Güvenilir ve tekrarlanabilir kritik ölçekli gelen bir Segmental femur kusur manken özel eksternal fiksatör ile stabilize Sıçanlarda

Özet

Vivo memeli modellerinin kritik ölçekli kemik defektleri ortopedik tedavi ve şifa mekanizmaları eğitim araştırmacılar için gereklidir. Burada, bir protokol tekrarlanabilir, gelen bir segmental, femur kusurları eksternal fiksasyon kullanarak stabilize Sıçanlarda oluşturulması için tanıtmak.

Özet

Ortopedik araştırma ağır kemik içinde vivo şifa mekanizmaları çalışma gibi yeni tedavi teknikleri araştırmak için hayvan modellerinde dayanmaktadır. Segmental kusurları kritik ölçekli klinik olarak tedavi etmek için zorlu ve araştırma çabalarının güvenilir, Ambulatuvar küçük bir hayvan model bir segmental femur kusur faydalanabilir. Bu çalışmada, biz bir eksternal fiksatör ile stabilize bir sıçan uyluk bir 5 mm kritik diaphyseal kusur tutarlı ve tekrarlanabilir oluşturulması için en iyi duruma getirilmiş bir cerrahi Protokolü mevcut. Diaphyseal ostectomy 4 Kirschner telleri bicortically, yerleştirmek için özel bir jig kullanarak hangi bir adapte eksternal fiksatör aygıtla stabilize gerçekleştirildi. Salınan bir kemik testeresini kusur oluşturmak için kullanılan. Yalnız bir kollajen sünger veya rhBMP-2'de batırılmış bir kollajen sünger defekt implante ve kemik şifa 12 hafta boyunca ilerlemenin kullanarak izlenir. 12 hafta, sıçan kurban edildi sonra histolojik analiz eksize denetimde gerçekleştirilmiş ve kalça tedavi. RhBMP-2 tedavi bir remodeling periosteal duygusuz ve yeni kemik oluşumu vermiştir iken sadece kollajen sünger içeren kemik defektleri sigara-Birliği'nde, sonuçlandı. Hayvanlar implantasyonu sonrası de kurtarılan ve harici fiksasyon 12 hafta boyunca femoral kusurları sabitleme başarılı oldu. Bu aerodinamik cerrahi model kemik şifa çalışma ve test yeni ortopedik Biyomalzeme ve rejeneratif tedaviler içinde vivokolayca uygulanabilir.

Giriş

Ortopedik travma cerrahisi karmaşık kırıklar geniş bir tedavi üzerinde duruluyor. Kritik diaphyseal gelen bir segmental kemik kusurları klinik olarak çevreleyen kas ve kapaklarini azalma rejeneratif yeteneği hem de yetersizliği nedeniyle tedavi etmek zor kanıtlamıştır angiogenez¹yerelleştirilmiş. Modern tedavi teknikleri, Kemik greftleme ile operatif fiksasyon içerir (Masquelet) Kemik greftleme, kemik taşıma, füzyon veya amputasyon^2,3,4gecikmeli. Ambulatuar işlevi ile iyi işleyen distal ekstremitelerde, onların travma sonrası korunmuş olan çoğu hasta uzuv hurda açıkça daha iyi bir tedavi seçeneği⁵mevcuttur. Bu hurda tedaviler genellikle uzun tedavi boyunca aşamalı cerrahi müdahaleler gerektirir. Bazı yazarlar bu eksternal fiksasyon implante internal fiksasyon azalmış doku hasarı nedeniyle bu uygulamalar için azalmıştır implantasyon sırasında yüzey alanı ve artan Postoperatif olarak ayarlanabilir, ile karşılaştırıldığında üstün olduğunu düşündürmektedir fiksatör⁶. Ancak, bir prospektif randomize kontrollü bu tartışmalara ciddi açık kırık tibia⁷eksternal fiksasyon karşı iç gidermek için şu sıralar başlatıldı. Ne yazık ki, seçili her iki tedavi ile önemli komplikasyon ve başarısızlık oranları^8,9devam etmektedir. Segmental kemik kaybı ile ilgili olarak her iki tedavi yöntemi ile cerrah önemli sorunlar mevcut gelen bir segmental diaphyseal kusurları ile uğraşmak zorundadır. Düzeltmeler segmental kusurların kemik sabitleme en üst düzeye çıkarmak ve aynı anda Osteojenik işlemi^10,11geliştirmek gerekir.

