Un modèle fiable et reproductible taille critique segmentaire fémorale défaut chez les Rats stabilisé avec un fixateur externe personnalisée

Résumé

Modèles de mammifères in vivo des défauts osseux taille critique sont indispensables pour les chercheurs qui étudient les mécanismes de guérison et de traitements orthopédiques. Ici, nous introduisons un protocole pour la création de défauts reproductibles, segmentaires, fémorales chez les rats stabilisés à l’aide de fixation externe.

Résumé

Recherche orthopédique s’appuie fortement sur des modèles animaux pour étudier les mécanismes de guérison en vivo l’OS mais aussi enquêter sur les nouvelles techniques de traitement. Taille critique segmentaires défauts sont difficiles à traiter cliniquement, et les efforts de recherche pourraient bénéficier d’un modèle animal petit fiable, ambulatoire d’une anomalie fémorale segmentaire. Dans cette étude, nous présentons un protocole chirurgical optimisé pour la création cohérente et reproductible d’un défaut critique diaphysaire de 5 mm dans un fémur de rat stabilisé avec un fixateur externe. L’ostéotomie diaphysaire a été réalisée à l’aide d’un gabarit personnalisé de placer 4 Kirschner fils bicortically, qui ont été stabilisées avec un dispositif adapté de fixateur externe. Une scie à OS oscillante a été utilisé pour créer le défaut. Une éponge de collagène seule ou une éponge de collagène imbibés rhBMP-2 a été implantée dans le vice et la guérison osseuse a été suivie sur une période de 12 semaines à l’aide de radiographies. Après 12 semaines, les rats ont été sacrifiés, et analyse histologique a été effectuée sur le contrôle excisé et traité des fémurs. Des défauts osseux contenant uniquement des éponges de collagène a produit non syndiquées, rhBMP-2 conduit la formation d’un remodelage de l’OS périostique impitoyables et nouveau. Animaux bien récupérée après l’implantation et externe fixation réussi à stabiliser les défauts fémorales pendant 12 semaines. Ce modèle chirurgical simplifié pourrait être facilement appliqué pour étudier la guérison osseuse et tester de nouveaux biomatériaux orthopédiques et thérapies régénératives in vivo.

Introduction

Chirurgie orthopédique traumatologique met l’accent sur le traitement d’un large éventail de fractures complexes. Critique osseuse segmentaire diaphysaire défauts sont avérés difficiles à traiter cliniquement en raison de la diminution de la capacité régénératrice du muscle environnant et de périoste ainsi que l’échec de localisé angiogenèse¹. Les techniques modernes de traitement comprennent la fixation du dispositif avec une greffe osseuse, retardé une greffe osseuse (masquelet service), transport osseux, fusion ou amputation^2,3,4. Dans la plupart des patients qui ont la fonction ambulatoire conservée après leur traumatisme, avec des branches distales fonctionne bien, récupération de la branche est clairement un meilleur traitement option⁵. Ces traitements de sauvetage exigent souvent des interventions chirurgicales mises en scène sur un parcours long traitement. Certains auteurs ont suggéré que la fixation externe est supérieure par rapport à la surface de la fixation interne pour ces applications en raison des dommages tissulaires une diminution pendant l’implantation, diminuée implantée et le réglage postopératoire accru de le fixateur⁶. Cependant, un essai contrôlé randomisé prospectif est actuellement d’en cours pour aider à clarifier cette controverse des internes ou externe fixation de graves fractures ouvertes du tibia⁷. Malheureusement, avec soit le traitement choisi, les taux de complication et échec significatifs persistent^8,9. Avec une méthode de traitement, à l’égard de la perte osseuse segmentaire, le chirurgien doit composer avec les défauts diaphysaires segmentaires qui présentent des défis importants. Correction d’irrégularités segmentaires doit maximiser la stabilisation osseuse et en même temps améliorer les processus ostéogénique^10,11.

