Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, kütle spektrometresi için HIV-1 replikasyonu varlığında Rev immünopresipitasyon açıklanmaktadır. Açıklanan yöntemler, HıV-1 enfeksiyonlu döngüsünde yer alan nüksolar faktörlerinin tanımlanması için kullanılabilir ve az çalışılan yolların karakterizasyonu için diğer hastalık modelleri için geçerlidir.

Özet

HıV-1 enfeksiyöz döngüsü viral çoğaltma kolaylaştırmak için ana faktörler ile viral protein etkileşimleri gerektirir, paketleme, ve serbest. Enfeksiyöz döngü daha da infeksiyon düzenleyen ve nükresitoplazmik taşıma etkinleştirmek için HıV-1 RNA ile viral/konak protein kompleksler oluşumu gerektirir. HıV-1 Rev proteini, HıV-1 mRNAs 'ın nükleer ihracatını, intronik CiS-hareket hedefleri ile multimerizasyon yoluyla-Rev yanıtı elemanı (RRE) gerçekleştirir. Rev arginin zengin motif (ARM) COOH-Terminus içinde bir nükle lokalizasyonu sinyali (NoLS) var, nükreolus Rev/RRE kompleksleri birikimi sağlar. Nükleolar faktörleri, mRNA bağımsız nükleer ihracat ve birleştirme aracılık ek olarak çeşitli fonksiyonlar aracılığıyla HıV-1 bulaşıcı döngüsü desteklemek için spekülasyonlar vardır. Kitle spektrometresi için HIV-1 çoğaltmasının bulunması halinde, Rev nüklenolar mutasyonları (silme ve tek noktalı Rev-nols mutasyonları) ile karşılaştırıldığında, vahşi tip (WT) Rev 'in immünopresipitasyon yöntemini tarif ediyoruz. Nüklerokositasmik taşımacılığında (nucleophosmin B23 ve nükcolin C23), hücresel yapıştırma faktörlerinin yanı sıra, Rev-NoLS mutasyonlarının varlığında Rev ile etkileşimi kaybetmek. SnoRNA C/D kutusu 58 gibi çeşitli nükseolar faktörleri, Rev mutasyonları ile etkileşimi kaybetmek için tanımlanır, ancak HıV-1 çoğaltma döngüsünde fonksiyonları bilinmeyen kalır. Burada sunulan sonuçlar, HıV-1 enfeksiyonlu döngüsünü korumak için viral/konak nüksolar faktörlerinin tanımlanması için bu yaklaşımın kullanımını göstermektedir. Bu yaklaşımda kullanılan kavramlar, az çalışılan yolların karakterizasyonu gerektiren diğer viral ve hastalık modelleri için geçerlidir.

Giriş

Nükl, viral replikasyon için gerekli çeşitli hücresel ev sahibi ve viral faktörlerin etkileşim zemin olarak öne olduğunu. Nükleyer, üç farklı bölmeye bölünmüş kompleks bir yapıdadır: fibriler bölmesi, yoğun fibriler bölmesi ve granüler bölme. HıV-1 Rev proteini özellikle granüler bölmeler içinde lokalleştirir; Ancak, bu yerelleştirme deseni nedeni bilinmiyor. Nols dizisi içinde tek noktalı mutasyonların varlığını (Rev mutasyonlar 4, 5, ve 6), Rev bir nükle desen korur ve daha önce HIV-1HXB2 çoğaltma kurtarmak için gösterilmiştir, ancak, daha düşük verimlilik ile karşılaştırıldığında WT Rev1 . Tüm tek nokta mutasyonlar HıV-1NL4-3 bulaşıcı döngüsü sürdürmek mümkün değildir. NoLS dizisi içinde birden çok tek noktalı mutasyonlar varlığında (Rev-NoLS mutasyonları 2 ve 9), Rev çekirdek ve sitoplazması boyunca dağıtmak için gözlenen ve HıV-1HXB2 çoğaltma1kurtarmak mümkün olmamıştır. Bu proteomik çalışmanın amacı, nükselolar yanı sıra, Rev-aracılı HıV-1 bulaşıcı yolunda yer alan nonnüktrinolar hücresel faktörleri deşifre etmektir. Rev immünopyemek koşulları, nüklenolar B23 phosphoprotein ile etkileşimi ile optimize edilmiştir, daha önce nükloon mutasyonların varlığında Rev ile etkileşimi kaybetmek gösterilmiştir.

Rev hücresel faktörler yoğun geçmişte incelenmiştir; Ancak, bu viral patogenezi yokluğunda yapıldı. Bir protein, özellikle, bu çalışmada HIV-1 çoğaltma sırasında Rev etkileşimi ile karakterize nükvolar fosfoprotein B23-aynı zamanda nucleophosmin (NPM), numatrin veya NO38 amfitolit2,3 olarak adlandırılır 4. B23 üç isoformlar olarak ifade edilir (NPM1, NPM2, ve NPM3)-tüm üyeleri nucleophosmin/nükleoplazmin nükleer refakatçi aile5,6. NPM1 moleküler refakatçi, nüklozomların uygun montajında, kromatin yüksek sıralı yapılarında yer alan protein/nüklik asit kompleksleri oluşumunda,7,8ve toplama önlenmesi ve hedef proteinlerin N-terminal çekirdek etki alanı (kalıntıları 1-120)9ile yanlış katlanması. NPM1 işlevselliği çekirdek ve sitoplazması arasında preribosomal partiküllerin taşınması ile ribozom Genesis uzanır10,11, dahili transkripsiyonu spacer serisindeki preribosomal RNA işlenmesi 12,13, ve ribozomal montaj sırasında proteinlerin nüklolar toplama tutuklama14,15. NPM1 apoptozis inhibisyonu içinde bulaşmış16 ve tümör bastırıcı arf stabilizasyonu17,18 ve p5319, bir Onkojenik faktör ve tümör bastırıcı olarak ikili rolünü açığa. NPM1 genom stabilitesi, centrosome çoğaltma ve transkripsiyon hücresel faaliyetlerine katılır. NPM1, hücre döngüsü interfaz sırasında nükleollerde, mitozis sırasında kromozomal çevre boyunca ve mitozun sonucu olarak prenüsolar gövdelere (PNB) bulunur. NPM2 ve NPM3 malignite sırasında değiştirilmiş ifade seviyeleri uğrar NPM1 olarak iyi çalışılmıştır değildir20.