Klinik önemi nedeniyle, henüz kritik ölçekli diaphyseal gelen bir segmental kusurların düşük ses etkili bir tekrarlanabilir bir hayvan modelini tedavi teknikleri geliştirmek ve sonuçta klinik sonuçlar geliştirmek araştırma ekipleri etkinleştirmek gereklidir. Araştırmacılar vivo içinde fizyolojik şifa mekanizmaları bir memeli hayvan modelinde çalışması gerekir. ^12,13,14,15eksternal fiksasyon zaten böyle modelleri mevcut iken, tedavi edilmeyen hayvanlarda seçimi ile azalma maliyetleri sendikalar için daha güvenilir bir yöntem sağlamak umut uygun fiyatlı fiksatör malzeme ve anahat gelecek çalışmalar kolay uygulaması basit bir cerrahi protokolü. Bu iletişim kuralı öncelikli hedefi de, fareler bir kritik diaphyseal kusur bir güvenilir ve tekrarlanabilir model kurmaktır. Prosedürü sabitleme ve sıçan uyluk içinde 12 hafta boyunca şifa kemik değerlendirilmesi tarafından incelendi. Dahil ikincil hedefleri: cerrahi yaklaşım ve sabitleme basitleştirmek ve sağlanması uygun bir model olarak bir maliyet etkin olarak olası, hayvan bakımı etik yapma. Yazarlar ve araştırma ekibi ile farklı Biyomalzeme ve segmental bu üründe şifa geliştirmek için potansiyel rejeneratif tedaviler bir dizi ön deneyler yaptı.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan fareler travma yönergelere uygun olarak günlük bakım ötenazi hayvanlar için alınan: 2013 Edition¹⁶. Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Wisconsin-Madison Üniversitesi değerlendirildi ve proje başlamadan önce bu deneysel protokol onayladı.

1. hayvanlar

1. Yaklaşık 350 gr ağırlığında outbred Sprague-Dawley erkek rats kullanın.

2. hazırlık, kemik morfogenetik Protein-2 (rhBMP-2) batırılmış sünger iskele

Not: İskele hazırlık femur implantasyon hemen önce gerçekleşmesi gereken (bkz. Adım 6,14).

1. Kollajen sünger, liyofilize rhBMP-2 ve sulandırma¹⁷için steril su içeren bir kurulan rhBMP-2 kemik greft kit kullanımı için üreticinin yönergelerini izleyin. Kısırlık Bakımı, rhBMP-2 için bir konsantrasyon 1.5 mg/mL steril su ile yeniden oluşturma.
2. Steril makas ve steril bir cetvel, 5 mm x 3 mm x 3 mm kusur sığacak şekilde yeniden şekillendirmek için rhBMP-2 sırılsıklam kollajen sünger gelene dek kırpın.
3. Böylece bu emilir kullanarak, rhBMP-2 çözüm kollajen sünger üzerinde eşit olarak dağıtabilmenizi.

3. özel eksternal fiksasyon aygıt hazırlanması

Not: 1A rakam boyutları daha tam listesi için bkz.

1. Alüminyum levha stok (türü 6061, 0,088" kalınlığı) 2-kesilmiş parçalar (1.4" x 6") bir Yapboz veya diğer uygun aracı kullanarak.
2. Freze makinesi tek parça monte ve bir 1/8" 90 °-nokta karbür matkap değirmen kullanılarak, dört 'V' grooves (0.035" derin) kesme boyuna. Diğer parça keser özgür bırakın.
3. Genişliğinin 0.3" iki bireysel plakalar kesilmiş parçalar (şekil 1B). Ölçü ve Matkap üzerindeki vida delikleri 4-40 iş parçacığı için. 4-40 iplik ile 'V' yivli plaka dokunun. #4 vida vücut tatbikat oluklar olmadan plaka matkap.
4. Köşeleri yuvarlak ve ağırlığı (şekil 1 c) azaltmak için iki adet kum.
5. Oluklar düz plaka (şekil 1 d) karşı aynı hizada olması ile birlikte 4-40, 18-8 paslanmaz çelik düğmesini baş cap vidaları (0,25") adet vida

