki her doku Bölüm 1 x PBS bir damla uygulamak ve bunlar onlar düz fırça kadar kurumasına izin verme (bkz. Adım 4,9).
9. Herhangi bir doku kabarcıkları dışarı fırça ve düz slayt üzerinde (5B rakam) yalan söylüyor bu yüzden doku açılmak için 1 x PBS daldırma ince uçlu fırça kullanın. Değil beyin bölümleri konumunu değiştirmek ve böylece diğer doku bölümlerine göreli konum kaybetmek için dikkat ediniz. Gözyaşları önlemek için itina ile doku işlemek. Periferik alan bir coverslip ve boyama bazı protokoller PAP kalem uygulama için gerekli olarak beyin bölümlerini slayt, kenarları uzak tutun.
10. Slayda geri slayt daha sıcak ve kuru 45 dk. doku üzerinde yerleşme toz önlemek için gerektiğinde kapak koyun. Kuru bir kez, içinde slaytları-80 ° c kadar kullanmaya devam etmenize depolama.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu yordam için olumlu bir sonuç hiçbir kabarcıklar veya gözyaşları içinde donmuş yönde düz slaytta yatıyor dokudur. Doku bölümler nedeniyle beyin OCT'de ve iyi gösterim olarak Şekil 1' deki gösterdiği iyi yerleşimini ayrı ve kolayca tanımlanabilir eşit aralıklandırılmış. Beyin dokusuna benzer yaş hayvanlardan toplanan ve doku düzgün Ekim uyumlu varsayılarak, bir slayt üzerinde toplanan bölümleri beyin bölgeleri hayvanlar ara...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Megabrain ve çevresi sıcaklığı sürekli çözdürme ve doku yeniden donma önlemek için takip gerekir Bu yordam sırasında düşünülmelidir. Beyin sadece-20 ° C dondurucudan için 3 kez olarak bu değindi 's ve daha sıcak bir dalgalanan sıcaklık, doku cryostat sol Tammy'nin ve refreezes, bir jöle gibi doku ve anormal doku bütünlüğü¹⁰neden her zaman kaldırılabilir. Bu nedenle, Megabrain tek seferde kesmek için en iyi yöntemdir.

Doku fiksasyon ve cr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065