En raison de l’importance clinique, mais le volume plus faible, des défauts de segmentaires diaphysaires de taille critique, un modèle animal efficace et reproductible est nécessaire pour permettre à des équipes de recherche faire avancer les techniques de traitement et améliorer les résultats cliniques. Les chercheurs doivent étudier en vivo physiologique mécanismes guérison chez un modèle animal mammifère. Ces modèles de fixation externe déjà parmi les^12,13,14,15, nous espérons offrir une méthode plus fiable pour les non-syndicats chez les animaux non traités, diminution des coûts grâce au choix de matériaux de fixateur abordable et esquisse un protocole chirurgical simple d’application facile pour les études à venir. Le principal objectif du présent protocole est d’établir un modèle fiable et reproductible d’un défaut critique diaphysaire chez les rats. La procédure a été évaluée en évaluant la stabilisation et l’os de guérison dans les fémurs de rat pendant 12 semaines. Les objectifs secondaires compris : faire un modèle abordable comme un coût efficace que possible, simplifiant l’approche chirurgicale et la stabilisation et d’assurer éthiques soin des animaux. Les auteurs et l’équipe de recherche réalisé des expériences préliminaires avec une gamme de différents biomatériaux et thérapies régénératives potentiels afin d’améliorer la guérison dans ce défaut segmentaire.

Protocole

Les rats utilisés dans cette étude ont reçu des soins quotidiens selon les directives de l’AVMA pour l’euthanasie des animaux : 2013 édition¹⁶. Le Comité de l’urbanisme à l’Université du Wisconsin-Madison et d’institutionnels animalier évalué et approuvé ce protocole expérimental avant le début du projet.

1. les animaux

1. Utilisez les rats mâles Sprague-Dawley non consanguines, pesant environ 350 g.

2. préparation de Bone Morphogenetic protéine-2 (rhBMP-2) imbibé d’éponge échafaudages

NOTE : Préparation de l’échafaudage doit se produire juste avant l’implantation dans le fémur (voir étape 6.14).

1. Suivez les instructions du fabricant pour l’utilisation d’une trousse de greffe établi rhBMP-2 OS contenant une éponge de collagène, lyophilisée rhBMP-2 et l’eau stérile pour reconstitution¹⁷. Maintien de la stérilité, reconstituer la rhBMP-2 avec l’eau stérile à une concentration de 1,5 mg/mL.
2. À l’aide de ciseaux stériles et un dirigeant stérile, couper l’éponge rhBMP-2 collagène trempé à remodeler pour s’adapter à une 5 mm x 3 mm x 3 défaut de mm.
3. À l’aide d’une seringue, répartir la solution rhBMP-2 sur l’éponge de collagène afin qu’il soit absorbé.

3. préparation du dispositif de fixation externe personnalisée

Remarque : Voir la Figure 1 a pour la liste plus complète des dimensions.

1. Couper en aluminium stock (type 6061, 0,088" épaisseur) de la feuille à deux pièces (1.4" x 6") à l’aide d’une scie sauteuse ou tout autre outil approprié.
2. Monter une pièce dans la machine de fraisage et, à l’aide d’un moulin de foret de carbure de 90°-point 1/8", coupez quatre rainures « V » (profondeur de 0,035") dans la longueur. Laisser l’autre morceau gratuit de coupes.
3. Couper des plaques individuelles de 0.3" largeur des deux pièces (Figure 1 b). Mesurer et percer les trous de vis pour 4-40 fils. Tapoter la plaque avec des rainures de « V » avec le fil 4-40. Percer la plaque sans rainures pour une perceuse de corps #4 vis.
4. Poncer les deux pièces à coins arrondis et à réduire le poids (Figure 1).
5. Visser les pièces ainsi que de 4-40, 18-8 inox bouchon vis à tête ronde (0,25") afin que les cannelures soient à égalité contre la plaque ordinaire (Figure 1)