4. anestezik yordam ve Analjezi

1. Anestezi indüksiyon Odası 4 L O₂/min ile % 4 isoflurane teslim fareyi yerleştirerek neden.
   Dikkat: Araştırma personeli anestezik gaz zehirlenmesinden önlemek ve uygun başlık ve havalandırma Laboratuvarı korumak gerekir.
2. Fareyi iyileştiren refleks kaybeder sonra fareyi odasından kaldırın, burun konisi eklemek ve idame dozu anestezi (O₂ teslim oran için 2-3 L/dak ve % 0,8 isoflurane) burundan yerleştirin.
3. Fareyi Isıtma yastığını veya hipotermi önlemek için Isınma ışık altında ekleyin.
4. Anestezi yeterli derinliği parmak pinching veya palpebral refleks testi onaylayın.
5. Yağlama gözleri kornea dışarı kurutma önlemek için geçerlidir.
6. Genişletilmiş sürüm buprenorfin (1 mg/kg) bir subkutan enjeksiyon gövde/patolojisi analjezi sağlamak ilâ 3 gün boyunca ameliyatı takiben cerrahi siteye, uzakta sıçan sunmak.

5. aseptik hazırlık ve antibiyotik preventatives

1. 13^inci kaburga, ayak, dorsal orta hat ve ventral orta hat kenar boşluklarını kullanmak hindleg çevresini tıraş.
2. Traş fırçalayın alanı % 10 povidone-iyot % 70 oranında takip ile batırılmış steril 2 x 2 gazlı bez kullanarak alkol (4 kez her biri, alternatif).
3. Sülfadiyazin (20 mg/kg) bir kas içi enjeksiyon içine operatif kuadriseps yönetmek.
4. Enrofloksasin (0.25 mg/ml) içme suyunda postoperatively sürekli antibiyotik koruma için 7 gün için yönetmek.
5. Fareler PIN yolu enfeksiyonları önlemek için çalışma süresi için tıbbi besleme (örneğin, Uniprim) yerleştirin.
6. Çift Kişilik antibiyotikli bir krem cilt-pin arabirim için bir kez her gün postoperatively 3 gün boyunca geçerlidir.
   Not: herhangi bir harici fiksasyon PIN önlemek veya hangi enfeksiyon gelişmesine katkıda bulunabilir gevşeme kelepçe.

6. cerrahi müdahale

Not: uyumlu bir çaba bir steril alan ve çalışma alanı korumak ve steril tekniği kasanın tamamı boyunca takip edin.