NPM1, iç NES ve NLS9,21 ve daha önce HIV-1 tat ve Rev proteinleri nükleer ithalatı sürücü bildirilmiştir çeşitli nükleer/nükleolar proteinlerin nükleoplazmik mekik belgelenmiş. B23-bağlayıcı-Domain-β-galactosidase Fusion proteinlerin varlığında, tat Sitoplazmanın içinde mislocalizes ve Transaktivasyon etkinliğini kaybeder; Bu B232için tat güçlü bir benzeşimi gösterir. Başka bir çalışmada RRE içeren mRNAs yokluğunda bir Rev/B23 istikrarlı kompleks kuruldu. RRE mRNA huzurunda, Rev B23 dan ayrışıp ve tercihen HIV RRE bağlar, B2322deplasmanında lider. Nerede, subnuclear düzeyinde, tat transaktivasyonu ve B23 HIV mRNA için Rev değişim süreci gerçekleşir bilinmiyor. Her iki protein B23 etkileşimi ile aynı anda nükolus girmek için öne vardır. Diğer ev sahibi hücresel proteinlerin HıV nükselolar yolu içinde katılımı bekleniyor. Bu proteomik soruşturmada açıklanan yöntemler, HıV-1 patogenezi sırasında yer alan hücre faktörleri ile nükselolus 'un etkileşimlerine yardımcı olacaktır.

Proteomik soruşturma, HıV-1HXB2 üretimi Için Rev nols tek noktalı mutasyonlar (M4, M5 ve M6) ve birden fazla arginin değiştirme (m2 ve M9) ifadesi ile başlatıldı. Bu modelde, bir hela hücre hattı stabil Rev eksikliği HIV-1HXB2 (hlfb) WT Rev ve Rev nüklemler mutasyonlar 3 ' End bir bayrak etiketi içeren transfekte olduğunu ifade ediyor. WT Rev varlığı HLfB kültüründe, Rev eksikliği (m2 ve M9) kurtarmak değil Rev-NoLS mutasyonlar ile karşılaştırıldığında, viral replikasyon gerçekleşmesi için izin verecektir veya viral çoğaltmanın gerçekleşmesi için izin verir, ancak gibi verimli WT Rev (M4, M5, ve M6)1. Cell lysate, Rev ifadesinin varlığında viral proliferasyon sonrası ve Rev/B23 etkileşimi için optimize edilmiş bir liziz tamponu ile immünopresipitasyon 'a maruz kaldıktan sonra 48 h alınır. Değişken tuz konsantrasyonlarını kullanarak lizis tampon optimizasyonu açıklanmıştır ve HıV-1 Rev için protein elüsyon yöntemleri gümüş lekeli veya Coomassie-vitray-sayfa jeller içinde karşılaştırılır ve analiz edilir. İlk proteomik yaklaşımı, tandem kütle spektrometresi tarafından ifade edilen WT Rev, m2, M6 ve M9 tarafından el ile oluşturulan bir numunenin doğrudan analizini içerir. WT Rev, M4, M5 ve M6 'ın atlatılacağı ikinci bir yaklaşım, ilk yaklaşımla karşılaştırıldığında bir jel ekstraksiyon işlemi uygulandı. WT Rev ile karşılaştırıldığında Rev-NoLS mutasyonları peptid yakınlık analiz edilir ve protein tanımlama olasılığı görüntülenir. Bu yaklaşımlar, HIV-1 mRNA taşımacılığında ve Rev ile HıV-1replikasyon sırasında birleştirme sürecinde bulunan olası faktörleri (nüklerolar ve nonnüklerolar) ortaya çıkarır. Genel olarak, hücre lizis, IP, açıklanan ve elüsyon koşulları, enfeksiyon yollarını etkinleştirmek ve düzenleyen ana hücresel faktörlerin anlaşılması için ilgi viral proteinlere uygulanabilir. Bu da çeşitli hastalık modellerinin Kalıcılık için gerekli hücresel ana faktör çalışması için geçerlidir. Bu proteomik modelde, HıV-1 Rev IP, nükle sitoplazmik mekik aktivitesi ve HıV-1 mRNA bağlayıcılığı ile ilgili olarak B23 etkileşim için optimize edilmiştir. Ayrıca, hücre hatları stabil ilgi anahtar proteinlerin eksiktir bulaşıcı hastalık modelleri ifade, HLfB hücre hattına benzer, ilgi bulaşıcı yollar çalışmak için geliştirilebilir.

