Kuruluş ve tümör dilim analizini Explants tanı testleri için bir önkoşul olarak

Özet

Biz üretimi, yetiştirme ve fare akciğer tümörleri türetilmiş organotypic dilimleri sistematik analizi için bir yöntem sağlar. Biz de dilim kalınlığı için en iyi duruma getirme ve tümör dilimleri tedavisi için ilaç konsantrasyonları seçin anlatan.

Özet

Hassas kesilmiş dilimleri dahil, Organotypic birincil doku explant kültürler, üç boyutlu (3-b) doku mimarisi hem de yerel doku çok hücreli etkileşimleri temsil eder. Hemen taze rezeke tümörler kesmek dokusu dilimlerin intratumor heterojenlik, böylece onları içinde vivo biyoloji yararlı vekilleri hale kayma yönleri korumak. Dikkatli doku dilim hazırlık ve yetiştirme koşulları duruma getirilmesi esastır akıllı tanılama potansiyelini tümör için dilim explants. Bu bağlamda, fare modelleri bu tümör malzeme çoğaltılır ve tekrarlanabilir deneyler gerçekleştirmek için tutarlı bir akış sağlamak değerli, şunlardır. Bu iletişim kuralı bir dönen kuluçka birimi, dokuların aralıklı maruz oksijen ve besin sağlayan bir sistemi kullanarak fare akciğer dokusu tümör kaynaklı dilimleri kültür açıklar. Önceki çalışmalarımız kuluçka birimleri dönen kullanımı özellikle dilimleri yüzen diğer kültür yöntemlerine göre doku canlılığı artırır ve durgun süzgeci destekler gösterdi. Burada, biz daha fazla dilim kalınlığı canlılığı etkiler gösterir kültürlü dilim dilim kalınlığı bu duruma getirilmesi düşündüren farklı doku türleri için yapılmalıdır. ITH etkinlikler, stromal hücre infiltrasyonu ya da ayırt etme belirteçleri, ifade sinyal gibi ilgili oncogenic işlevleri gerektirir bitişik doku dilimleri işaretleri ilaç tedavisi tarafından değiştirilmiş bir ifade için değerlendirilmesi telaffuz ya da ekimi kendisi. Özetle, bu iletişim kuralı fare akciğer tümörü dilimleri nesil ve onların kültür üzerinde dönen bir kuluçka birimi tanımlar ve nasıl dilimleri sistematik türdeş olmayan doku işaretlerini, ifade bir önkoşul olarak analiz edilmelidir gösterir önce ilaç yanıt araştırmaları.

Giriş

Solid tümör doku, akciğer kanseri, dahil olmak üzere fenotipik ve genetik heterojenite sergi ve karmaşık microenvironments^1,2liman. Tümör hücreleri ve çevresindeki microenvironment etkilerinin ilaç duyarlılığı ve direnç mekanizmaları³arasındaki etkileşimi. Bu doğru bir şekilde biyolojik karmaşıklığı ve yerel tümörler hareket işlevleri modelleyebilirsiniz preklinik modelleri ihtiyacını vurgular. Vivo biyoloji, en az zaman dağınık şekilde bireysel bir tümör dağıtılmış fenotipleri dahil olmak üzere, kısa bir pencere için temsil etmek için asıl kapasitesi sahip oldukları gibi hassas kesim dilimleri hemen taze tümörler türetilmiş benzersiz bir kaynak sağlar. Rezeke klinik tümörler kanser hastası elde edilebilir birkaç kişiselleştirilmiş numuneler biridir ve tanılama kullanımları İnceleme hak ediyor.

^{Ne zaman insan intrakraniyal tümörler el doku parçalar halinde kesilmiş ve kültürlü sözde kullanarak geri erken 19 yy,} organotypic kültürlerin tarihleri geçmiş bırak yöntemini asılı. Doku parçaları bağlı bir coverslip ve sonra coverslips ters, mühürlü ve birkaç hafta⁴için kültürlü heparinized insan plazma içine daldırma için izin. El ile adet plazma pıhtıları⁵, sıvı ortam⁶, gibi diğer yöntemler kullanarak kültürlü beri veya boyut filtreleri⁶0,45 µm gözenek tümör kesti. "Organotypic" terimi ilk 1954, Retina civciv embriyo göz⁷farklılaşma üzerine bir çalışma içinde kullanıldı. Bu civciv embriyo⁸ve beyin explants yetişkin fareler⁹türetilmiş akciğer ve kalp doku explants kullanılan çalışmalar izledi.

Çeşitli Dilimleme yöntemleri tarif, yani manuel helikopterler^10,11, Krumdieck doku dilimleyici^12,13ve vibratomes^{11,14,15olmuştur, 16}. Krumdieck doku dilimleyici sonra bir microtome kullanarak dairesel doku dilimler halinde dilimlenmiş silindirik doku çekirdek oluşturur. Bir vibratome öte yandan, titreşimli blade microtome kullanır. Karaciğer dilimleri üzerinde bir çalışmada, bu Leica vibratome Krumdieck dilimleyici¹⁵ile karşılaştırıldığında daha fazla tekrarlanabilir ve tutarlı dilimler oluşturur gösterilmiştir. Dilim kalınlığı 250 500 µm arasında kullanılan ve çalışmalar canlılığı ve morfolojik özellikleri bakım bile 16 gün¹⁴kadar^,10,17,18rapor etmektedir. Ancak, tümör besin gereksinimleri etkileyebilir değişken metabolik profilleri var ve doku sertlik ve matris kompozisyon gibi parametreleri havalandırma ve besin akışı etkileyebilir. Bu nedenle doku türlerinin en iyi duruma getirme Dilimleme ve kültür koşullardan gerektirir yüksektir.

Dilim kültürler desteklemek için kullanılan farklı yetiştirme yöntemleri: Ben) sabit Interphase kültür, durgun destek kültür içinde dilimleri kültür ortamında dalmış bir yarı geçirgen membran eklemek üzerine yerleştirilir, olarak da bilinir. Alt besin yolu ile gözenekli Ekle^14,19ile takıma iken, hava için üst dilimleri maruz kalmaktadır; II) orijinal kültür bütün organları veya embriyonik dokusu dilimlerin gelişmiş mala yöntemi. Bu, dilimleri bir pamuk yaprak ya da metal bir kılavuz tarafından desteklenen filtre üstüne yerleştirilir ve filtre kültür ortamda batırılmış. Dokuları nemli tutmak için orta ince bir tabaka üzerine dilimler^20,21,22eklenir. Bu ilk iki hava-sıvı Interphase kültürler sözde; III) silindir tüp kültürler, dilim orta içeren bir plastik tüp düz tarafı yerleştirilir ve doku ile orta döngüsünün ilk bölümünde sırasında kapalı veya sırasında ikinci²³gazlı olduğunu yavaş tüp dönüş sağlar; IV) dönen kuluçka birimler, hangi dilimleri zaman zaman orta besin ve havalandırma ile sunulur. Farklı roller tüpler, bu yöntemde dilimleri ile kültür orta²⁴6-şey plakalar yerleştirilen gözenekli titanyum ızgaralar üzerine yerleştirilir.