1. Delikli, açık yapışkan örtüsü ve steril bir alan oluşturmak için steril havlu kapak cerrahi tezgah traş bacak uzatmak.
2. Uyluk kemiği muayene et ve proksimal femur, büyük trochanter patella uzanan deri yoluyla anterolateral kesik oluşturmak için #15 bıçak kullanın.
3. Dikkatle yanal bacak fasya yanal uyluk maruz kadar vastus okuli kas kuadriseps, anteriorly hamstrings özafagusu ayırmak için intermuscular septum boyunca deşmek. Büyük trochanter tarihinde kaçıran gluteal tendon ekleme korumak.
4. Dikkat et, Atravmatik sirkumferansiyel yumuşak doku diseksiyon gerçekleştirmek ve yanal yüzeyde başlayan onun orta diaphysis, femur bulaşmasına neden. Bunu yapmak için #15 bıçak bıçak kemik yüzeyine kontur karşı paralel tutarak temel kemik uzak kas hafifçe kesmek için kullanın. Kas maruz kemik uzak disseke gibi kaldırıp ulaşana kadar 7-10 mm Merkezi diaphysis, yumuşak doku ostectomy için hazırlamak için tüm tarafların temizlenmiş oldu femur şaft devam periosteal asansörü kullanın.
   Not: medial femoral nörovasküler demet yaralanma kaçının.
5. Dört 1.0 mm Kirschner (k) teller takın: 2 proksimal ve 2 lateral femur dikey femur distal medial için düz lateral yönetti. Her iki cortices (bicortical) yeterli istikrar (şekil 2A) için tüm pins meşgul olun.
6. En distal iğne ile ilk, sadece lateral epicondyle düzeyinde başlar. Yer jig yanal distal femur boşaltır ve 1.0 dişli ucu k-dinleme cihazı takın.
7. Kemikteki jig konumunu koruyarak, en proksimal PIN jig delikleri alan kemik girmek nerede tanımlayın. Konum belirlendikten sonra dikkatle paralel gluteal tendon lifleri için doku geçmesine, proksimal pin için küçük bir boşluk oluşturmak için gerektiğinde böylece tendon iyatrojenik zarar en aza indirerek deşmek. 1.0 mm evreli olmayan k-tekrar pin her iki cortices (şekil 2B) yürütmektedir sağlanması dinleme cihazı bu boşluğu içinde matkap.
8. Kemik ile temas halinde görürse oyun konumunu korumak ve iki 1.0 mm dişli k-telleri, gelecekteki kusuru sitesinde her iki tarafında bir matkap. Her iki cortices (şekil 2C) iğne meşgul olun.
9. Düzey 1 cm cilt üzerinde bar eksternal fiksatör yerleştirin ve sıkıca, yer çubuğunda kilitleme canı cehenneme. Aşırı PIN uzunlukları (şekil 2B) küçük.
10. Ostectomy (kusur oluşturma) için küçük, eğri Retraktörü anterior ve posteiror uyluk çevresinde yerleştirerek çevreleyen yumuşak dokusu, kas ve nörovasküler demet korumak için hazır olun. ~ 5 mm sagittal salınan kullanan testere, çok dikkatli bir 5 mm segmental kusur orta diaphysis aracılığıyla oluşturun. Bir ışık, gereksiz kırığı (şekil 2E) önlemek için testere ile bile basınç uygulayın.
11. Termal Kemik nekrozu önlemek için kusur oluşturulurken sulama (oda sıcaklığında % 0,9 steril normal salin (NS)) gerektiği gibi az miktarda uygulayın.
12. Defekt oluşturduktan sonra NS 10 mL kullanarak yara floş.
13. 0.1 mL % 0.25 bupivacaine epinefrin (1: 200, 000) ile bir analjezik ve vasoconstrictor olarak yara için yönetmek.
14. INSERT kollajen sünger veya rhBMP-2 (5 x 3 x 3 mm) İskele defekt içine ( Adım 2) üzerinden sünger batırılmış. Her iskele uzunluğu ve konumda kalın sünger yardım kusur, hacmi yayılmasını uygun boyutta olması.
    Not: Bu noktada, mRNA kompleksleri hazırlanacak ve bioluminescence görüntüleme gerçekleştirmek eğer 7,1-7,3 aşağıdaki adımlarda açıklandığı şekilde enjekte.
15. 4-0 absorbe dikiş ile basit kesintiye uğramış desen kullanarak kas uçak kapatın. 4-0 absorbe dikiş ile çalışan bir subcuticular düzeni kullanmak cilt katman kapatın ve çıkıntılı pimleri etrafında boşlukları kapatmak için tutkal cilt.
16. Burun konisi, Isıtma yastığını üzerinde kalan fareyi kaldırın ve sürekli fare sürekli dik bir duruş korumak için güçlü olana izlemek. Bu noktada, kurtarmak için temiz bir kafese koyun.

7. complexed mRNA ve bioluminescence görüntüleme hazırlanması

Not: Transfection mRNA kompleksleri ile ameliyat 1 gün öncesine ışıldama görüntüleme sırasında yapılmalıdır. Steril teknikleri mRNA işlerken kullanın.