Protokol

1. hücre kültürü

  1. Dulbecco 'nun değiştirilmiş Eagle 'ın Orta (dmem) ' inde hlfb 'ı koruyun% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mm L-glutamin ve 1 mm sodyum piruvat doku kültürü ile tedavi edilen 100 mm plakalı. Hücre kültürlerini 37 °C ' de% 5 CO2ile birlikte verilen bir nemlendirici kuluçte tutun. 1 x 106 hücreli/ml hücre yoğunluğuna Passage confluent hücreleri.
  2. Hücre kültürü ortamını atın. 10 mL 1x fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile hücreleri yavaşça durulayın. Hücre katmanını bozmadan 1x PBS 'i çıkartın ve atın.
  3. Hücrelere 2 mL 1x Trypsin-EDTA çözümü ekleyin. Tek tabakalı kat ve 5 dk için bir nemlendirici oda içinde 37 °c ' de inküyme çanak kaya.
  4. Sıkıca hücreleri ayırmak için el avuç ile çanak tarafına dokunun. 8 mL taze kültür medyasında ayrılmış hücreleri yeniden resuspend. 400 x g 'de hücreleri 5 dakika boyunca döndürün.
  5. Hücre Pellet bozmadan Kültür medya atın. Taze Kültür medya 10 ml hücre Pelet resuspend. Subculture 1 mL konsantre hücreler ile 9 mL taze Kültür medya içinde doku-kültür-tedavi 100 mm plakalar.
    Not: her Rev-nols mutasyonu için, 3x 100 mm hlfb veya hela kültür plakaları Batı leke Analizi ve kütle spektrometresi için yeterli protein lysate verecektir. WT Rev pozitif kontrol ve negatif kontrol için ekstra plakalar ekleyin. Alt kültür hücresi birimi, farklı hücre türlerinin kullanımı ile en iyileştirme gerektirir.

2. HIV-1 çoğaltma sırasında Rev-nols-3' Flag mutasyonlar ifadesi

  1. HLfB hücre kültürünü 2 x 106 hücreli/ml 'lik bir hücre yoğunluğuna büyütün. Her 100 mm plaka için 4 mL kalsiyum fosfat-DNA süspansiyonu hazırlayın.
    1. Etiket 2 15 mL Tüpler 1 ve 2 olarak. 2 mL 2x HBS ekleyin (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl, ve 1,5 mM na2HPO4 [pH 7,12]) tüp 1. TE 79/10 (1 mM Tris-HCl ve 0,1 mM EDTA [pH 7,9]) tüp 2 ' ye ekleyin. TE 79/10 hacmi 1,760 mL-DNA hacmi.
    2. 20 μg Plasmid, Rev-NoLs-3' Flag mutasyon tüp 2 ' ye ilgi içeren ve içeriğini Resuspension aracılığıyla karıştırın ekleyin. 240 μL 2 M CaCl2 ' den tüp 2 ' ye ekleyin ve yeniden Resuspension ile karıştırın.
    3. Tüp 2 karışımı transfer tüp 1 dropwise, yavaşça karıştırma. Süspansiyonun oda sıcaklığında 30 dakika oturmasına izin verin. yağış Vortex.
  2. 3 hücreli kültürün her biri için 1 ml Süspansiyon dropwise ekleyin, 100 mm plakalar yavaşça medya dönen iken. Plakalarını inkükule geri dönün ve transfeksiyon karışımını 6 saat boyunca bırakın. 10 mL taze kültür medyası ile transfeksiyon karışımını değiştirin ve 42 h için hücreleri kuluçsa.

3. viral protein lysate koleksiyonu

  1. 48 h posttransfection hücre medyasını atın. Her 100 mm plaka buzun bir yatağa yerleştirin. Her Rev-NoLS mutasyon örneği için etiket 15 mL tüpler ve buz üzerinde tüpler yerleştirin.
  2. Hücreleri, hücre katmanını bozmadan 10 mL ön soğutulmuş 1x PBS ile yavaşça durulayın. 1x PBS 'i atın. 3 mL liziz tamponu ekleyin (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 137 mM NaCl ve 1% X-100 deterjan [ malzeme tablosunabakın]), tüm 100 mm tabakaların her biri için proteaz inhibitörü kokteyli ile tedavi edilir.
  3. Hücre katmanını bozmak için bir hücre sıyırıcı kullanın. Plaka eğim ve hafifçe kazımak ve bir havuza hücreleri toplamak. Bir 1.000 μL mikropipet kullanarak hücre lysate toplayın ve prelabeled içinde 3 100 mm plakaları her biri hücre endoglikozidazları karıştırın 15 ml tüp.
  4. 15 dakika boyunca buz üzerinde hücre lysate inküye, her 5 dk vorherser. hücre lysate 15.000 x g , 5 dakika Santrifüjü.
  5. Hücre enkaz Pelet bozmadan protein süpernatant toplayın ve başka bir steril 15 ml tüp aktarmak. Bradford yöntemini kullanarak viral protein lysate konsantrasyonu elde (bkz. Bölüm 4).
  6. Batı immünoblot analizi için giriş numunesi (20 μg) bir kısım kaydedin. Son hacmine 2x örnek tampon (% 20 gliserol, 0,02% bromophenol mavi, 125 mM Tris-CL [pH 6,8],% 5 SDS ve% 10 2-mercaptoetanol) ekleyin. 95 °C ' de 10 dakika boyunca kaynatın ve giriş örneğini-20 °C ' de saklayın.