Dokusu dilimlerin olarak onlar canlılık değerlendirilmesi izni rezeke solid tümör mantıksal olarak mevcut hangi anti-kanser ajanı, tedaviye yanıt test etmek için bir çekici ex vivo modelinde türetilmiş, hedef yolu etkinliği ve moleküler profilleri onun yerli tümör microenvironment huzurunda belirli bir tümörü. Ancak, tümör dilimler halinde ölçülen uyuşturucu yanıt situ yanıt akıllı olup olmadığını değerlendirmek için ne ölçüde dokusu dilimlerin hücre çoğalması gibi tümör özgü Biyolojik işlevleri korumak için değerlendirmek önemlidir, histopatoloji özel hücre farklılaşma ve oncogenic sinyal etkinlikleri. Mekanik stresin dilim hazırlık, dilim işleme veya kültür kaynaklı adaptasyonlar hem kalite hem de dokusu dilimlerin biyolojik fonksiyonları sırasında elde edildi temel soru, sıkıca bağlı tümör kaynaklı uygulamak için yeteneği vardır fonksiyonel tanı için dilimleri.

Bizim Konsorsiyumu ımı tarafından finanse edilen proje PREDECT (http://www.predect.eu) adresine sistematik olarak bu temel soru, dilim explants çeşitli kaynaklardan gelen inceleyerek ortaya koyuyor. Meme, prostat ve akciğer kanseri modellerden türetilmiş dilimleri kullanarak, bu ortak çaba nitel okuma gibi nicel Hematoksilen ve atmosferik oksijen ve durgun filtre için bir gereklilik göstermek için esaslı eozin (H & E) - çıktıları kullanılmaktadır kültürlü dilimleri canlılığı 72 h kadar sürdürmek için destekler. Ayrıca, immünhistokimya (IHC) analizleri kültürlü dilimleri üzerinde içi dilimli canlılığı degradeler, nekroz gradyanlar içinde fare küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC), östrojen reseptör (ER), HIF1α türetilmiş dilimler olarak kanıtlandığı ortaya koydu ve γH2AX meme kanseri dilimleri içinde geçişlerini veya androjen reseptör (AR) ifade degradeler prostat kanseri dilimleri²⁵. İlginçtir, içi dilimli canlılığı degradeler fare NSCLC kültürleri 24 h içinde yetiştirme dönen bir kuluçka birimi tarafından kurtarıldı ve canlılığı 72 h²⁶için genişletildi bizim yeni çalışma gösterdi. Özellikle kameranın üst kısmı en uygun²⁶uyuşturucu yanıt analizlere dilimleri en iyi bu doku tarafında yapılmaktadır onaylamadan, kaldı.

Olsa bile bu kadar nasıl gibi bir soru kalır dokusu dilimlerin in situ tümör işlevleri özetlemek, bunlar kapsamlı anti-kanser ajanı, hedeflenen uyuşturucu, monoklonal antikor ve kemoterapi ajanlar ^{gibi yanıt test etmek için kullanılmıştır 10,11,13,14,18,27}. Biz son zamanlarda fare NSCLC dilimleri içinde yayılması dinamik değişiklikleri göster ve taze 0 h kesmek için karşılaştırıldığında ekimi takip oncogenic sinyal faaliyetleri dilimler²⁶gösterdi. Bu hedeflenen in situ biyolojik fonksiyonları ekimi, önce pertürbasyon çalışmaları sırasında uygun şekilde korunur olup olmadığını araştırmak önemli olduğunu gösterir. Bu bulgular rağmen biz tümör dilimleri kayma yanıt-e doğru ilaç tedavileri kalır ortasında hedefli tedaviler model olabilir gösterdi (24 saat) kısa ve²⁶kültürü çalışmalarının başlangıcı başlatılır. Aşağıdaki protokol önemli doğrulama açıları ilgili kuruluş ve analiz farmakolojik uyuşturucu testi içinde onların uygulamadan önce tümör dilim kültürlerin anlatır.

Protokol

Bu çalışmada açıklanan tüm fare deneyleri Fin Ulusal kurulu, hayvan deney yönergeleri izleyerek gerçekleştirilen ve Helsinki Üniversitesi ve devlet il deneysel hayvan Komitesi tarafından kabul edildi Southern Finland (lisans numarası ESAVI/9752/04.10.07/2015) ofisi.

1. dilimleme önce hazırlıklar

1. Aşağıdaki belgeleri hazır tutmak: vibratome numune sahibi, vibratome tepsi, 10 cm kültür plaka, 24-şey plaka, 10 mL pipet, pipet çocuk, atık torbası, % 70 arabellek aletleri ve doku yapıştırıcı dezenfekte alkol 50 mL tüp içinde.
2. Vibratome hazırlamak: % 70 ile bıçak sahibi sil alkol, yeni bir bıçak eklemek ve bir vibrocheck (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf) kılavuzda sağlanan yönergelere göre gerçekleştirin.
   Not: Blade dikey saptırma en aza indirir ve kaliteli dilimleri sağlar gibi vibrocheck adımı gerçekleştirmeniz önemlidir.
3. Her doldurmak de 24-şey plaka ile 1 mL, Hanks dengeli tuz çözüm (100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin (HBSS + P/S); HBSS), plaka buz üzerinde tutun.
4. F12 Kültür 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 2 mM glutamax, 22 mM glikoz ve % 10 fetal Sığır serum (FBS) ile desteklenmiş orta hazırlayın.
   Not: Tümör dilim kültür orta ve büyüme faktörü takviyeleri tümör doku²⁵bağlı olarak değişebilir.
5. F12 orta gerekli miktarı 1.4. adımda açıklandığı gibi aynı kompozisyon kullanarak ama FBS atlama ilaç tedavisi için hazırlayın.
   Not: büyüme faktörleri serum oncogenic kültürlü dilimler halinde sinyal etkileyebilir beri kısa süreli uyuşturucu pertürbasyon araştırmalar tümör dilimleri serum-Alerjik Orta önerilir. Daha uzun vadeli dilim kültürler analiz edilir, ilk orta serum-alerjik etkisi doku canlılığı ve tedavi edilmezse dilim kültürlerde tümör özgü marker ifade değerlendirmek önemlidir.

2. tümör taşıyan akciğerler topluluğu

1. Zahmetli nefes belirtileri ve vücut kilo kaybı ortaya çıktığında bir tümörü taşıyan fare tarafından servikal çıkığı ötenazi.
   Not: CO₂-aracılı ötenazi dilim canlılığı veya hipoksik yanıt alabilme yolu ile oncogenic faaliyetleri üzerinde bir etkisi olabilir akciğerler hipoksik koşullarda ikna etmek için bilinir.
2. Böylece göğüs maruz içinde tüm dört paws, 30 G iğneler ekleyerek euthanized fareyi bir Styrofoam kapağı üzerine streç.
3. Doğru göğüs ve boyun bölgesi kadar karın derisini kesmiş. Göğüs kafesi ve akciğer ve kalp ortaya çıkarmak için diyafram kesmiş. Makas doku hasarı önlemek için açılı bir pozisyonda tutun.
4. Tümörü taşıyan akciğerler kalp ile birlikte incelemek ve buz gibi HBSS + P/S 30 mL içeren bir 50 mL tüp içine koyun; tüp buz gibi tutmak ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde bir sonraki adıma geçin.
   Not: Akciğer tümörlerinin işlemedeki gecikmeler oncogenic işlevler, örneğin yol faaliyetleri sinyal değiştirebilir.

3. nesil hassas kesim akciğer tümörü dilimleri

1. HBSS + P/S tümörü taşıyan akciğerlerde laminer kukuIeta içinde sürekli bir 10 cm doku kültürü tabak içine aktarın. Steril makas ve forseps kullanarak Akciğer lobları ayırın ve LOB tümörü yüzeyinde Dilimleme için seçin.
   Not: Tümör > 3 mm boyutunda Dilimleme için uygundur. Temizlenen tümör bölgesi vibratome bıçak yüzler öyle ki büyük tümör tavizler çevreleyen doku sertlik farklılıkları nedeniyle Dilimleme normal akciğer doku beri Dilimleme geçiren tümör dokusu normal doku uzak ayrılmalıdır.
2. Uzak steril neşter ile tümör çevreleyen normal akciğer doku parçası kesim tarafından bir düz doku parça yüzey oluşturmak ve düz slayt içinde bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı daldırma. Tümör dik bıçak yüzleri bu yan vibratome'nın numune tutucu üzerine bağlarsınız. İzin için 2-3 dakika kuru tutkal.
   Not: numune sahibine yapıştırılmış normal akciğer dokusu tümör doku Dilimleme ile engel değildir ve normal doku ulaşılmadan Dilimleme durdurulur. Tümör doku bazen onun dik duruma ödün numune sahibine yapıştırılmış normal akciğer dokusunun süngerimsi doku nedeniyle virajlı. Bu durumda, ek normal akciğer destek doku dik (Şekil 1A III) tümör korumak için önceden monte edilmiş normal akciğer dokusunun yanında bir parça tutkal.
3. Numune tutucu metal arabellek tepsisine koyun ve doku arabellekte batırılır kadar soğuk HBSS + P/S ile doldurun. Metal arabellek tepsi beyaz buz banyosu üzerine yerleştirin ve çok doku Dilimleme süre serin tutmak için buz ekleyin.
4. Beyaz buz banyosu için vibratome ekleyin. Uygun Dilimleme ayarlar seçin: 2,5-2,8, hız 0.10-0,14 arasında Dilimleme arasında değişen genlik ms ve 160-250 µm arasında değişen bir kesme kalınlığı.
   Not: Dilimleme ayarlar doku sertliğini göre ayarlanması gerekir. Sert doku daha yumuşak doku dilime daha kolay ve daha yumuşak doku gerektirir daha düşük hız ile Dilimleme (0,1-0,12 ms) ve daha yüksek genlik (2.6-2.8). 4 – 5 mm büyük tümör genellikle 15-20 dilim 200 µM kalınlık sağlar. Kısa vadeli ekimi için fare tümörler laminer başlık dışında yarı steril koşullarda dilimlenmiş. Ancak, klinik tümör her zaman olası bulaşıcı insan dokusu içinde maruz önlemek için bir sınıf II Biyogüvenlik laminer başlık içinde dilimlenmiş.
5. Steril forseps kullanarak, yakından takip içinde dilim dilimlenmiş sipariş edilmesi HBSS buz üzerinde düzenlenen 24-şey plaka ayrı Wells 1 ml dilim toplamak. Her işareti de, deneysel planına göre 24-şey plaka. Örneğin, mark sıralı kuyu kültür zaman puan veya 0 h, araç kontrol (C), olarak 24-şey plaka yapımı tedavi (T) (Şekil 1B II) uyuşturucu.
   Not: Değil rahatsız veya bu açı ile ilgili olarak tümör yönünü sonraki dilimleri kalınlıkları tutarsızlıklarına yol açan bıçak değiştirecek gibi tümör doku bir dilim toplarken çekin.
6. Tüm dilimler toplandığında onları kültür orta iyi başına 2.5 mL içeren bir 6-şey plaka yerleştirilmiş titanyum ızgaralar (kılavuz başına 2-3 dilim) aktarmak. Titanyum kılavuz ve orta arasında hiçbir hava kabarcıkları oluşmuş emin olun.
   1. Bir dilim ızgara üzerine yüklemek için kılavuz orta bölümünü kaplar 6-şey plaka açılı bir konumda tutmak ve ızgara üzerinde orta dilimi yerleştirin; Forseps Bu bukleler dilimi yaymak için kullanın. 6-iyi plakaları % 95 hava ve % 5 CO₂37 ° C'de tutulan bir oksijen kuluçka makinesi içine yerleştirilen dönen kuluçka birimi üzerine yük ve rotasyon döngüsü (Şekil 1 c ı-II) başlatın.
      Not: Metalik ızgaralar ve 6-şey plakaları doğru dönen üniteyi açmadan önce dengeli kilo olması gerekir. Kılavuz ortasında dilimleri yerleştirin ki böylece onlar tam olarak hava ve sıvı döndürme döngüleri aşamalarında arasında geçiş yapar. Çok düşük veya yüksek yerleştirilir dilimleri uygun şekilde oksijen veya besin (Şekil 1 c ben), doku canlılığı olumsuz etkileyebilir maruz değildir. Dilimi zaman zaman aşağı slayt olabilir gibi dilimin konumunu ekimi sırasında ızgara üzerine getirmeniz önemlidir. Bu kültür başlangıçlı içinde 1-2 h olursa, konumunu düzeltin ve aşağı notu Bu örnek zarar görmüş olabilir. Doku canlılık önemli ölçüde yanlış oksijen ve besin kaynağı tarafından etkilenmiş olarak uzun bir süre için mispositioned dilimleri atılmalıdır.
7. Bir doku dilim kültürlü dilimlere bitişik bir 0 h, kültürsüz, başvuru toplamak. Üst, orta ve merkezi dilimlenmiş doku temsil etmek için en az üç başvuru dilimleri toplamak. 5. 1'açıklandığı gibi saptamak 0 h dilimleri hemen ve işlem.
   Not: dilim sayısı sınırlı ise, birden fazla bileşik tedaviler veya teknik çoğaltır yapılırsa, Örneğin, onun komşu 0 h örnek ile tedavi her örneğinin karşılaştırmalar zor olabilir. Bu gibi durumlarda, en yakın 0 h dilim (en az 400-600 µm apart) göreli doku canlılığı veya ifade kültür başlangıçlı, ilgili işaretleri değerlendirmek için kullanın.
8. Uzun vadeli ekimi için her gün kültür orta doldurmak. Steril forseps kullanarak doku dilimler içeren bir kılavuz kaldırın ve 6-şey plaka boş bir kuyuya yerleştirin; orta % 70'i ile taze kültür orta yerine ve ızgara orta geri yerleştirin. Döndürme döngü adım 3.6 açıklandığı gibi devam.