1. Mix 10 µL mRNA lipidik transfecting Aracısı 30 µL ile Gaussia luciferase (hisse senedi konsantrasyon 1 µg/µL) için kodlama.
2. Forma mRNA-lipid kompleksleri için oda sıcaklığında en az 5 min için kuluçka tarafından izin. Lipidik transfecting Ajan mRNA molekülleri onları istikrarı ve transfection verimliliği arttırmak yoğunlaşmak.
   Not: kompleksleri hemen kullanılmazsa, onları buz en fazla 1 saat için saklayın.
3. Filtre uygulanmış ipuçları ile donatılmış bir 20 µL pipet kullanarak, mRNA kompleksleri defekt, distal ve proksimal uçları birimin sırasıyla enjekte et.
4. Ertesi gün, görüntüleme önce 3 dk inhale isoflurane adım 4.1 daha önce açıklandığı gibi kullanarak fare anestezi.
5. Fareyi bir bakım isoflurane (% 0,8 isoflurane, O₂ teslim oranı 2-3 L/dak) teslim bir burun konisi ile donatılmış oda Imaging vivo yerleştirin.
6. Coelenterazine 4 mg/kg vücut ağırlığı defekt birbirine bir doz, serum resuspended enjekte.
7. Bioluminescence görüntüleri görüntüleme sistemi (İVIS) göre üreticinin yönergeleri¹⁸ in vivo elde.

8. görüntüleme Protokolü

1. Düz Radyografi makine, bir x-ışını sistemi¹⁹, ayarlama sonra anestezi inhale isoflurane yukarıda açıklanan (bkz: Adım 4.1) kullanarak fare ve fare ile inhale isoflurane (% 0,8 isoflurane, O₂ burun konisi yerleştirin teslimat oranı 2-3 L/dak) için bir hastanın (AP) uyluk grafisi.
   1. Fareyi sternal recumbency, cerrahi hindlimb ileri, kalçada esneme ilerlemek ve ortak bastırmak. Yaklaşık 90 ° bastırmak ortak esnek. Pençe plantar yan aşağı, vücut duvara yakın teyp. Uyluk kemikleri superimposing olasılığını ortadan kaldırmak için gelen tibia öne getirin. Kalça hafif kaçırma sağlamak için kasık bölgesinde yarı saydam sünger (yaklaşık 15 mm kalınlığında) yerleştirin. Sonra uyluk ön-arka (Kaudal kafatası) görüntüsünü elde etmek.
2. Bu AP uyluk radyografik görünümü hemen ardından cerrahi, 4 hafta ve 12 hafta tekrarlayın. Gazlı bez ve bant hayvanın ekstremite kalite ve tutarlı görüntüleme için uygun şekilde konumlandırmak için kullanın.
3. Burun konisi fareyi kaldırın ve sürekli fare sürekli dik bir duruş korumak için güçlü olana izlemek. Sonra kafesin içine yerleştirin.

9. histolojik yordamı

1. Fareler ile inhale CO₂ travma etik standartları¹⁶göre bir odasında ötenazi.
2. Aşağıdaki ötenazi, hindlimb tıraş, Cilt operatif ekstremite kaldırmak ve uyluk, kalça disarticulate. Dikkatli bir şekilde tüm yumuşak doku (tüm kas, tendon ve bağ da dahil olmak üzere) operatif uyluk çıkarın. Şifa bölge diseksiyon sırasında yanlışlıkla zararlardan korumak için kusur sitesi çevreleyen kas sadece ince bir tabaka bırakın.
3. Uyluk kemiği % 10'luk yer tarafsız arabelleğe alınmış fiksasyon için izin vermek için Formalin 3-4 gün için oda sıcaklığında. 15:1 formalin doku hacim oranı için tutun. Çözüm fiksasyon işlemi boyunca yarıya kadar bir kez değiştirin.
4. Uyluk kemiği bir çözümde % 15 Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 6,5 3-4 hafta boyunca decalcify. Kalsiyumun bitiş noktası belirlemek için seri halinde ilerlemenin toplamak.
5. Uyluk kemiği boyuna bir kesim anterior posterior-sagittal düzlemde ile bisect. Doku standart parafin gömme ve Hematoksilen ve Eozin (H & E) boyama için gönderin.
6. H & E slaytlar bir patolog histolojik değerlendirme için gönder.