4. Bradford tahlil

Not: proteinli standart eğrileri oluşturmadan önce 100x BSA stokundan 10X Sığır serum albümin (BSA) hazırlayın.

  1. Aşağıdaki boş ve standartlar için mikrosantrifüj tüplere su aliquot: boş = 800 μL; Standart 1 = 2 mg/mL, 798 μL; Standart 2 = 4 mg/mL, 796 μL; Standart 3 = 6 mg/mL, 794 μL; Standart 4 = 8 mg/mL, 792 μL; Standart 5 = 10 mg/mL, 790 μL. aliquot 10X BSA aşağıdaki belirlenen standartlara göre: Standart 1 = 2 μL; Standart 2 = 4 μL; Standart 3 = 6 μL; Standart 4 = 8 μL; Standart 5 = 10 μL.
  2. 5 μL protein numunesi ile 795 μL su karıştırarak protein örneklerinin bir karışımını hazırlayın. Ekleme 200 μL protein assay boya reakajı ( malzeme tablosunabakın) her boş, standart, ve protein örneği. Numuneleri çift karışım için kısa bir süre Vortex ve oda sıcaklığında (18-20 °C) 5 dakika boyunca inküye yapın.
  3. Boş, standartları ve protein örneklerini cuvettes 'e aktarın. 595 nm dozunda protein konsantrasyonlarını ölçün.

5. Rev-NoLS ' ı n coimmünoprecipitation-3 ' Flag

  1. Proteaz inhibitörü kokteyli ile tedavi edilen 500 μL liziz tamponu ile 25 μL m2 yakınlık jeli boncuk ( malzeme tablosunabakın) durulayın. Her mutasyon örneği ve kontrolleri için daha fazla yakınlık jel boncuk durulayın.
    Not: iki jeller (50 μL) için yeterli m2 benzeşme jeli boncuk hazırlayın-bir Batı immünoblot Analizi ve diğer protein boyama ve kütle spektrometresi için.
  2. 4 °C ' de 2 dakika için 820 x g 'de spin. Süpernatant çıkarın. 2 kat daha fazla durulayın.
  3. Viral protein lysate ekleyin (1 mg/mL 5 toplam hacmi mL) prerinsed m2 benzeşme boncuklar. Lizis arabelleği kullanarak toplam hacmi ayarlayın.
  4. Reaksiyonu 4 °C ' de dönen 3 saat için inkük. M2 benzeşme boncukları/viral protein lysate 820 x g 'de 1 dakika santrifüjler.
  5. Süpernatant toplayın ve Batı immünoblot analizi için (20 μg) Post-IP örnek bir kısım kaydedin. Post-IP lysate protein konsantrasyonu ölçmek. Batı İmmünoblotting için 20 μg toplayın.
  6. Son birime 2x örnek arabellek ekleyin. 95 °C ' de 10 dakika boyunca kaynatın ve IP sonrası örneğini-20 °C ' de saklayın.
  7. M2 boncuk 750 μL lizis tampon ile durulayın ve 5 dakika için 4 °c ' de bir rotator üzerinde boncuklar yıkayın. m2 boncuk 820 x g Santrifüjü ve supernatant atın.
  8. 5 dakika boyunca 4 °C ' de Rotator üzerinde iki daha fazla yıkama için 5,7 adımlarını tekrarlayın. Üçüncü yıkamadan sonra, uzun bir jel yükleme ucu kullanarak m2lik boncuk/Co-IP kompleksinden liziz tamponunun herhangi bir izlerini çıkarın.
    Not: lizis tamponunun herhangi bir iz miktarını çıkarmadan önce, jel yükleme ucunun ucunu düz cımbız ile çimdik. Bu m2 boncuk kesintileri ve alımı önleyecek.
  9. M2 boncuk 55 μL 2x yükleme tampon resuspend. Numuneyi 95 °C ' de 10 dakika kaynatın.
  10. 25 μL 'yi iki ayrı SDS-PAGE jeline (Batı İmmünoblotting için bir jel ve Coomassie boyama için diğer) yükleyin.