4. analgésie et procédure anesthésique

1. Induire l’anesthésie en plaçant le rat dans la chambre d’induction offrant 4 L O2/min avec 4 % isoflurane.
   Attention : Personnel de recherche doit éviter l’inhalation de gaz anesthésique et maintenir la bonne hotte et ventilation dans le laboratoire.
2. Retirer le rat de la chambre après que le rat perd le réflexe de redressement, fixez une extrémité conique et placez à la dose d’entretien de l’anesthésie par le nez (O₂ débit à 2-3 L/min et 0,8 % isoflurane).
3. Placez le rat sur le coussin chauffant ou la lumière-réchaud pour éviter l’hypothermie.
4. Confirmer la profondeur adéquate de l’anesthésie par pincement de l’orteil ou le réflexe palpébral.
5. S’applique à lubrification aux yeux pour éviter le dessèchement de la cornée.
6. Livrer une injection sous-cutanée de la buprénorphine à libération prolongée (1 mg/kg) sur le tronc/dos du rat, loin du site chirurgical, à fournir une analgésie jusqu'à 3 jours après la chirurgie.

5. aseptique préparation et antibiotiques préventifs

1. Raser la zone autour de hindleg à l’aide de la 13^ème côtes, le pied, la ligne médiane dorsale et la ligne médiane ventrale comme marges.
2. Zone de broussailles rasé à l’aide de 2 x 2 compresses imbibées de polyvidone iodée 10 % suivie par 70 % EtOH (4 fois chacun en alternance).
3. Administrer une injection intramusculaire de céfazoline (20 mg/kg) dans les quadriceps du dispositif.
4. Administrer l’enrofloxacine (0,25 mg/ml) dans l’eau potable pendant 7 jours après l’opération pour une protection antibiotique continue.
5. Placez des rats sur les aliments médicamenteux (p. ex., Uniprim) pour la durée de l’étude pour prévenir les infections des voies broche.
6. Appliquer double onguent antibiotique à l’interface de peau ou de broches une fois par jour pendant 3 jours après l’opération.
   Remarque : Évitez d’aucune broche de fixation externe ou serrez relâchement qui peut contribuer au développement d’une infection.

6. intervention chirurgicale

Remarque : Assurez-vous un concertée aux efforts afin de maintenir un champ stérile et l’espace de travail et de suivre la technique stérile tout au long de l’intégralité de l’affaire.