Sonuçlar

Ameliyat yaklaşık bir saat içinde bir Yardımcısı Yardımı ile bir cerrah tarafından gerçekleştirilmiştir. Cerrahi optimizasyonu sonra içi ve ameliyat sonrası komplikasyonlar Ģunları büyük ölçüde minimize ve tutarlı büyüklüğünü (5 x 3 x 3 mm) ve femur kusurların yerelleştirme jig cihazları kullanın. Fareler ve anestezi Ambulatuar hemen aşağıdaki kurtarma vardı değiştirilen herhangi bir davranış kalıpları için görünmedi; onların yürüyüş antal...

Tartışmalar

Küçük hayvan modelleri tam Kemik kırıkları gibi ortopedik yaralanma mekanizmaları osteogenesis ve Biyomalzeme²⁰tedavi potansiyelini değerlendirmek araştırıyor araştırma etkinleştirin. Bu çalışmada bir sıçan tanıttı segmental kusur modeli stabilize bir laboratuar ve Biyomedikal Mühendisliği ekibi kolayca daha fazla taşıma osteosynthetic kemik onarım çalışmaları için yeniden oluşturabilirsiniz özel bir eksternal fiksatör tarafından.

Önc...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sterile Saline	Baxter	2F7124	Used for irrigating wound and rehydration
10% Iodine/Povidone	Carefusion	1215016	Used to prep skin
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	89370094	Used as fixative
1mm non-threaded kirschner wire	DePuy Synthes	VW1003.15	Sterilized, used for the most proximal pin
1mm threaded kirschner wire	DePuy Synthes	VW1005.15	Sterilized, used for the 3 most distal pin slots
2x2 gauze	Covidien	4006130	Sterilized, used to prep skin and absorb blood
4-0 Vicryl Suture	Ethicon	4015304	Used to close muscle and skin layers
4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws	Generic		External fixator assembly
4200 Cordless Driver	Stryker	OR-S-4200	Used to drill kirschner wires
4x4 gauze	Covidien	1219158	Sterilized, used to absorb blood
70 % Ethanol			Used to prep skin
Baytril	Bayer Healthcare LLC, Animal health division	312.10010.3	Added to water as an antibiotic
Cefazolin	Hikma Pharmaceuticals	8917156	Pre-op antibiotic
CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU)	TriLink Biotechnologies	L-7205	Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo
Double antibiotic ointment	Johnson & Johnson consumer Inc	8975432	Applied to pin sites post-op as wound care
Dual Cut Microblade	Stryker	5400-003-410	Used to create 5mm defect in femur
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Fisher	BP120-500	Used to decalcify bone to prep for histology
Extended Release Buprenorphine	ZooPharm		Used as 3 day pain relief
Fenestrated drapes	3M	1204025	Used to establish sterile field
Handpiece cord for TPS	Stryker	OR-S-5100-4N	Used to create 5mm defect in femur
Heating pad	K&H Pet Products	121239	Rat body temperature maintenance
Hexagonal head screwdriver	Wiha	263/1/16 " X 50	External fixator tightening
Induction chamber	Generic		Anesthesia for rats
Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2	Medtronic	7510200	Clinically relevant treatment used as positive control
Isoflurane	Clipper	10250	Anesthesia for rats
IVIS	Perkin Elmer	124262	Bioluminescence imaging modality
Jig	Custom		Used to place bicortical pins
Lipofectamine MessengerMAX	Fisher Scientific	LMRNA003	mRNA complexing agent that enables mRNA delivery
Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000))	APP Pharmaceuticals, LLC	NDC 63323-468-37	Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction
Sterile water	Hospira	8904653	Used as solvent for cefazolin powder
Titanium external fixator plates	Custom		Prepared in house with scrap titanium and milling machine
Total Performance System (TPS) Console	Stryker	OR-S-5100-1	Used to create 5mm defect in femur
TPS MicroSaggital Saw	Stryker	OR-S-5100-34	Used to create 5mm defect in femur
Ultrafocus Faxitron with DXA	Faxitron		High resolution radiographic imaging modality
Uniprim rat diet	Envigo	TD.06596	Medicated rat diet
Universal Handswitch for TPS	Stryker	OR-S-5100-9	Used to create 5mm defect in femur
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469	Skin closure