6. SDS-PAGE jeller hazırlanması

  1. Cast 2 15% SDS-akrilamid bir 50 ml tüpte aşağıdaki reaktifler karıştırarak jeller çözme (40 ml son hacimde, dört jeller için yeterli): 4,16 ml Ultra saf su, 15 ml% 40 akrilamid: bisacrylamid (29:1), 10 ml 1,5 M Tris-HCL (pH 8,8) , 400% 10 SDS, 400 μL% 10 amonyum Persülfat, ve 40 μL TEMED.
  2. 50 ml tüpünü birkaç kez ters çevirme ile çözme jeli karıştırın. Çözümlenen jel karışımının önlenmemiş bir Batı jel aparatı (Batı İmmünoblotting için üç ve bir Coomassie/gümüş boyama için dört jelleri) içine pipet.
  3. Jel karışımının üst katmanını kapsayacak kadar suyu nazikçe pipet. Çözme jel polimerize izin verin.
  4. Herhangi bir fazla suyu absorbe etmek için hassas bir görev silecek ( malzeme tablosunabakın) kullanarak, çözme jeli su tabakası dökün.
  5. 50 ml 'lik bir tüpte aşağıdaki reaktifleri karıştırarak iki 5% SDS-Acrylamid istifleme jeller (20 ml son hacimde, dört jeller için yeterli): 11,88 ml Ultra saf su, 2,5 ml% 40 akrilamid: bisacrylamid (29:1), 5,2 M Tris-HCL (pH 1,5) , 200% 10 SDS, 200 μL% 10 amonyum Persülfat ve 20 μL TEMED.
  6. 50 mL tüpünü birkaç kez ters çevirerek istifleme jeli karıştırın. İstifleme jeli karışımından, çözme jeli üzerindeki cihazın üst kısmına pipet atın.
  7. İstifleme jeli içine uygun sayıda şerit içeren bir jel kaset tarak yerleştirin. Hassas bir görev silecek kullanarak jel karışımı herhangi bir taşma absorbe ( malzeme tablosunabakın). İstifleme jeli tamamen polimerize izin verin.
  8. Batı jel aparatını 1x Batı çalışan tampon ile Flood (5x konsantrasyon: 250 mM Tris-CL [pH 8,3], 1,92 M gcine,% 0,5 SDS ve 10 mM EDTA).
  9. Jel kaset tarağını istifleme jelinden nazikçe çekin. 1x Batı çalışan tamponun yükleme kuyularını doldurmasına izin verin. Örnekleri yüklemeden önce bir şırınga kullanarak 1x Batı çalışan tampon ile her iyi Flush.
  10. Batı immünoblot örneklerini ilgili her bir jel içine yükleyin (giriş örnekleri, koimmunoprecip, numune ve post-IP örnekleri). Batı jel protein belirteçleri yükleyin.
  11. Başka bir jel içine Coomassie/gümüş boyama için coimmunoprecip, örnekleri yükleyin. Batı jel protein belirteçleri yükleyin.
  12. Çalışan jel aparatını bir güç kaynağına bağlayın ve yükleme boyası çözme jeline ulaşıncaya kadar 100 V 'de jeller çalıştırın. Yükleme boyası çözme jeli altına ulaşıncaya kadar 140 V gerilimini artırın.

7. Batı leke transferi

  1. Batı jel aparatı sökün. Çözme jel bozulmamış bırakarak, dilim ve istifleme jel atın.
  2. Çözme jelleri Batı transfer tamponunun (25 mM Tris, 194 mM gcine, 0,005% SDS,% 20 metanol) dolu temiz bir tepsisine yavaşça aktarın ve 15 dakika boyunca ıslatın.
  3. Jel transfer tertibatını aşağıdaki şekilde birleştirin.
    1. Kesme üç PVDF transfer membranları ve filtre kağıdı altı adet ( malzeme tablosunabakın) çözme jel boyutuna.
    2. PVDF membranı 5 dakika boyunca metanol içinde ıslatın. 5 dakika su içinde hidrat. PVDF membranı Batı transfer tamponunu kullanıma hazır olana kadar yerleştirin.
    3. Jel tutucu kasetini, kısmi olarak Batı transfer tamponu ile doldurulmuş cam bir pişirme tepsisine yerleştirin ve altta siyah tarafı vardır.
    4. Jel tutucu kasetinin siyah tarafına karşı Batı transfer tampon ile ıslatılmış bir köpük Pad yerleştirin.
    5. Batı transfer tampon filtre kağıdı bir parça ıslak ve köpük Pad üstüne yerleştirin. Çözümleme jeli filtre kağıdın üstüne yerleştirin.
      Not: çözme jelini PVDF membranına aktarılacak doğru yükleme yönüne yerleştirin.
    6. Çözme jeli üzerine bir PVDF transfer membran yerleştirin. Batı transfer tampon ile filtre kağıdı bir parça ıslak ve PVDF transfer membran üstüne yerleştirin.
    7. Filtre kağıdın üstüne Batı transfer tampon ile ıslatılmış başka bir köpük Pad yerleştirin. Jel tutucu kasetinin beyaz tarafını dikkatle batırılmış köpük balatasının üstüne katlayın. Kaseti sıkıca kilitle.
    8. Jel tutucu kaseti transfer aparatı elektrot montajında yerleştirin. Kalan her çözümleme jeli için 7.3.4-7.3.8 adımlarını yineleyin.
    9. Transfer aparatı deposunun Batı transfer tamponunu doldurun. Cihaz tankına bir karıştırma çubuğu yerleştirin.
    10. Cihaz tankını bir tabak üstüne yerleştirin. 5-6 için heyecan ayarı ayarlamak, karıştırın çubuk sıkışmış veya jel tutucu kasetleri vurmak olmadığından emin olun.
    11. Jel transfer aparatını bir güç kaynağına bağlayın ve 100 V 'de jeli 4 °C ' de 1 h 'ye aktarın.