4. küçük molekül inhibitörleri dilimlerle tümör tedavisinde

1. Tedavi orta bileşikler gerekli konsantrasyonları hazırlayın. Tipik olarak, hücre kültürleri içinde ölçülen IC50s göre 10 kat daha yüksek ilaç konsantrasyonu dokusu dilimlerin hedef inhibisyon elde etmek için gereklidir. Belirsiz sitotoksisite önlemek için konsantrasyonları her bileşik için en az etkili konsantrasyonu elde etmek için bir dizi test. Burada, test ettik 0.1-1 PI3K/mTOR inhibitörü dactolisib ve 0,05 – 0,5 µM MEK inhibitörü selumetinib fare NSCLC dilimleri üzerinde µM.
2. Medya ile seyreltilmiş uyuşturucu veya DMSO ya da diğer araç kontrol 2.5 mL 6-şey plaka ekleyin. Titanyum ızgaralar kuyu yerleştirin.
3. 3.6. adımda açıklandığı gibi doku dilimleri ızgaralar üzerine yerleştirin.
4. Araç ya da ilaç tedavileri 24 h devam et doku fiksasyon ve 5 bölümde açıklandığı gibi parafin bloklara dilimleri işleme gerçekleştirir.
   Not: Uyuşturucu tedavi süresi deneme, amacı bağlı olarak dokusu dilimlerin kültür döneminde analiz in situ doku işlevleri korumak yeteneği de dikkate alınarak hale getirilebilir.

5. fiksasyon ve dokusu dilimlerin işlenmesi

1. Kültürsüz 0 h başvuru veya PBS içinde batırılmış bir filtre kağıdı üzerine kültürlü dilim çýkýntýdan.
   1. Bunu yapmak için 2-3 mL PBS bir 10 cm tabak içinde ekleyin, PBS dilim float izin ve 'o forseps bir çift ile dilim filtre kağıdı üzerine kaldırarak balık'.
   2. Filtre kağıdı bir histocassette aktarmak ve seyreltilmiş hematoksilen (1:1. deiyonize suyla) gözle görülür (Şekil 1 d) sonraki işlem adımları sırasında dilimin konumunu işaretlemek için doku dilim üzerine bir damla ekleyin.
   3. Kaset kapatın ve % 4 tarafsız tampon formalin çözüm aktarın. Dokular gecede 4 ° C'de düzeltmek
      Not: filtre kağıdı üstüne dilim yerleştirerek süre dilimi üst bölümünde yukarı dönük olduğundan emin olun; Bu üst, orta ve alt bölümünde bir dilim kesit ve 6,3 adımda anlatıldığı gibi analiz sırasında takip etmek gereklidir.
2. Ertesi gün, kasetleri transfer % 70 alkol ve hemen parafin katıştırma doku işleme adımının ile devam edin.
3. Doku işlem önce histocasettes % 100 yıkama alkol 2 x 10 dk için. Bu durumda, bir mikrodalga İstasyonu doku işleme için kullanın. 1 mm doku kalınlığı için kullanılan program seçin ve Kılavuzu (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf) sağlanan yönergeleri izleyin.
   Not: diğer doku işleme makinaları kullanırken, ince bir doku örnekleri için uygun programı kullanın.
4. Parafin gömme, bir histocassette açın ve filtre kağıdı dilimden çýkýntýdan için neşter kullanın. Filtre kağıdı atmak ve dilimi Sıvı parafin içeren bir kalıba aktarın.
   1. Doku karşı gömme kalıp, örneğin düz ağırlığı bile kesit emin olmak için alt tuşuna basın. Üstünde tepe-in kalıp histocasette alt kısmı yer, 30 dk için kalıp soğumaya soğuk pate tarih ve kalıp parafin blok ayırın.
      Not: yatay katıştırma alternatif olarak, tümör dilim dilim dik bir pozisyonda konumlandırma tarafından dikey olarak gömmek mümkündür. Dikey bölümleri kolayca canlılığı veya işlev işaretçisi ifadedeki tek bölüm ²⁵degradeler analizine izin verir. 6.2. adımda açıklandığı gibi kesit parafin yatay olarak gömülü dilimleri ile degrade analiz gerektirir.