1. Étendre les jambes rasée drapé fenêtrée, collant transparent et banc chirurgicale couverture en serviettes stériles pour créer un champ stérile.
2. Palper le fémur et utiliser une lame #15 pour créer une incision de la face antérolatérale à travers la peau qui s’étend de la rotule au grand trochanter au fémur proximal.
3. Soigneusement inciser le carénage latéral de la jambe le long du septum intermusculaire pour séparer le muscle vaste externe du quadriceps antérieurement les ischio-jambiers vers l’arrière jusqu'à ce que le fémur latéral est exposé. Préserver l’insertion de fessier tendon abducteur sur le grand trochanter.
4. Effectuer une dissection de tissus mous circonférentielle atraumatique prudent et exposer le fémur à son milieu diaphyse commençant sur la surface latérale. Pour ce faire, utiliser une lame #15 pour couper délicatement le muscle à l’os sous-jacent en gardant la lame parallèle contre le contour de la surface osseuse. Utiliser un ascenseur périostique pour soulever le muscle à l’OS exposé comme il est disséqué et continuer autour de la tige fémorale jusqu'à 7 à 10 mm de la diaphyse central a été effacé des tissus mous sur toutes les parties à se préparer à l’ostéotomie.
   Remarque : Éviter de blesser le paquet vasculo-nerveux fémoral médial.
5. Insérez les quatre fils de Kirschner (k) de 1,0 mm : 2 proximale et distale dans le fémur perpendiculaire sur le fémur latéral, 2 dirigé droit latéral à médial. S’assurer que toutes les broches s’engager les deux cortex (bicorticales) pour une stabilité suffisante (Figure 2 a).
6. Commencer d’abord, avec la tige distale plus juste au niveau de l’épicondyle latéral. Place jig flush sur le fémur distal latéral et insérez un extrémité filetée 1,0 k-fil.
7. Maintenant la position du gabarit sur l’os, identifier où la broche plus proximale pénétrera dans l’OS basé sur les trous du gabarit. Une fois que la position est déterminée, soigneusement inciser parallèle aux fibres du tendon fessier que nécessaires pour créer un petit écart dans le tissu pour la goupille de proximal à passer à travers, minimisant ainsi les dommages iatrogènes au tendon. Percer un 1,0 mm non filetée k-fil dans cet intervalle, assurant encore une fois que la goupille s’enclenche les deux cortex (Figure 2 b).
8. Maintenir la position de la jig au contact de l’os et percer deux 1,0 mm fileté Kirschner, une de chaque côté du site du défect futures. S’assurer que les broches s’engage les deux cortex (Figure 2).
9. Placez le fixateur externe bar niveau 1 cm au-dessus de la peau et vissez, blocage de la barre en place. Couper les longueurs excédentaires broche (Figure 2D).
10. Préparer l’ostéotomie (création de défaut) en plaçant un rétracteur incurvé, petit autour du fémur antérieur et postérieur pour protéger les tissus mous environnants, les muscles et paquet vasculo-nerveux. Utilisant un oscillant sagittale ~ 5 mm lame de scie, avec beaucoup de prudence créer un défaut segmentaire de 5 mm par le biais de la diaphyse du milieu. Appliquer une lumière, une pression uniforme avec la scie afin d’éviter d’inutile fracture (Figure 2E).
11. Appliquer de petites quantités d’irrigation (température ambiante 0,9 % du sérum physiologique (NS)) selon les besoins, tout en créant des défauts afin d’éviter une nécrose thermique de l’os.
12. Rincer la plaie à l’aide de 10 mL de la Nouvelle-Écosse après avoir créé le défaut.
13. Administrer 0,1 mL d’une bupivacaïne 0,25 % d’épinéphrine (1 : 200, 000) sur la plaie comme analgésique et vasoconstricteur.
14. Insérer l’échafaud (5 x 3 x 3 mm) d’éponge de collagène ou rhBMP-2 imbibé d’éponge (à partir de l’étape 2) dans le vice. Chaque échafaudage doit être dimensionné de manière appropriée pour couvrir la longueur et le volume du défaut, aidant l’éponge restent en position.
    Remarque : À ce stade, complexes d’ARNm peuvent préparer et injectés décrites aux étapes 7.1-7.3 ci-dessous si vous effectuez l’imagerie bioluminescence.
15. Fermer le plan musculaire en utilisant le modèle simple interrompu avec suture résorbable 4-0. Fermer la couche de la peau, l’utilisation du modèle en cours d’exécution sous-cuticulaires avec suture résorbable 4-0 et colle pour combler les lacunes autour les broches qui dépasse de la peau.
16. Enlever le rat de la coiffe, restant sur le coussin chauffant et surveiller en permanence jusqu'à ce que le rat est en mesure de maintenir constamment une posture verticale. À ce stade, placer dans une cage propre pour récupérer.

7. préparation des ARNm complexé et imagerie de bioluminescence

NOTE : Transfection avec des complexes de l’ARNm doit être effectuée pendant l’opération 1 jour avant l’imagerie luminescence. Utiliser des techniques stériles lors de la manipulation des ARNm.

