多鼠脑的同时 Cryosectioning

摘要

在这里, 我们提出一个协议, 冻结和切片的大脑组织从多个动物作为一个玩意替代处理单一的大脑。这减少了免疫组化过程中的染色变异性, 减少了时间 cryosectioning 和成像。

摘要

组织学和免疫组化是常规的分析方法, 以可视化显微解剖和本地化蛋白质在生物组织。在神经科学, 以及其他科学领域, 这些技术被使用。免疫组化可以做在幻灯片上的组织或自由浮动部分。准备幻灯片安装的示例是一个时间密集型的过程。以下技术的协议, 称为 Megabrain, 减少了 cryosection 和安装大脑组织的时间高达 90%, 通过结合多个大脑到一个单一的冰冻块。此外, 这种技术减少了染色回合之间的变异, 在一个大的组织化学研究。在下游免疫组化分析中, 利用啮齿动物脑组织对现有技术进行了优化;然而, 它可以应用到不同的科学领域, 使用 cryosectioning。

引言

在这里, 我们提出了一种新方法的协议, 我们称之为 Megabrain, 发展为 cryosection 多鼠大脑同时为下游免疫组化程序。Megabrain 允许生产含有多种动物组织的单张幻灯片。这项技术已被优化, 以切割冠状部分从9成年大鼠半球, 或5成人全脑, 同时。因此, 该技术最适用于大型免疫组化研究或其他分析, 对从一大群动物的幻灯片安装的脑组织进行。

免疫组化涉及使用特定的抗体针对感兴趣的蛋白质, 以了解和表征其表达和细胞变化的特定组织^1,2,3。免疫组化的应用在神经科学研究中普遍存在, 在其他科学学科中, 帮助对大脑的细胞和分子的理解⁴。涉及许多动物和脑部的大规模研究可以是资源和时间密集型的。因此, Megabrain 的发展有多方面的理由: 减少花 cryosectioning、安装和染色组织的时间, 同时使用较少的试剂。此外, 在同一回合中简化过程和染色多个大脑的能力有助于缓解染色批次之间的一些变异性, 这是免疫组化³的局限性。此外, 切片 Megabrain 是一个节省时间的替代品切片单个冰冻啮齿动物的大脑, 并允许快速比较的组织之间的动物, 甚至治疗组的显微技术。

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研究方案

用1x 磷酸缓冲盐水 (PBS) 对雄性成年 C57Bl6 小鼠⁵、幼年大大鼠和成年 Megabrain 大大鼠进行了全脑和 hemisected 的优化。4% 多聚甲醛⁶。在两性和不同年龄的老鼠和老鼠的其他品系也可以取得类似的结果。为这篇手稿生成数据的研究使用了大鼠, 并获得了亚利桑那大学机构动物保育和使用委员会的批准, 并根据实验室的护理和使用指南对实验动物进行了照顾。动物⁷。

1. 抗冻脑灌注

1. 成功的 transcardial 灌注⁶, 收集完整的大脑^6,8从动物和后修复通过放置到一个25毫升瓶4% 多聚甲醛在 PBS 为 24 h。
   注意: 多聚甲醛是一种有毒的组织固定剂;小心处理。将多聚甲醛转移到一个专门标记的废物容器中, 在化学油烟机中识别其浓度和体积, 然后贮存在化学废物柜中, 直到化学安全或训练有素的人员处置为止。
2. 24小时后, 在一个油烟机, 删除大脑从4% 多聚甲醛使用铲。将大脑转移到大约20毫升的15% 蔗糖溶液中, 在1x 的三缓冲盐水 (tb), 直到大脑下沉到瓶子的底部 (约24小时)。
3. 在此之后, 将大脑转移到大约20毫升30% 蔗糖溶液的小瓶, 在 1x tb, 直到大脑下沉到瓶子的底部 (大约 24–48 h)。