8. İmmünoblotting

  1. Jel tutucu kaseti çıkarın ve siyah tarafı temiz bir cam pişirme tepsisine doğru yerleştirin. Kaseti açın ve köpük yastığı ve filtre kağıdını dikkatle atın. Doğru yükleme yönünü belirlemek için PVDF membranın bir köşesini işaretleyin. Membran ıslak tutun.
    Not: PVDF membran hava kurutulur ve temiz, mühürlü bir konteynır içinde depolanabilir. 7.3.2 adımları tekrarlayarak membranı rehidrat.
  2. Membranı 100 mL engelleme çözeltisi (% 5 süt, 1x TBS ve 0,1% Tween 20) olarak yerleştirin. 1 saat için oda sıcaklığında (18-20 °C) nazik sallanan ile membranı engelleyin.
  3. 25 kDa protein işaretleyicisinin üstündeki membranın üzerinden keser. B23 fare monoklonal IgG1 (1:500 seyreltme) içeren engelleme çözeltisi, 25 kDa daha büyük protein bantları içeren membranın üst kısmını yerleştirin. Bir gecede blok, 4 °C ' de sallanan.
  4. Membran alt kısmını yerleştirin, 25 kDa 'den küçük protein bantları içeren, m2 fare monoklonal IgG1 içeren engelleme çözeltisi (1:1000 seyreltme, malzeme tablosunabakın). Bir gecede blok, 4 °C ' de sallanan.
  5. Sallanan bir platformda 25 mL Batı yıkama çözeltisi (1x TBS, 0,1% ara 20) olarak 10 dakika membran 3x yıkayın.
  6. , Oda sıcaklığında 1 saat için engelleme solüsyonu seyreltilmiş keçi-Anti-fare IgG1-HRP (1:5000 seyreltme) içinde membranların kulbin. Sallanan bir platformda 25 mL Batı yıkama çözeltisi içinde 10 dakika membran 3x yıkayın.
  7. Kemilüminesans Batı Blot substrat hazırlayın. Membran için substrat eklemek için bir P1000 mikropipet kullanın.
  8. Her membran için kemiluminesans Batı lekeleme substrat geliştirin 5 dakika. substrat membran çıkarın. Hassas bir görev silecek kullanarak aşırı substrat absorbe ( malzeme tablosunabakın).
  9. Bir kasetin içine bantlanmış temiz bir levha koruyucusu içine membran yerleştirin. Kasedi karanlık bir odaya götürün ve kasete bir sayfa film yerleştirin. Kaseti yerine kilitleyin ve 5 – 15 dakika boyunca inküye yapın. filmi kasetten çıkarın ve geliştirin.

9. Coomassie boyama

  1. Batı jel aparatı sökün. Çözme jel bozulmamış bırakarak, dilim ve istifleme jel atın. Çözme jeli 25 ml Ultra Saf suyla dolu temiz bir tepsiye yavaşça aktarın.
  2. Jeli 15 dakika boyunca sallanan bir platformda kulkayın. çözme jel kırma önlemek için nazik sallanan kullanın. Ultra saf su atın ve yıkama adım 2x daha tekrarlayın.
    Not: yıkama adımlarının ardından SDS kabarcıkları kalırsa, jel bir gecede ultra saf suda yıkanabilir. Kalan SDS jel yüksek arka plan boyama neden olabilir.
  3. Şişenin tersine çevirme ile Coomassie leke reakajının karıştırın ( malzeme tablosunabakın). 100 mL Coomassie leke reakajının çözme jeli kapsayacak ve 1 h için sallanan bir platformda jel inkük koyun. Coomassie leke reakajının atılması ve 15 dakika boyunca sallanan bir platformda deiyonize suda jel yıkayın.
  4. Deiyonize suyu atın. Yıkama adımını 2x daha tekrarlayın. Protein bandlarının istenilen çözünürlüğü gözleninceye kadar jeli yıkamak için devam edin.

10. gümüş boyama

  1. Batı jel aparatı sökün. Çözme jel bozulmamış bırakarak, dilim ve istifleme jel atın. Çözme jeli 25 ml Ultra Saf suyla dolu temiz bir tepsiye yavaşça aktarın.
  2. Jeli 15 dakika boyunca sallanan bir platformda kulkayın. çözme jel kırma önlemek için nazik sallanan kullanın. Ultra saf su atın ve yıkama adım 2x daha tekrarlayın.
    Not: yıkama adımlarının ardından SDS kabarcıkları kalırsa, jel bir gecede ultra saf suda yıkanabilir. Kalan SDS jel yüksek arka plan boyama neden olabilir.
  3. % 30 etanol içinde jel Fix:% 10 asetik asit çözeltisi (6:3:1 su: etanol: asetik asit) gecelik oda sıcaklığında. Jeli oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 10 etanol çözeltisi içinde yıkayın. Etanol solüsyonu değiştirin ve 5 dakika daha yıkayın.
  4. Tek parçalı gümüş leke duyarlılığını 500 parça ultra saf su ile (50 μL 25 ml Ultra saf su ile) karıştırarak, Pierce Silver stain Kit 'ten hassaslaştırıcı çalışma çözümünü hazırlayın. 1 dakika boyunca hassaslaştırıcı çalışma çözeltisi içinde çözelti jel inküye. 1 dakika için ultra saf suda jel yıkayın, su yerine, ve 1 dakika için tekrar jel yıkayın.
  5. 50 parça gümüş leke (500 μL 25 mL gümüş leke ile arttırıcı) ile tek parçalı gümüş leke arttırıcı karıştırma tarafından leke çalışma çözümünü hazırlayın. Jel, 30 dakika boyunca leke çalışma çözeltisi içinde inküye.
  6. 50 parçaları gümüş leke geliştirici ile 1 parça gümüş leke arttırıcı karıştırma tarafından geliştirici çalışma çözümü hazırlayın (500 μL arttırıcı ile 25 mL Geliştirici). % 5 asetik asit çözümünü stop solüsyonu olarak hazırlayın. 1 dakika boyunca ultra saf su ile jeli yıkayın, suyu değiştirin ve ek 1 dakika boyunca jeli yıkayın.
  7. Suyu geliştirici çalışma çözümüyle değiştirin ve istenilen protein bandı yoğunluğu çözülene kadar inküye yapın (5 dakika). Geliştirici çalışma çözümünü stop çözümüyle değiştirin ve 10 dakika boyunca inküye yapın.