6. işleme ve analiz Formalin sabit ve parafin gömülü (FFPE) doku

1. Bir microtome kullanarak FFPE doku dilim blokların 4 µm ince bölüm hazırlamak. Blok yüzeyini bıçak ile ilgili olarak yatay olarak yönlendirilmiş kesit zaman blok açısını ayarlamak; Bu bile bölümleri doku boyunca elde etmek gereklidir.
2. Bölümler arasında kültürlü dilimleri dilimleri veya degradeler biyomarker ifade yakalama bir potansiyel kültür kaynaklı canlılığı degrade, hücre geçiş etkinleştirmek için nesne slaytlarda her doku dilimin üst, merkezi ve alt katmanlardan toplamak aşağıda açıklandığı gibi.
3. Parafin gömülü doku dilim bölümlerini sıralı doku ilk cam slaytlara üst kısmındaki toplamak. Cam slaytlar (Şekil 1E) alt bölümü tarafından takip orta derin doku katmanları bölümlerini toplama devam edin.
   Not: bir cam slayt üzerinde üç bölüme kabul ettirmek için uzakta katıştırılmış doku dilim çevreleyen parafin fazlalığı kırpın.
4. 37 ° C'de kuru gecede bölümlerine izin ve H & E boyama veya immünhistokimya ile aşağıda anlatıldığı gibi devam edin.
   Not: FFPE bölümleri yüksek sıcaklıklarda veya uzun bir süre için depolanan antigenicity kaybı oluşabilir. Parafin kesitler 4 ° C'de depolanan tavsiye edilir ve kesit sonra 6 ay içinde IHC analizleri yapılmalıdır.
   1. H & E boyama, deparaffinize ve parafin bölümler aşağıdaki gibi suyla temasa: ksilen 3 x 5 min, % 100 için alkol 3 x 1 dk, % 96'sı için alkol 2 x 1 dk, % 70 alkol 1 x 1 dk ve deiyonize su 2 x 1 dk. için.
   2. Taze filtre uygulanmış hematoksilen çözüm için 10 dk bölümlerde kuluçkaya ve dokunun 5 dk. Dip bölümleri asit alkol akan suyun altında yıkayın (%1 HCl % 70 alkol) 2 kez ve musluk suyu 5 min % 0.5 eozin için 2 m ile kuluçka takip için çalışan altında yıkama için içinde.
   3. Eozin adım takip kurutmak bölümleri aşağıdaki gibi alkol ve Ksilen çözümleri, slaytları çeker tarafından: % 96'sı alkol 2 x 15 s, %100 alkol 3 x 30 s, ksilen 3 x 1 dk için. Son olarak, bölümleri montaj ksilen tabanlı ortamda gömün.

7. doku canlılığı ve biyomarker ifade Analizi

1. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek H & E lekeli slaytlar bir tarayıcı kullanarak tüm slayt taranmasını oluşturarak. Doku viability değerlendirmek için anlık dilimler üst, orta ve alt bölümlerini temsil eden doku taramaları alabilir.
   1. Fotoğraf manipülatör yazılımı kullanarak el ile maskeleri nekrotik bölgeler MATLAB kullanma miktar tarafından takip dokuların nekrotik alanlar üzerinde çizin.
   2. Bizim önceki çalışma (Närhi vd., Şekil S2B ve C)²⁶yılında bitmiş gibi yakın 0 h dilime göre farklı zaman noktaları için ekili dilimleri nispi canlılık hesaplayın. Benzer şekilde, üst, orta ve alt kısmındaki kültürlü bir dilim canlılığı miktarının tarafından potansiyel içi dilimli canlılığı degradeler değerlendirmek ve onun en yakın 0 h dilim için her bölümün nispi canlılık hesaplayın.
      Not: ex vivo kültür koşulları biyolojik yanıt iken fare NSCLC dilimleri sadece ekimi nekrotik hücre ölümüne neden olmaktadır, tümör doku bağlı olarak değişir. Örneğin, HIF1α, ER ve F4/80 tarafından işaretlenmiş makrofajlar degradeler bir meme kanseri modeli²⁵türetilmiş filtresi destekli dilim kültürlerde tespit edildi. Bu nedenle, H & E - yanı sıra IHC tabanlı analizler kültürlü dilimleri her doku türü için dikkate alınması gerekir.
2. IHC parafin kesitler üzerinde gerçekleştirin. Aşağıdaki IHC iletişim kuralı bir başlangıç noktası ve daha fazla en iyi duruma getirme için diğer antikorlar gerektirir. Kısaca, deparaffinize ve parafin bölümler aşağıdaki gibi suyla temasa: ksilen 3 x 5 min, % 100 için alkol 3 x 1 dk, % 96'sı için alkol 2 x 1 dk, % 70 alkol 1 x 1 min ve deiyonize su 2 x 1 dk için.
   1. Antijenik epitopları ortaya çıkarmak, 10 mM sitrik asit pH 6 PT modülündeki kullanarak ısı-aracılı antijen alma gerçekleştirmek için takip %1 sığır Serum Albumin (BSA) ve % 10 ile Normal keçi Serum (NGS) 1 x PBS için ortam sıcaklığı (21-23 ° C), 30 dk içinde bloke ederek.
   2. % 1 BSA ve % 5 içinde seyreltilmiş birincil antikor kuluçkaya NGS 1 x PBS, ortam sıcaklığı, 1-2 h için de içinde. Anti-tavşan ikincil antikor, 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB) kullanarak algılama tarafından takip ortam sıcaklığında 30 dakika ile kuluçkaya.
   3. Bölümler (1: 10'a deiyonize suyla seyreltilmiş) hematoksilen 30 s ve dehidratasyon tarafından aşağıdaki gibi alkol ve Ksilen çözümleri, slaytları çeker tarafından takip 5 min için musluk suyu altında yıkama ile counterstained: % 70 alkol 1 x, % 96'sı alkol 2 x, %100 alkol 3 x, ksilen 3 x ( Adım 1 dk). Son olarak, bölümleri montaj ksilen tabanlı ortamda gömün.
3. Tüm slayt tarama IHC lekeli slaytların elde etmek, bir büyütme oranı 1:4 kullanarak bir resim görüntüleyici kullanarak TIFF görüntüleri olarak dışa aktarın ve ImageJ kullanarak quantifications gerçekleştirmek.
   Not: quantifications için alternatif tarayıcı, 20 X veya 40 X büyütme mikroskobik görüntüler elde edilebilir gibi. Görüntü büyütme sayısal için işaretçiyi bağlı olarak seçilebilir; yüksek büyütme görüntüleri nükleer boyama için süre sitoplazmik tavsiye edilir veya membran işaretleri 20 X görüntüleri kullanarak quantified.
   1. Miktar nükleer işaretleri için bu durumda NKX2-1 ifade, her görüntü Fiji-ImageJ kullanarak 16-bit görüntüleri dönüştürmek ve görüntü analizi için resim yüklemek.
   2. Görüntü analiz boru hattı bağlı olarak analiz özelleştirmek. Bu protokol için aşağıdaki potansiyel NKX2-1 pozitif hücre çekirdeği miktar için kullanın: birincil nesneleri tanımlamak | Nesne yoğunluk ölçme | Nesneleri filtre (en az değer 0.0025 =) | Math. hesaplamak Sonuçları DAB lekeli çekirdekleri çekirdeklerin sayısı yüzde olarak gösterilir.

Sonuçlar

Şekil 1 üretimi, yetiştirme ve hassas kesim doku dilimleri fare NSCLC tümörler türetilmiş analizi için iş akışını temsil eder. Bu gösteri için tümörleri bundan sonra denilen koşullu aktivasyonu Kras^G12D ile birlikte Lkb1 (olarak da bilinen serin/treonin kinaz 11), kaybı barındıran bir genetiği fare modeli (et) kullanılan KL. Fare ıslahı ve akciğer tümörü başlatma^26,28içinde açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Şekil 2A dilimleri 24 saat dönen bir kuluçka birimi kullanarak kültürlü canlılığı doku dilim kalınlığı etkisini gösterir. 160 µm ince dilim dilim büyük nekrotik alanlar içeren sonuçlar gösterir. Buna ek olarak, 250 µm ince dilimler bir nekroz dilimin 200 µm ince dilimlere göre degrade gösterir. Bu teknik işleme sırasında ızgaralar üzerine dilimler konumlandırma bu kırılgan ve curl eğilimi gibi en ince 160 µm zavallı genel canlılığı kaynaklanır olasıdır. Zaman dilimleri çok kalın, onlar-ebilmek var olmak oksijen veya besin difüzyon eksiklikleri eğilimli dilimleri arasında olan, öte yandan, hangi fare NSCLC explants nekrotik ölüm degrade²⁵olduğunu göstermiştir. Ancak, dilimleri değişken kalınlıkları ile aynı vibratome ayarları kullanımı rağmen bir tümörün kaynaklandığı unutulmamalıdır. Bu nedenle farklı tümör örneklerinden birden çok çoğaltır analiz etmek için önerilir. Önemlisi, sertlik ve doku doku oksijen ve besin akışı etkileyebilir gibi doku türlerinin en büyük canlılık, elde etmek için dilim kalınlığı optimizasyonu gerektirir. Şekil 2B -2C NKX2-1 ifade nicel IHC analizleri gösterir, iyi farklılaşmış akciğer adenokarsinom (AC) örneklerinde bir işaretleyici en fazla 72 saat ekili ve 0 h dilimleri eşleştirdi. NKX2-1 ifade önemli ölçüde kültürlü dilimleri ile karşılaştırıldığında yetiştirme süreci açıktan açığa AC tümör doku farklılaşması durumunu etkilemez düşündüren 0 s kültürsüz dilimleri içinde değiştirilmemesini sonuçları göster. Şekil 2B tümör dokusu dilimlerin hedeflenen ilaçların etkinliğini değerlendirmek için yarar gösterir. Biz son zamanlarda o Kras mutant fare ACs sergi yüksek ifade fosforile ERK1/2 (artan MAPK yolu etkinliği işaretleme) gösterdi (işaretleme mTOR etkinliği ifade fosforile 4EBP1 ise adenosquamous (ASC) tümör karşılaştırıldığında ) benzer şekilde AC ve ASC tümörler ifade edilir. Eğer bu yolları etkili doku dilimleri hedeflenebilir sınamak için KL AC dokusu dilimlerin DMSO ile tedavi edildi veya titre bileşikleri, yani 0.1-1 miktarda hedef mTOR yolu veya 0,05 – 0,5 µM dactolisib MAPK yolu hedeflemek için µM selumetinib. Sonuçlar 1 µM dactolisib veya selumetinib 0.5 µM sırasıyla 4EBP1 veya ERK1/2, fosforilasyon inhibe etkili olduğunu göstermektedir. Ayrıca, hedeflenen phosphoproteins inhibisyonu doz bağımlı dokusu dilimlerin Ayrıca fosforilasyon özel antikorlar doğrulamak için yararlı olabilir gösterir.

Şekil 1: kuruluş ve fare NSCLC tümör kaynaklı dilim explants analizi için iş akışının şematik Gösterim. (A)şeması koleksiyonu ve dilimleme hazırlığı tümörü taşıyan akciğer açıklayan. Akciğer lobları bir fareden hasat ve tümör dokusu normal doku uzak disseke. Yaklaşık 4 mm ve 1 mm tümörler, sırasıyla siyah ok ucu ve yıldız işareti gösterir. Beyaz ok ucu numune tutucu yüzeye yapıştırılmış akciğer doku gösterir. Normal akciğer destek doku dik tümör korumak için ek bir parça kırmızı ok noktalarda. (B) Vibratome Dilimleme ve dokusu dilimlerin toplanması. Beyaz ok Dilimleme yönünü gösterir. Sıralı dilim koleksiyonuna içeren soğuk HBSS + P/S. 24-şey plaka Dilimleri ya da farklı zaman noktaları (burada, 24 – 72 h) ekimi (üst satırı) sırasında tümör özgü marker ifade değerlendirmek için için kültürlü olabilir veya ilaç tedavileri gerçekleştirmek için kullanılabilir. C: araç kontrolü, T: ilaç tedavisi. (C) dönen kuluçka birimleri kullanarak ekimi için doku dilim yerleştirerek. Böylece bazı orta üst kılavuz kapsayan 6-şey plaka yatırmayı, doku dilim kılavuzunun üstünde dururlar orta ortasında yer ve forseps kullanma dilim yayıldı. 6-iyi plakaları ağırlık düz döndürme döngüsü için dengeli olduğundan emin olun. X: gösterir yanlış, ve : doğru dilim konumlandırma gösterir. (D) bir tümör dilim FFPE bloğunu fotoğrafı. Parafin gömülü doku dilim siyah oku noktalarda hematoksilen ile lekeli. (E) şemaları; dilimler parça sipariş FFPE bloklar halinde gösterilen Bu bölümler doku canlılığı ve tümör özgü biyomarker ifade değerlendirmek için işlenebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: değerlendirme canlılık ve histotype özgü marker ifade ve hedeflenen uyuşturucu tedavi NSCLC dokusu dilimlerin. 24 h 200 µm ince dilimler için kültürlü belirtilen kalınlıkları dilim AC NSCLC(a)temsilcisi H & E görüntülerini korumak daha iyi canlılığı 160 µm ya da 250 µm ince dilimler ile karşılaştırıldığında. H & E uygun doku lekeli koyu mavi temsil eder ve pembe pseudocolored nekrotik bölgeler gösterir. Açık mavi analizi, zavallı doku kalitesi veya fibröz stroma varlığı nedeniyle dışında bölgeleri gösterir. T1 ve T2 biyolojik çoğaltır iki farklı tümörler türetilmiş temsil eder. Ölçek çubuğu = 500 µm. (B) temsilcisi IHC resimleri NKX2-1 ifade için belirtilen süre puan kültürlü AC dilimleri içinde. Ok daha yüksek büyütme gösterilen alanı gösterir. NKX2-1 ifade 0 h dilimlere karşılaştırmak kültürlü dilimleri içinde değiştirilmez sonuçları göster. Ölçek çubuğu = 500 µm ve 50 µm için düşük ve yüksek büyütme, anılan sıraya göre. (C) miktar (B) gösterildiği veri. (D) temsilcisi IHC görüntüleri fosforile 4EBP1 veya 0 h ifadede pERK1/2 dilim veya dilimlerin DMSO ile tedavi veya titre dactolisib (dact, üst satır) tutarların veya 0 h dilim veya dilimlerin DMSO ile tedavi pERK1/2 ifadesinde fosforile veya selumetinib (sel, alt satır). Siyah kare şeklinde kutular içinde daha yüksek büyütme gösterilen alanları belirtir. Ölçek çubuğu = 1 mm veya 50 µm için düşük veya yüksek büyütme, anılan sıraya göre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

3D kültür ve organoids, dahil olmak üzere çeşitli karmaşık vitro tümör modelleri mimarisi ve oncogenic görev-in vivo tümör doku^29,30özetlemek için geliştirilmiştir. Ancak, 3D kültürler veya organoids kurulması doku ayrılma ve bir tek hücre türü Seçici büyüme veya ortak kültür seçme kaç hücre tiplerinin bir yapay ortamda içerir. Sonuç olarak, modelleri gibi eksik olarak tümör heterojenite ve tümör-stroma etkileşimleri inceliklerini yakalamak. Organotypic tümör dilimleri, öte yandan, geniş manipülasyon olmadan in situ tümör doku mimarisi ve biyolojik karmaşıklığı korumak. Bu yeteneği kendi yerel microenvironment modeli tümör hücreleri doku dilim onları özellikle çekici preklinik çalışmaları için işler. Biz daha önce kurulması ve hassas kesim tümör dilimleri analizi için en iyi duruma getirilmiş bir iş akışı rapor ve gösterdi ki, destekler filtre uygulamak için karşılaştırıldığında, dönen bir kuluçka birimi kısa vadeli fare NSCLC dilim kültürler²⁵ canlılık geliştirmek ^{, 31}. Bununla birlikte, ekimi birimleri dönen üzerinde teknik olarak zordur ve sürekli izlenmesi gerekir. Biz burada tümör doku dilim üretimi ve pratik kullanımı bir kuluçka birimi onları kültür dönen yanı sıra dilimleri in situ tümör biyolojisi, uyuşturucu önce bir ön koşul yakalama yeteneği izlemek için yöntemleri eşlik için bir iletişim kuralı mevcut tepki testi.

Birkaç kritik protokolündeki doku bütünlüğü ve tümör dilimleri canlılığı garanti. Normal akciğer dokusu çevreleyen tümör, vibratome ile tutarsız kalınlığında dilimler oluşturmak veya dilimleri, doku ve sertliği normal ve tümör doku arasındaki farklılıkları nedeniyle zarar verebilir. Böylece tümör dilimleme önce çevresindeki normal akciğer doku kaldırmak önemlidir. Başka bir kritik dikkatle her doku türü için optimize edilmelidir Dilimleme kalınlığı adımdır. Ayrıca, bir kez dilimlenmiş, bu dilimi çok doğru sağlamak için yaklaşık kılavuz ortasında, kültür orta ve oksijen pozlama daldırma aralıklı yerleştirilir önemlidir. Son olarak, bir dilim orta olarak düşüş olabilir gibi bir dilim konumunu, döndürme süresi sırasında izlemeniz önemlidir; daha fazla bu durumda, Eylemler iletişim kuralının 3.6 adım açıklandığı gibi alınabilir.

Doku bütünlüğü sağlamak için işleme ek olarak, aynı zamanda nasıl benzer dilimi yerel doku yorumlamaya IHC analizde kritik adım vardır. Bizim önceki çalışma fare NSCLC tümörler oncogenic sinyal faaliyetleri²⁶belirgin içi tümör kayma heterojenite sergi gösterdi. Bu denetimler için dağınık şekilde farklı doku kullanımı dilimler veya uyuşturucu tedavi örnekleri güvenilir deneysel verilerin yorumu etkileyebilir ve bu nedenle yakından bitişik dilimler denetimleri ve test örnekleri kullanılmalıdır anlamına gelir. Biz daha fazla gösterdi ki yayılması sırasında veya taze kesilmiş kültürsüz 0 h dilimleri ifadede oncogenic Fosoprotein in situ tümör için benzer kültürlü dilimleri değişmiş oncogenic Fosoprotein ifade, özel olarak değiştirilmiş p4EBP1 gösterdi ve pSRC yanı sıra değişmiş yayılması Ki67 IHC tarafından analiz. Değiştirilmiş p4EBP1 ifade benzer şekilde 24 h içinde algılandığı insan NSCLC ve prostat kanseri dilim kültürler (Narhi ve ark., tamamlayıcı şekil S3B-S3C, S5 ve S7)²⁶. Bu bulgular kültürlü dilimleri onların en yakın 0 h kültürsüz dilim ile karşılaştırılması in situ tümör işlevleri kültürlü dilimleri içinde korunması değerlendirmek önemlidir onaylamaz.

Organotypic dilimleri²⁵canlılık geliştirmek rağmen teknik açısından rotator sistemiyle sınırlamalar vardır. Dokusu dilimlerin titanyum ızgaralar üzerine yerleştirilmesi ekler filtre kıyasla daha zor ve dönen bir kuluçka birimi mevcut olmayabilir olduğunu. Alternatif olarak, durgun filtre destekler kullanılabilir ancak hava filtresi degradeler canlılık ve HIF1α ifade tarafından ölçülen hipoksi hızla filtre-taraftar dilim oluşur gibi o zaman dilimleri kullanımını yalnızca hava maruz tarafından analiz edilmelidir kültürler (Davies ve ark., Şekil 5 ve şekil 7A-7B)²⁵. Biz daha fazla tümör dilim kültürler değişmiş yayılması ve onların yerli tümörler²⁶, muhtemelen yara iyileşmesi yanıt veya dilim ex vivo metabolik adaptasyon nedeniyle karşılaştırıldığında oncogenic sinyal faaliyetleri sergilemek göstermiştir kültür³². Brüt morfolojik özellikleri fare NSCLC tümörlerin 72 h ekimi sırasında tutulan rağmen proliferatif değişiklikler kültür kaynaklı doğru ekili dilim sınıflandırma etkileyebilir. Böylece, dokusu dilimlerin yalnızca kısa süreli fonksiyonel çalışmaları için yararlı.