1. Mix 10 µL d’ARNm codant pour Gaussia luciférase (stock concentration de 1 µg/µL) avec 30 µL de l’agent de transfection lipidique.
2. Prévoir les complexes d’ARNm-lipides pour former en incubant pendant au moins 5 min à température ambiante. L’agent de transfection lipidique se condense les molécules d’ARNm, les stabiliser et améliorer l’efficacité de transfection.
   Remarque : Si les complexes ne sont pas utilisés immédiatement, rangez-les dans la glace pour un maximum de 1 h.
3. À l’aide d’une pipette µL 20 équipé avec pointes filtrées, injecter la moitié du volume des complexes d’ARNm à l’extrémité distale et proximale du défaut, respectivement.
4. Le lendemain, 3 min avant l’imagerie, anesthésier le rat l’inhalation isoflurane comme précédemment décrit dans l’étape 4.1.
5. Positionner le rat dans in vivo d’imagerie chambre équipé d’un cône de nez prestation entretien isoflurane (0,8 % isoflurane, O₂ taux de livraison de 2 à 3 L/min).
6. Injecter la coelenterazine remis en suspension dans une solution saline à la dose de 4 mg/kg de poids corporel à proximité de la défectuosité.
7. Acquisition d’images de bioluminescence in vivo d’imagerie (IVIS) selon instructions^{18 les directives du fabricant}.

8. imagerie protocole

1. Après le calibrage de la machine radiographique simple, un système de rayons x¹⁹, anesthésier rat l’inhalation isoflurane comme décrit précédemment (voir étape 4.1) et positionner le rat dans un cône de nez à l’inhalation isoflurane (0,8 % isoflurane, O₂ taux de livraison de 2 à 3 L/min) pour une radiographie du fémur antéro-postérieure (AP).
   1. Alors que le rat est en décubitus sternal, avancer le membre postérieur chirurgical vers l’avant, la flexion au niveau des hanches et étouffer la commune. Flex de l’articulation du Grasset à environ 90°. Bande du côté plantaire de la patte vers le bas, à proximité de la paroi du corps. Position du tibia vers l’avant du fémur afin d’éliminer la possibilité de superposer les os. Pour fournir la légère abduction de la hanche, placez une éponge translucide (environ 15 mm d’épaisseur) dans la région de l’aine. Obtient alors une image (crânienne-caudale) antéro-postérieur du fémur.
2. Répétez ce point de vue radiographique fémur AP immédiatement après la chirurgie, 4 et 12 semaines. Utiliser le ruban adhésif et la gaze pour positionner convenablement les extrémité de l’animal pour l’imagerie cohérente et de qualité.
3. Enlever le rat de la coiffe et surveiller en permanence jusqu'à ce que le rat est en mesure de maintenir constamment une posture verticale. Ensuite, remettre dans la cage.

9. histologique procédure

1. Euthanasier des rats dans une chambre avec l’inhalation de CO₂ selon AVMA normes éthiques¹⁶.
2. Suite à l’euthanasie, se raser le membre postérieur, enlever la peau de l’extrémité du dispositif et équipe du fémur au niveau des hanches. Retirez soigneusement tous les tissus mous du fémur du dispositif (y compris tous les muscles, tendons et ligaments). Laisser seule une mince couche de muscles qui entourent le site de défaut pour protéger la région de guérison contre les dommages accidentels au cours de la dissection.
3. Placez le fémur chez 10 % formol tamponné neutre, à température ambiante pendant 3-4 jours pour permettre la fixation. Garder un formol 15:1 rapport de volume tissulaire. Changez la solution une fois le processus de fixation au milieu.
4. Détartrer le fémur dans une solution pH 6,5 15 % éthylènediaminetétraacétique acide (EDTA) pendant 3 à 4 semaines. Recueillir la série radiographies pour déterminer le point de terminaison de décalcification.
5. Coupent le fémur longitudinalement avec une coupe d’antérieur postérieur dans le plan longitudinal. Soumettre pour enrobage de paraffine standard et l’hématoxyline et éosine (H & E) de la coloration des tissus.
6. Envoyer des diapositives H & E à un orthophoniste pour une évaluation histologique.

Résultats

Interventions chirurgicales ont été réalisées en environ une heure par un chirurgien à l’aide d’un assistant. Après optimisation chirurgicale, intra - et les complications post-opératoires ont été considérablement réduits au minimum et l’utilisation de l’appareil de jig assurée taille uniforme (5 x 3 x 3 mm) et la localisation des défauts fémorales. Des rats ont été ambulatoire immédiatement après récupération de l’anesthésie et ne semblent pas avoir toute a...

Discussion

Petits modèles animaux de blessures orthopédiques tels que fractures osseuses complet permettent de recherche qui explore les mécanismes de l’ostéogenèse et évaluer le potentiel thérapeutique des biomatériaux²⁰. Cette étude présente un rat défaut segmentaire modèle stabilisé par un fixateur externe personnalisée qu’une équipe du laboratoire et du génie biomédical peut facilement reproduire pour d’autres études de la réparation osseuse articulaire porteuse.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sterile Saline	Baxter	2F7124	Used for irrigating wound and rehydration
10% Iodine/Povidone	Carefusion	1215016	Used to prep skin
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	89370094	Used as fixative
1mm non-threaded kirschner wire	DePuy Synthes	VW1003.15	Sterilized, used for the most proximal pin
1mm threaded kirschner wire	DePuy Synthes	VW1005.15	Sterilized, used for the 3 most distal pin slots
2x2 gauze	Covidien	4006130	Sterilized, used to prep skin and absorb blood
4-0 Vicryl Suture	Ethicon	4015304	Used to close muscle and skin layers
4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws	Generic		External fixator assembly
4200 Cordless Driver	Stryker	OR-S-4200	Used to drill kirschner wires
4x4 gauze	Covidien	1219158	Sterilized, used to absorb blood
70 % Ethanol			Used to prep skin
Baytril	Bayer Healthcare LLC, Animal health division	312.10010.3	Added to water as an antibiotic
Cefazolin	Hikma Pharmaceuticals	8917156	Pre-op antibiotic
CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU)	TriLink Biotechnologies	L-7205	Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo
Double antibiotic ointment	Johnson & Johnson consumer Inc	8975432	Applied to pin sites post-op as wound care
Dual Cut Microblade	Stryker	5400-003-410	Used to create 5mm defect in femur
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Fisher	BP120-500	Used to decalcify bone to prep for histology
Extended Release Buprenorphine	ZooPharm		Used as 3 day pain relief
Fenestrated drapes	3M	1204025	Used to establish sterile field
Handpiece cord for TPS	Stryker	OR-S-5100-4N	Used to create 5mm defect in femur
Heating pad	K&H Pet Products	121239	Rat body temperature maintenance
Hexagonal head screwdriver	Wiha	263/1/16 " X 50	External fixator tightening
Induction chamber	Generic		Anesthesia for rats
Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2	Medtronic	7510200	Clinically relevant treatment used as positive control
Isoflurane	Clipper	10250	Anesthesia for rats
IVIS	Perkin Elmer	124262	Bioluminescence imaging modality
Jig	Custom		Used to place bicortical pins
Lipofectamine MessengerMAX	Fisher Scientific	LMRNA003	mRNA complexing agent that enables mRNA delivery
Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000))	APP Pharmaceuticals, LLC	NDC 63323-468-37	Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction
Sterile water	Hospira	8904653	Used as solvent for cefazolin powder
Titanium external fixator plates	Custom		Prepared in house with scrap titanium and milling machine
Total Performance System (TPS) Console	Stryker	OR-S-5100-1	Used to create 5mm defect in femur
TPS MicroSaggital Saw	Stryker	OR-S-5100-34	Used to create 5mm defect in femur
Ultrafocus Faxitron with DXA	Faxitron		High resolution radiographic imaging modality
Uniprim rat diet	Envigo	TD.06596	Medicated rat diet
Universal Handswitch for TPS	Stryker	OR-S-5100-9	Used to create 5mm defect in femur
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469	Skin closure