2. 脑冷冻

1. 将500毫升的玻璃烧杯放在冰桶里干冰的床上。将300–400毫升的异戊烷 (2 甲基丁烷) 倒入玻璃烧杯中。
2. 允许异戊烷的温度达到摄氏-45 摄氏度和-50 摄氏度之间。用温度计密切监视和保持这个温度范围, 保持它在整个过程中的恒定。确保从溶液中间取出温度读数, 而不是触摸烧杯的底部或侧面。
3. 在台式上, 填充一个一次性嵌入模具 (见材料清单) 约1/2 充分的最佳切削温度 (OCT; 见材料表) 化合物。确保 OCT 中没有气泡。如果空气中有气泡, 用刮刀或针将其移走。
4. 将第一个大脑从30% 个蔗糖瓶中取出一把刮刀。在这一点上, 要么冻结大脑整体或 hemisect, 取决于研究设计。
   1. 对于 hemisected 的大脑, 使用新的剃刀刀片, 使一个干净的切割通过组织, 以分离的半球。如果没有必要的研究, 删除小脑和嗅觉灯泡在这个阶段。如果小脑是需要进行的研究, 建议在大脑后端切开一个平坦的区域, 以帮助大脑站立在模子里直。如果这项研究只需要一个局部区域的组织, 一个啮齿动物的大脑矩阵可以用来阻止大脑的基础上已知的坐标。
5. 给大脑一个数字命名系统。绘制图, 如图 1所示。将第一个大脑的数量写在位置2的 Megabrain 模具中, 将位置1作为空白, 以帮助快速识别大脑被冻结的方向。
6. 使用钝钳或镊子, 拿起大脑放置在位置1。将大脑与侧面切开, 首先朝向向上。将大脑放在合适的位置, 用镊子调整其位置, 直到它独立站立。
7. 重复步骤2.3–2.5 为剩余的大脑/半球被冻结的位置3–10。避免在对称布局中定位大脑/半球。
8. 检查 Megabrain 模具中的所有9个大脑。一旦大脑独立, 直立, 并正确地定位在 OCT (如图 2B所示), 添加更多的 oct 到模具 (直到大脑的顶部被覆盖)。再次, 确保 OCT 中没有可见气泡。
9. 使用镊子保持模具的角落, 确保镊子不会成为部分淹没在 OCT (图 3A)。小心保持模具水平, 降低模具进入异戊烷 (-45 °c 至 50°c), 使模具底部第三个淹没。在这里保持它, 允许任何在 OCT 的气泡上升到表面和远离组织 (图 3B)。
10. 三十年代后, 将整个模具降低到异戊烷中, 并从镊子中释放, 使 Megabrain 淹没至少3分钟 (图 3C)。确保模具保持水平, 使大脑保持直立和等距 (图 3D)。
11. 3分钟后, 使用镊子从异戊烷中取出含有冰冻的 OCT 嵌入大脑的模具 (图 3E)。
12. 立即将模具及其内容包装在铝箔上, 用动物编号或 Megabrain 标识标明。尽量少接触冷冻 Megabrain, 以免解冻组织。
13. 这个 Megabrain 现在可以转移到一个-20 °c 冰箱和存储至少24小时。
    注意: 协议可以在这里暂停, Megabrain 可以存储在 cryosectioning 发生之前冻结。

3. 准备 Megabrain 切片恒温器

1. 将恒温器的机柜温度设置为-19 摄氏度。请确保在继续之前达到此温度。贯穿切片, 确保橱柜温度保持在-18 摄氏度和-20 摄氏度之间。
2. 把 Megabrain 从-20 °c 冷藏库放进恒温器。另外, 放置一个适当尺寸尺寸的恰克, 和两个薄的倾斜画笔进入恒温器。离开 Megabrain 和恰克在恒温器至少15分钟来温度的恒温器。
3. 使用 Megabrain 标识号和幻灯片编号适当地标记幻灯片。将这些幻灯片放在较暖和的幻灯片上 (35–45°c)。
4. 从铝箔上打开 Megabrain。使用剃刀刀片垂直切割模具的角落, 让从模具容易删除的 OCT 块 (图 4A)。
5. 将 OCT 的薄层 (大约3毫米厚) 放到恰克上。
6. 快速, 在手指和 OCT 之间的最小接触, 把 Megabrain 在恰克, 在所需的方向。大钳也可用于这一步骤, 以尽量减少解冻。在开始节之前, 将 Megabrain 装入的卡盘留在恒温器中以 15–20 min, 以允许 OCT 完全冻结。
7. 一旦 OCT 的基层冻结, 在 Megabrain 的两侧应用一个2毫米厚层的 OCT, 并允许它从两侧向下运行到恰克。这有助于保护 Megabrain 到恰克。再次, 在继续之前, 离开 Megabrain 安装恰克在恒温器为15–20分钟允许 OCT 冻结。
8. 使用剃刀刀片从恰克的两侧或底部删除任何多余的 OCT (图 4B)。

4. Cryosectioning Megabrain

1. 在开始之前, 确保装有至少20毫升 1x PBS 的烧杯可以访问。
2. 将恰克安装在 Megabrain 上, 放入恒温器上的卡头 (图 4B)。
3. 将恒温器设置为在所需的厚度处剪切。目前的方法已经优化了10µm 到50µm 节。
4. 根据需要修剪 OCT 和组织以到达所需的大脑区域以进行组织收集 (图 4C)。
5. 当准备收集组织, 降低反卷板, 直到它休息在舞台上, 并打开恒温器手柄采取一个单一的部分。慢慢地抬起防卷板, 小心, 切片 Megabrain 不附着在防卷板上, 不脱落的舞台图 4D)。
6. 轻轻地使用画笔展开 Megabrain 节, 直到它在恒温器舞台上平躺 (图 5A)。(如有需要, 使用画笔来控制 OCT 平面以防止滚动)。
7. 从幻灯片中删除幻灯片, 然后将幻灯片、标签边向下悬停在舞台上的 Megabrain 节上, 允许该节粘贴到幻灯片上。
8. 快速地将一滴 1x PBS 应用于幻灯片上的每个组织部分, 并且不允许它们干燥, 直到它们被刷平 (见步骤 4.9)。
9. 使用一个细尖的画笔蘸在 1x PBS, 以刷出任何气泡在组织和展开的组织, 使它是平躺在幻灯片上 (图 5B)。注意不要改变脑部的位置, 从而失去相对位置的其他组织部分。小心操作纸巾以免流泪。将大脑部分远离幻灯片的边缘, 因为在某些染色协议中, 盖玻片和 PAP 笔应用程序需要外围空间。
10. 将幻灯片放回幻灯片上, 使其干燥45分钟, 以防灰尘在组织上沉淀。干燥后, 将幻灯片保存在-80 摄氏度, 直到进一步使用。

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结果

这个过程的一个积极的结果是, 组织是平的在幻灯片上, 没有气泡或眼泪, 在他们被冻结的方向。组织切片是均匀间隔和容易辨认, 由于良好的位置的大脑在 OCT 和良好的符号如图 1所示。假设大脑组织是从类似年龄的动物那里收集的, 并且该组织在 OCT 中正确排列, 那么在幻灯片上收集的部分应该代表一个类似的冠状平面, 允许动物之间的大脑区域进行?...

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讨论

在这一过程中应考虑到 Megabrain 及其周围环境的温度必须不断监测, 以防止组织的解冻和再冷冻。大脑只能从-20 °c 冷冻库中除去, 每次被接触和留在恒温器, 随着温度的升高, 组织解冻和 refreezes, 导致果冻像质地和异常的组织完整性¹⁰。因此, 最好同时切断 Megabrain。

组织固定和抗冻是本议定书的关键部分, 以尽量减少冰晶形成, 减少外部微生物生长, 停止酶反应...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065