11. in-jel azaltma, alkilasyon, ve Coomassie sindirimi-lekeli jel bantları

  1. Jel bantları temiz bir jilet kullanarak jel kesip. Her jel bandını yaklaşık 5 mm küpler halinde kesip temiz 0,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
  2. 1:1 acetonitrile 100 mM amonyum bikarbonat ile kapsayan jel parçaları destain: 15 dakika oda sıcaklığında su, supernatant atın. Bu adımı yineleyin.
  3. Jel parçalarını 5 dakika boyunca bir vakum santrifüjte kurutun. 100 mm Amonyum Bikarbonat içinde 10 mm ditiyotreitol ile kurutulmuş jel parçaları kapsayan ve 56 °c ' de 1 h için inküyasyon proteinleri azaltın.
  4. Herhangi bir supernatant pipette. Su içinde 100 mM iodoacetamid ile jel parçaları kaplayan proteinleri alkylate ve karanlıkta oda sıcaklığında 1 h için onları inkükleştirici.
  5. Süpernatant kapalı pipette ve Asetonitril ile onları kaplayan ve yavaşça oda sıcaklığında onları sallayarak jel parçaları Shrink 15 dk. süpernatant kapalı pipet ve 100 mm amonyum bikarbonat ile kaplayan jel parçaları reswell ve onları sallayarak 15 dakika oda sıcaklığında yavaşça.
  6. 11,5 adımı yineleyin. Jel parçalarını 5 dakika boyunca bir vakum santrifüjte kurutun.
  7. 100 mM Amonyum Bikarbonat içinde 50 ng/μL sıralı dereceli modifiye tripsin ( malzeme tablosunabakın) ile jel parçaları kapak. Jelin 5 dakika boyunca şişmesine izin verin; sonra, kalan herhangi bir solüsyonu pipet. 100 mM amonyum bikarbonat ile jel parçaları kapak ve onları tamamen reswell izin, ek 100 mM Amonyum Bikarbonat ekleyerek jel parçaları tamamen kaplıdır böylece.
  8. Jel parçalarını 37 °C ' de bir gecede kulyın. Su% 10 formik asit hacminin 1/10 ekleyerek reaksiyon durdurun. Her tüpten süpernatant toplayın.
  9. % 60 Asetonitril% 1 formik asit ile onları kaplayan ve nazik sallayarak 15 dakika boyunca onları kulsolma ile jel parçaları ayıklamak.
  10. Süpernatanlarında tamamen kurutmayı önlemek için bakım yaparken, bir vakum santrifüjte 20 μl daha az kombine süpernatanlarında hacmini azaltın. Toplam hacmi 20 μL 'ye geri getirmek için% 1 formik asit ekleyin.

12. sıvı kromatografi/kütle spektrometresi

Not: örnekler Ultra HPLC, nano sprey kaynağı ve sütun ( malzeme tablosunabakın) ile donatılmış bir kütle spektrometresi kullanılarak incelenmiştir. Solvent A ve B, sırasıyla su ve Asetonitril% 0,1 formik asittir.

  1. Yüksek iyileşme Polipropilen Otomatik Örnekleyici şişeleri içine sindirilmiş proteinleri yükleyin. Şişeleri bir UPLC sisteminin örnek yöneticisine yükleyin.
  2. Her örnekteki 6 μL enjekte edilir. Her numuneyi,% 99 solvent A/1% solvent B kullanarak 8 μL/dak 'da 1,5 dk için nanotil bindirme sütununa yükleyin.
  3. % 3 ' ten% 35 ' e kadar doğrusal degradeyle kütle spektrometresi içinde peptidler 30 dakika içinde,% 35 ' den% 50% ' den 4 dakika ve% 50 ' den% 90 ' e kadar solvent b 'de 1 dk. koruyun 90% Asetonitril 3 dakika; % B 'yi 5 dk üzerinden% 3 ' e geri azaltın.
  4. Çözünürlük (20.000 çözünürlük) modunda pozitif iyon profili kütle spec veri kazanın. 100 dan 2.000 da her 0,6 s tarama hızında veri kazanın. MSE modunda veri edinme herhangi bir çarpışma enerjisi ile taramaları alternatif ve yüksek Çarpışma enerjisi ile tarar.
  5. Yüksek Çarpışma enerjisi için, Trap hücresindeki çarpışma enerjisini 15 V 'den 40 V 'ye yükseltir. kilit kütlesi olarak [Glu1]-fibrinopeptide B + 2 İyon kullanarak her 30 s kilit kitle taraması kazanın. Çözücü A boş bir enjeksiyon kullanarak bir veri dosyası edinme, her örnek çifti arasında aynı edinme yöntemi kullanarak kontrol etmek için kullanma.