Dönen bir kuluçka birimi kullanımı, en azından kısmen içi dilimli canlılığı veya biyomarker ifade degradeler, özellikle ilk 24 saat sırasında kültür kurtarır. Bütünlük ve işlevi için doğrulanmış olduktan sonra bu ilaç tedavisi araştırmaları gibi fonksiyonel çalışmalar için doku malzeme sağlar. Uyuşturucu yanıt profil oluşturma ek olarak, uyuşturucu tedavi aşağıdaki değiştirilmiş hedef ifadesi de antikor doğrulama yararlanabilirsiniz. Bunlar yüksek boyama arka plan eğilimi olarak bu özellikle fare monoklonal antikorlar ile fare epitopları tespiti için önemlidir. Buna ek olarak, iyi doğrulanmış antikorlar güvenilir ve tekrarlanabilir veri tanı ve klinik ayarları elde etmek için gereklidir. Böylece, modülasyon bereket veya ilgili epitopları dokusu dilimlerin uyuşturucu tedavi aşağıdaki fosforilasyon antikor doğrulama kullanışlı pratik uygulamada sağlar. Tümör dilim kültürleri önemli bir avantajı bir çekici ex vivo model yapar modeli dağınık şekilde dağıtılmış görev oncogenic sinyal faaliyetleri veya uyuşturucu yanıt tümör veya stromal hücreler, dahil, yeteneği var. Ancak, işleme sırasında dilimlerini döndürme ve yetiştirme süreci daha da özellikle kenarlarında doku zarar verebilir. O bu nedenle kesin yerleşimi için 0 h dilimleri biyomarker lekeli IHC görüntüleri kültürlü dilimler halinde tespit nekrotik bölgeler ile hangi tam olarak uyuşturucu yanıt-e doğru kayma biyomarker faaliyetleri bağlantı yeteneği ödün vermez meydan okuyor. Buna ek olarak, tümör içsel, kültür kaynaklı ve uyuşturucu kaynaklı nekrotik yanıt en az kayma uyuşturucu tepkilerin doğru Nefelometri ödün fare NSCLC doku dilimler halinde, ayırt edilemez. Son olarak, tümör dilim kültürler kullanımı bir araştırmacı test etmek için birden çok bileşikleri aynı tümör, hayvanlar, böylece rafine, azaltılması ve Laboratuvar hayvanları üzerinde deneyler değiştirme tedavisi için ihtiyaç olmadan izin verir.

Yönelik bir uygulama açıklanan protokol klinik solid tümör örnekleri için kabul edilebilir. Daha fazla doku türe bağımlı değişiklikleri veya en iyi duruma getirmeleri Bunlar tümör doku veya sertlik için optimize etmek için dilim kalınlığı ve titreşim hızı da dahil olmak üzere vibratome ayarlarına ayarlamalar ile başlayan büyük olasılıkla zorunludur. Ayrıca, besin ve büyüme faktörü gereksinimi farklı tümör doku için farklı olabilir. Örnek olarak, meme kanseri dilimleri içinde orta^13,18takıma insülin ile kültürlü. Verilen bu sınırlı doku malzeme cerrahi veya biyopsi sırasında elde edilir, hasta kaynaklı tümör dilim kültürler duruma getirilmesi yeterli sayıda çoğaltma örnek alma zorlukları nedeniyle zor olabilir. Ayrıca, veri tekrarlanabilirlik aynı zamanda tarafından hastaya örnek heterojenite, özellikle tümör hücreleri fibrotik bölgeler veya stromal infiltratlar gibi nekrotik doku bileşenleri karşı yüzdesi olarak telaffuz meydan. Son olarak, tümör dilimler halinde tanı ayarlarını uygulanması için hangi ilaç dilim explants ön arıtma biyopsileri, yanıtlarında eşleşen tedavi sonrası vivo içinde yanıt-e doğru ölçüde incelenmesi gerekir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank’s Balanced salt solution (HBSS)	Sigma	H6648
Penicillin Streptomycin solution	Thermo Fischer Scientific	15140-122
Ham's F-12 medium	Thermo Fischer Scientific	21765-037
Glucose	VWR	101174Y
FBS	Thermo Fischer Scientific	10270-106
Glutamine 200mM	Thermo Fischer Scientific	25030-024
Cyanoacrylate adhesive (GLUture)	Abbott	32046-90-1
Leica VT1200 S vibrating blade microtome	Leica Biosystems	14048142066
Slicing blade	VWR	PERS60-0138
Titanium grids	Albamma Research and Development	MA0036
Slice incubation unit	Albamma Research and Development	MD2500
10 cm tissue culture plate	Sarstedt	83.1802
24-well plate	Sarstedt	83.1836
6-well plate	Sarstedt	83.1839
Neolus Hypodermic Needles	Terumo Neolus	NN2525R
50 mL falcon tube	Greiner	227261
PBS	Lonza	BE17-517Q
Formaldehyde	Fisher	F/1501/PB08
Trifold histo cassette paper	Cancer Diagnostics	DX26280
Histo cassettes	VWR	720-2199
KOS The microwave multifunctional tissue processor	Milestone SRL	CAT307EN-003
Microtome	Thermo Fischer Scientific	HM355S
Superfrost Ultra plus slides	VWR	631-0099
BSA	Sigma	A2153
NGS	Thermo Fischer Scientific	16210-064
Citric acid	Sigma	C1909
PT-Module	Thermo Fischer Scientific	A80400012
Hematoxylin for H&E staining	Merck	1.09249.0500
Hematoxylin for counter staining	Dako	S3309
Eosin	Sigma	E4382
NKX2-1 antibody	Abcam	ab133638	Lot Number: GR98031-12
pERK 1/2 antibody	Cell Signaling Technologies	CST 4370	Lot Number: 17
p4EBP1 antibody	Cell Signaling Technologies	CST 2855	Lot Number: 20
BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody	ImmunoLogic	VWRKDPVR-110HRP
Mounting medicum pertex	VWR	MEDT41-4021-00
DAB	ImmunoLogic	VWRKBSO4-110
Dactolisib (NVP BEZ-235)	Selleckchem	S1009
Selumetinib (AZD2644)	Selleckchem	S1008
Pannoramic 250 slide scaner	3DHISTECH
MATLAB	MathWorks		https://se.mathworks.com/products/matlab.html
3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER	3DHISTECH		https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer
Adobe Photoshop CS6	Adobe		https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s
Fiji-ImageJ	ImageJ		https://imagej.net/Fiji
CellProfiler	CellProfiler cell image analysis software		http://cellprofiler.org/