13. kütle spektrometresi için veri analizi

  1. Kütle spektrometresi sonuçları dosyalarını bir nicel ve niteliksel proteomik araştırma platformu (örneğin, ProteinLynx Global Server) çalıştıran bilgisayara kopyalayın. Veri Analizi son derece CPU yoğundur ve ayrı, yüksek performanslı bir veri analiz bilgisayarında yapılmalıdır.
  2. Veri için yeni bir proje oluşturun. Otomatik ölçme plakasını temsil eden yeni bir mikrotiter plakası oluşturun. Numuneleri Mikrotitre plakasında aynı pozisyona otomatik amperte konumlarına atayın.
  3. Her örnek işleme parametrelerini atayın. Kullanılacak parametreler otomatik kromatografik tepe genişliği ve MSTIT çözünürlüğü; düşük enerji eşiği, 100 sayar; yüksek enerji eşiği, 5 sayar; Yoğunluk eşiği, 500 sayar.
  4. Her örnek iş akışı parametrelerini atayın. Kullanılacak parametreler veritabanı, birleştirilmiş insan SwissProt ve HıV, ters dizileri ile; Otomatik peptid ve parça toleransı; Min parça iyon peptid başına maçlar, 3; minimum parça iyon protein başına maçlar, 7; protein başına min peptid maçlar, 1; Primer Özet reaktif, tripsin; cevapsız yarık, 1; sabit değiştirici reaktifler, carbamidomethyl C; değişken değiştirici reaktifler, oksidasyon M; yanlış keşif oranı, 100.
  5. Örnekleri seçin ve son ham verileri işlemeseçin. Arama tamamlandığında, örnekleri seçin ve veri İskelesi 'Ne dışa aktar 'ı seçin (sürüm 3). İskeletleraçın, yeni bir dosya oluşturun ve proteomik platformundan ihraç edilen her dosyayı, habercisi iyon quantitation kullanarak yeni bir biosample olarak alın.
  6. Tüm dosyalar içe aktarıldığında, Yük ve analiz veri ekranına geçin. LFDR Puanlama ve standart deney çapında protein gruplandırma kullanarak arama ve alma verileri için kullanılan aynı veritabanını seçin. Protein tanımlama olasılığı,% 20 ' ye kadar protein eşiği, 1 ' e en az peptit sayısı ve analiz sırasında% 0 ' a kadar peptid eşiği için ekran seçeneklerini ayarlayın.

Sonuçlar

Tek ve birden çok noktalı arginin mutasyonları olan Rev-NoLS, çeşitli hücre içi yerelleştirme desenlerine karşılık gelen WT Rev ile karşılaştırıldığında hücresel ana bilgisayar faktörleriyle etkileşimde bulunma yeteneğiyle incelendi. WT Rev-3' Flag ve pcDNA-bayrağı vector, HLfB kültüründe ifade edildi. Protein kompleksleri toplam hücre lysate işlenmiş ve gümüş leke reakajıyla lekelenmiş. Rev-NoLS-3' bayrağı, Şekil 1' de çeşitli NaCl konsantra...

Tartışmalar

HıV-1 varlığında Rev-NoLS mutasyonları ve WT Rev karşılaştırması kitle spektrometrik analizleri viral çoğaltma döngüsünde yer alan nüklesolar faktörleri anlamak için değerlendirildi. Bu viral infeksiyonun için gerekli nükviolar bileşenlerini belirleyecekti. Nüknikolar B23, Rev-NoLS ' a yüksek benzeşme ve devir3 ' ün nüklevin lokalizasyonunda ve Rev-Bound HIV mrnas22' nin nüklusitoplazmik taşınması işlevlerine sahiptir. Tek veya birden fazla a...

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar Dr. Barbara K. Felber ve Dr George N. Pavlakis HLfB bağlılık kültürü Ulusal Sağlık Enstitüleri (NıH) AıDS araştırma ve referans reaktif programı, Bölüm AıDS, Ulusal alerji ve bulaşıcı Enstitüsü tarafından sağlanan kabul Hastalıklar (NıAıD), NıH. Yazarlar ayrıca NıH, hibe AI042552 ve AI029329 tarafından sağlanan finansal kaynakları kabul.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidFisher ChemicalA38S-212
AcetonitrileFisher ChemicalA955-500
Acrylamide:BisacrylamideBioRad1610158
Ammonium bicarbonateFisher ChemicalA643-500
Ammonium persulfateSigma-Aldrich7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gelSigma-AldrichA2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgGSigma-AldrichF3165
BioMax MS filmCarestream8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mLBio-Rad5000006
B23 mouse monoclonal IgGSanta Cruz Biotechnologiessc-47725
Bromophenol blueSigma-AldrichB0126
Carnation non-fat powdered milkNestleN/A
Cell scraperThermoFisher Scientific179693PK
C18IonKey nanoTile columnWaters186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishesFisher Scientific08-772-22
DithiothreitolThermo ScientificJ1539714
1 x DPBSCorning21-030-CVRS
ECL Estern blotting substratePierce32106
Ethanol, 200 proofFisher ChemicalA409-4
FBSGibco16000044
Formic AcidFisher ChemicalA117-50
GelCode blue stain reagentThermoFisher24590
GlycerolFisher Chemical56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-2005
IodoacetamideACROS Organics122270050
KimWipe delicate task wiperKimberly Clark Professional34120
L-glutamineGibco25030081
MethanolFisher Chemical67-56-1
NanoAcuity UPLCWatersN/A
Pierce Silver Stain KitThermo Scientific24600df
15-mL Polypropylene conical tubeFalcon352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDaThermo Scientific26616
Protease inhibitor cocktailRoche4693132001
Purified BSANew England BiolabsB9001
PVDF  Western blotting membraneRoche3010040001
Sodium PyruvateGibco11360070
10 x TBSFisher BioreagentsBP2471500
TEMEDBioRad1610880edu
Triton X-100 detergent solutionBioRad1610407
Trizaic sourceWatersN/A
trypsin-EDTACorning25-051-CIS
Tween 20BioRad1706531
Synapt G2 mass spectrometerWatersN/A
Whatman filter paperTisch Scientific10427813

Referanslar

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonSay 148HIV 1 o altmaRevImmunoprecipitationk tle spektrometresin klenusB23

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır