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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir Rev-Immunpräzipitation in Gegenwart von HIV-1-Replikation für Massenspektrometrie. Die beschriebenen Methoden können zur Identifizierung von Nukleolar-Faktoren verwendet werden, die am HIV-1-Infektionszyklus beteiligt sind, und sind auf andere Krankheitsmodelle zur Charakterisierung unteruntersuchter Pfade anwendbar.

Zusammenfassung

Der HIV-1-Infektionszyklus erfordert virale Proteininteraktionen mit Wirtsfaktoren, um die Virusreplikation, Verpackung und Freisetzung zu erleichtern. Der infektiöse Zyklus erfordert ferner die Bildung von viralen/Host-Proteinkomplexen mit HIV-1-RNA, um das Spleißen zu regulieren und den nukleozytoplasmatischen Transport zu ermöglichen. Das HIV-1 Rev-Protein führt den nuklearen Export von HIV-1-mRNAs durch Multimerisierung mit intronnischen cis-wirkenden Targets - dem Rev-Reaktionselement (RRE) durch. Im COOH-Terminus des Rev arginin-reichen Motivs (ARM) existiert ein nukleolares Lokalisierungssignal (NoLS), das die Ansammlung von Rev/RRE-Komplexen im Zellkern ermöglicht. Nukleolar-Faktoren werden spekuliert, um den HIV-1-Infektionszyklus durch verschiedene andere Funktionen zu unterstützen, zusätzlich zur Vermittlung von mRNA-unabhängigem Nuklearexport und Spleißen. Wir beschreiben eine Immunpräzipitierungsmethode des WildenTyps (WT) Rev im Vergleich zu Rev-Nukleolar-Mutationen (Deletion und Single-Point Rev-NoLS-Mutationen) in Gegenwart von HIV-1-Replikation für Massenspektrometrie. Nukleolar-Faktoren, die in den nukleozytoplasmatischen Transport (Nucleophosmin B23 und Nucleolin C23) sowie zelluläre Splagenfaktoren involviert sind, verlieren die Interaktion mit Rev in Gegenwart von Rev-NoLS-Mutationen. Verschiedene andere Nukleolar-Faktoren, wie snoRNA C/D-Box 58, werden identifiziert, um die Wechselwirkung mit Rev-Mutationen zu verlieren, aber ihre Funktion im HIV-1-Replikationszyklus bleibt unbekannt. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen die Anwendung dieses Ansatzes zur Identifizierung von viralen/hostennden Nukleolar-Faktoren, die den HIV-1-Infektionszyklus aufrechterhalten. Die in diesem Ansatz verwendeten Konzepte gelten für andere Virus- und Krankheitsmodelle, die die Charakterisierung unterstudierter Pfade erfordern.

Einleitung

Der Nucleolus wird als Interaktionsgrund verschiedener zellulärer Wirts- und Virusfaktoren postuliert, die für die Virusreplikation erforderlich sind. Der Nucleolus ist eine komplexe Struktur, die in drei verschiedene Fächer unterteilt ist: das Fibrillarfach, das dichte Fibrillarfach und das Körnungsfach. Das HIV-1 Rev-Protein lokalisiert sich spezifisch in körnigen Kompartimenten; Der Grund für dieses Lokalisierungsmuster ist jedoch unbekannt. In Gegenwart von Einpunktmutationen innerhalb der NoLS-Sequenz (Rev-Mutationen 4, 5 und 6) behält Rev ein Nukleolar-Muster bei und hat sich zuvor gezeigt, dass es die HIV-1-HXB2-Replikation mit reduzierter Effizienz im Vergleich zu WT Rev 1 rettet. . Alle Einpunktmutationen sind nicht in der Lage, den HIV-1 NL4-3-Infektionszyklus aufrechtzuerhalten. In Gegenwart mehrerer Einzelpunktmutationen innerhalb der NoLS-Sequenz (Rev-NoLS-Mutationen 2 und 9) wurde beobachtet, dass Rev sich im gesamten Kern und Zytoplasma verteilte und nicht in der Lage war, die HIV-1HXB2-Replikation 1zu retten. Das Ziel dieser Proteomik-Studie ist es, Nukleolar sowie nichtnukleolarzelluläre Faktoren zu entschlüsseln, die am Rev-vermittelten HIV-1-Infektionsweg beteiligt sind. Rev Immunpräzipitationsbedingungen werden durch Interaktion mit dem Nukleolar B23 Phosphoprotein optimiert, das zuvor gezeigt hat, dass Die Wechselwirkung mit Rev in Gegenwart von Nukleolar-Mutationen zu verlieren.

Rev zelluläre Faktoren wurden in der Vergangenheit ausgiebig untersucht; Dies wurde jedoch ohne virale Pathogenese getan. Ein Protein, das in dieser Studie durch Rev-Interaktion während der HIV-1-Replikation charakterisiert wird, ist das Nukleolarphosphoprotein B23 - auch Nucleophosmin (NPM), Numatrin oder NO38 bei Amphibien2,3, 4. B23 wird als drei Isoformen (NPM1, NPM2 und NPM3) ausgedrückt - alle Mitglieder der Nucleophosmin/Nukleoplasmin-Kernchaperonfamilie5,6. Das Molekularchaperon NPM1 funktioniert bei der richtigen Montage von Nukleosomen, bei der Bildung von Protein-/Nukleinsäurekomplexen, die an Chromatin-Strukturen höherer Ordnung7,8, und bei der Verhinderung von Aggregation und Fehlfaltung von Zielproteinen durch eine N-Terminal-Kerndomäne (Rückstände 1-120)9. Die NPM1-Funktionalität erstreckt sich auf die Ribosomen-Genese durch den Transport von präribosomalen Partikeln zwischen Dem Nucleus und Demonplasma10,11, die Verarbeitung von präribosomaler RNA in der internen transkribierten Abstandssequenz 12,13, und die Nukleolar-Aggregation von Proteinen während der ribosomalen Montage14,15. NPM1 ist in die Hemmung der Apoptose16 und in die Stabilisierung der Tumorsuppressoren ARF17,18 und p5319verwickelt, was seine Doppelrolle als onkogener Faktor und Tumorsuppressor offenbart. NPM1 beteiligt sich an den zellulären Aktivitäten der Genomstabilität, Zentromatreplikation und Transkription. NPM1 findet sich in Nukleoli während der Zellzyklus-Interphase, entlang der chromosomalen Peripherie während der Mitose und in pränukleolaren Körpern (PNB) am Ende der Mitose. NPM2 und NPM3 sind nicht so gut untersucht wie NPM1, das während der Malignität20veränderte Expressionsniveaus durchläuft.

NPM1 ist in der nukleozytoplasmatischen Abschaltung verschiedener Kern-/Nukleolar-Proteine durch ein internes NES und NLS9,21 dokumentiert und wurde zuvor berichtet, dass sie den nuklearen Import von HIV-1-Tat- und Rev-Proteinen vorantreiben. In Gegenwart von B23-bindungs-Domain--Galactosidase-Fusionsproteinen, Tat misslokalisiert innerhalb des Zytoplasmas und verliert Transaktivierungsaktivität; dies zeigt eine starke Affinität von Tat für B232. Eine andere Studie stellte einen Rev/B23-Stabilen Komplex in Abwesenheit von RRE-haltigen mRNAs fest. In Gegenwart von RRE mRNA trennt sich Rev von B23 und bindet vorzugsweise an die HIV RRE, was zur Verschiebung von B2322führt. Es ist nicht bekannt, wo auf subnuklearer Ebene die Tat-Transaktivierung und der Rev-Austauschprozess von B23 gegen HIV mRNA stattfinden. Beide Proteine werden postuliert, um gleichzeitig durch B23-Wechselwirkung in den Zellkern einzudringen. Die Beteiligung anderer zellulärer Wirtsproteine in den HIV-Nukleolar-Weg wird erwartet. Die in dieser Proteomik-Untersuchung beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, das Zusammenspiel des Zellkerns mit den zellulären Wirtsfaktoren bei der HIV-1-Pathogenese aufzuklären.

Die Proteomik-Untersuchung wurde durch die Expression von Rev NoLS-Einpunktmutationen (M4, M5 und M6) und multiplen Argininsubstitutionen (M2 und M9) für die HIV-1-HXB2-Produktion eingeleitet. In diesem Modell wird eine HeLa-Zelllinie, die Rev-defizitieres HIV-1HXB2 (HLfB) stabil ausdrückt, mit WT Rev- und Rev-Nukleolarmutationen transfiziert, die ein Flag-Tag am Ende der 3 enthalten. Das Vorhandensein von WT Rev ermöglicht eine Virusreplikation in der HLfB-Kultur im Vergleich zu Rev-NoLS-Mutationen, die Rev-Mangel (M2 und M9) nicht retten oder eine Virusreplikation ermöglichen, aber nicht so effizient wie WT Rev (M4, M5 und M6)1. Das Zelllysat wird 48 h später nach viraler Proliferation in Gegenwart von Rev-Expression gesammelt und einer Immunpräzipitation mit einem Lysepuffer ausgesetzt, der für rev/B23-Interaktion optimiert ist. Lysepufferoptimierung mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen wird beschrieben und Proteinelutionsmethoden für HIV-1 Rev werden in silberbefleckten oder Coomassie-gebeizten SDS-PAGE-Gelen verglichen und analysiert. Der erste Proteomik-Ansatz beinhaltet die direkte Analyse einer eluierten Probe aus exprimierter WT Rev, M2, M6 und M9 durch Tandem-Massenspektrometrie. Ein zweiter Ansatz, bei dem die Eluate von WT Rev, M4, M5 und M6 einem Gelextraktionsprozess unterzogen werden, wird mit dem ersten Ansatz verglichen. Die Peptid-Affinität zu Rev-NoLS-Mutationen im Vergleich zu WT Rev wird analysiert und die Proteinidentifikationswahrscheinlichkeit angezeigt. Diese Ansätze zeigen potenzielle Faktoren (Nukleolar und Nonnukleolar), die an HIV-1 mRNA-Transport und Spleißen mit Rev während der HIV-1-Replikation teilnehmen. Insgesamt sind die beschriebenen Zelllyse-, IP- und Elutionsbedingungen auf virale Proteine von Interesse anwendbar, um die zellulären Wirtsfaktoren zu verstehen, die infektionseuchende Bahnen aktivieren und regulieren. Dies gilt auch für die Untersuchung von zellulären Wirtsfaktoren, die für die Persistenz verschiedener Krankheitsmodelle erforderlich sind. In diesem Proteomik-Modell ist HIV-1 Rev IP für die B23-Interaktion optimiert, um Nukleolar-Faktoren aufzuklären, die an der nukleozytoplasmatischen Stilllegungsaktivität und HIV-1-mRNA-Bindung beteiligt sind. Darüber hinaus können Zelllinien entwickelt werden, die fest mit Infektionskrankheiten ausdrücken, die für wichtige Proteine von Interesse mangelhaft sind, ähnlich der HLfB-Zelllinie, um infektiöse Interessenspfade zu untersuchen.

Protokoll

1. Zellkultur

  1. Bewahren Sie HLfB in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) auf, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat in gewebekulturbehandelten 100 mm Platten ergänzt wird. Halten Sie die Zellkulturen bei 37 °C in einembefeuchteten Inkubator, der mit 5% CO2 versorgt wird. Durchgang konfluente Zellen zu einer Zelldichte von 1 x 106 Zellen/ml.
  2. Verwerfen Sie die Zellkulturmedien. Spülen Sie die Zellen vorsichtig mit 10 ml 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Entfernen und verwerfen Sie die 1x-PBS, ohne die Zellenschicht zu unterbrechen.
  3. Fügen Sie den Zellen 2 ml 1x Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Die Schale zum Beschichten der Monoschicht schaukeln und bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer für 5 min inkubieren.
  4. Tippen Sie fest auf die Seite der Schale mit der Handfläche, um die Zellen zu lösen. Setzen Sie die freistehenden Zellen in 8 ml frischer Kulturmedien wieder auf. Drehen Sie die Zellen bei 400 x g für 5 min.
  5. Entsorgen Sie die Kulturmedien, ohne das Zellpellet zu stören. Setzen Sie das Zellpellet in 10 ml frischen Kulturmedien wieder aus. Subkultur 1 ml konzentrierte Zellen mit 9 ml frischen Kulturmedien in gewebekulturbehandelten 100 mm Platten.
    HINWEIS: Für jede Rev-NoLS-Mutation liefern 3x 100 mm HLfB- oder HeLa-Kulturplatten genügend Proteinlysat für die Western-Blot-Analyse und Massenspektrometrie. Fügen Sie zusätzliche Platten für einen WT Rev-Positiv- und Negativkontroll- und Negativkontroll hinzu. Das Volumen der Subkulturzellen erfordert eine Optimierung mit der Verwendung verschiedener Zelltypen.

2. Ausdruck von Rev-NoLS-3'flag Mutationen während der HIV-1-Replikation

  1. Wachsen Sie die HLfB-Zellkultur auf eine Zelldichte von 2 x 106 Zellen/ml. Bereiten Sie 4 ml Calciumphosphat-DNA-Suspension für jede 100-mm-Platte wie folgt vor.
    1. Etikettieren Sie zwei 15 ml Rohre als 1 und 2. 2 ml 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl und 1,5 mM Na2HPO4 [pH 7.12]) zu Rohr 1 geben. TE 79/10 (1 mM Tris-HCl und 0,1 mM EDTA [pH 7.9]) zu Rohr 2 hinzufügen. Das Volumen von TE 79/10 beträgt 1.760 ml - das Volumen der DNA.
    2. Fügen Sie 20 g Plasmid, das die Rev-NoLs-3'flag-Mutation von Interesse enthält, zu Tube 2 hinzu und mischen Sie ihren Inhalt durch Resuspension. 240 L von 2 M CaCl2 zu Tube 2 geben und durch Resuspension erneut mischen.
    3. Übertragen Sie das Gemisch von Rohr 2 auf Tube 1 tropfenweise, sanft mischen. Lassen Sie die Suspension bei Raumtemperatur für 30 min sitzen. Wirbel die Niederschlag.
  2. Fügen Sie 1 ml der Aufhängung tropfenweise zu jeder der 3-Zellen-Kultur, 100 mm Platten, während sanft wirbeln die Medien. Geben Sie die Platten in den Inkubator zurück und lassen Sie die Transfektionsmischung 6 h. Ersetzen Sie die Transfektionsmischung durch 10 ml frische Kulturmedien und inkubieren Sie die Zellen für 42 h.

3. Sammlung von viralem Proteinlysat

  1. Entsorgen Sie die Zellmedien 48 h Posttransfektion. Legen Sie jede 100 mm Platte auf ein Bett aus Eis. 15 ml-Rohre für jede Rev-NoLS-Mutationsprobe beschriften und die Rohre auf Eis legen.
  2. Spülen Sie die Zellen vorsichtig mit 10 ml vorgechillter 1x PBS, ohne die Zellschicht zu stören. Entsorgen Sie die 1x PBS. Fügen Sie 3 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 137 mM NaCl und 1% X-100 Waschmittel [siehe Materialtabelle]), mit Protease-Hemmer-Cocktail behandelt, zu jeder der 100 mm Platten.
  3. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellenschicht zu unterbrechen. Neigen Sie die Platte und kratzen Sie sanft und sammeln Sie die Zellen in einem Pool. Sammeln Sie das Zelllysat mit einer 1.000-L-Mikropipette und mischen Sie die Zelllysate aus jeder der drei 100-mm-Platten im voretikettierten 15-ml-Rohr.
  4. Inkubieren Sie die Zelle 15 min lang auf Eis und wirbeln alle 5 min. Zentrifugieren Sie die Zelle bei 15.000 x g für 5 min.
  5. Sammeln Sie das Protein Überstand, ohne die Zelle SchmutzPellet stören und übertragen Sie es auf eine andere sterile 15 ml Röhre. Erhalten Sie die virale Proteinlysatkonzentration mit der Bradford-Methode (siehe Abschnitt 4).
  6. Speichern Sie ein Aliquot der Eingangsstichprobe (20 g) für die westliche Immunoblot-Analyse. 2x Probenpuffer (20% Glycerin, 0,02% Bromphenolblau, 125 mM Tris-Cl [pH 6.8], 5% SDS und 10% 2-Mercaptoethanol) zum Endvolumen hinzufügen. 10 min bei 95 °C kochen und die Eingangsprobe bei -20 °C lagern.

4. Bradford Assay

HINWEIS: Bereiten Sie 10x Rinderserumalbumin (BSA) aus 100x BSA-Bestand vor, bevor Sie Proteinstandardkurven erzeugen.

  1. Aliquot Wasser in Mikrozentrifugenrohre für die folgenden Rohlinge und Normen: Leer = 800 l; Standard 1 = 2 mg/ml, 798 l; Standard 2 = 4 mg/ml, 796 l; Standard 3 = 6 mg/ml, 794 l; Standard 4 = 8 mg/ml, 792 l; Standard 5 = 10 mg/ml, 790 l. Aliquot 10x BSA in die folgenden festgelegten Normen: Standard 1 = 2 l; Standard 2 = 4 l; Standard 3 = 6 l; Standard 4 = 8 l; Standard 5 = 10 l.
  2. Bereiten Sie eine Mischung von Proteinproben vor, indem Sie 795 l Wasser mit 5 l Proteinproben mischen. Fügen Sie jeder Rohlings-, Standard- und Proteinprobe 200 L Protein-Assay-Farbstoff-Reagenz (siehe Materialtabelle)hinzu. Die Proben kurz für eine gleichmäßige Mischung vortexen und bei Raumtemperatur (18-20 °C) 5 min inkubieren.
  3. Übertragen Sie die Rohlinge, Standards und Proteinproben auf Küvetten. Messen Sie die Proteinkonzentrationen bei einer OD von 595 nm.

5. Koimmunitititation von Rev-NoLS-3'flag

  1. Spülen Sie 25 L M2-Affinitäts-Gelperlen (siehe Materialtabelle) mit 500 l Lysepuffer, behandelt mit Protease-Hemmer-Cocktail. Spülen Sie mehr Affinität Gel Perlen für jede Mutation Probe und Kontrollen.
    HINWEIS: Bereiten Sie genügend M2-Affinitäts-Gelperlen für zwei Gele (50 l) vor - eines für die westliche Immunoblot-Analyse und das andere für Proteinfärbung und Massenspektrometrie.
  2. Drehen Sie bei 820 x g für 2 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand. 2x mehr abspülen.
  3. Fügen Sie virales Proteinlysat (1 mg/ml in 5 ml Gesamtvolumen) zu den prerinsed M2-Affinitätsperlen hinzu. Passen Sie das Gesamtvolumen mithilfe des Lysepuffers an.
  4. Inkubieren Sie die Reaktion für 3 h, rotieren bei 4 °C. Zentrifugieren Sie die M2-Affinitätsperlen/virales Proteinlysat bei 820 x g für 1 min.
  5. Sammeln Sie den Überstand und speichern Sie ein Aliquot der Post-IP-Probe (20 g) für die westliche Immunoblot-Analyse. Messen Sie die Proteinkonzentration des Post-IP-Lysats. Sammeln Sie 20 g für westliche Immunoblotting.
  6. Fügen Sie dem endgültigen Volume 2x Beispielpuffer hinzu. 10 min bei 95 °C aufkochen und die Post-IP-Probe bei -20 °C lagern.
  7. Spülen Sie die M2-Perlen mit 750 l Lysepuffer und waschen Sie die Perlen auf einem Rotator bei 4 °C für 5 min. Zentrifugieren Sie die M2-Perlen bei 820 x g und entsorgen Sie den Überstand.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 5.7 für zwei weitere Wähen an einem Rotator bei 4 °C für 5 min. Entfernen Sie nach der dritten Wäsche alle Spuren des Lysepuffers aus dem M2-Perlen-/Co-IP-Komplex mit einer langen Gel-Ladespitze.
    HINWEIS: Kneifen Sie das Ende der Gel-Ladespitze mit einer flachen Pinzette, bevor Sie Spuren mengen des Lysepuffers entfernen. Dadurch wird die Störung und Aufnahme der M2-Perlen verhindert.
  9. Setzen Sie die M2-Perlen in 55 l mit 2x Ladepuffer aus. Die Probe 10 min bei 95 °C aufkochen.
  10. 25 L Eluat auf zwei separate SDS-PAGE Gele (ein Gel für westliche Immunoblotting und das andere für Coomassie-Färbung) laden.

6. Herstellung von SDS-PAGE Gelen

  1. Gießen Sie zwei 15% SDS-Acrylamid-Lösende Gele durch Mischen der folgenden Reagenzien in ein 50 ml-Rohr (bei einem Endvolumen von 40 ml, genug für vier Gele): 4,16 ml Reinstwasser, 15 ml 40% Acrylamid:Bisacrylamid (29:1), 10 ml von 1,5 m Tris-HCl (pH 8,8) , 400 l mit 10 % SDS, 400 l 10 % Ammoniumpersulfat und 40 l TEMED.
  2. Mischen Sie das auflösende Gel, indem Sie das 50 ml-Rohr mehrmals invertieren. Die auflösende Gelmischung in ein vorgereinigtes westliches Gelgerät (vier Gele - drei für westliche Immunoblotting und eines für Coomassie/Silberfärbung) pfeifen.
  3. Sanft Pipette genug Wasser, um die obere Schicht der Gelmischung zu bedecken. Lassen Sie das auflösende Gel polymerisieren.
  4. Gießen Sie die Wasserschicht aus dem lösenden Gel, mit einem empfindlichen Aufgabenwischer (siehe Tabelle der Materialien), um überschüssiges Wasser zu absorbieren.
  5. Gießen Sie zwei 5% SDS-Acrylamid-Stapelgele durch Mischen der folgenden Reagenzien in ein 50 ml-Rohr (bei einem Endvolumen von 20 ml, genug für vier Gele): 11,88 ml Reinstwasser, 2,5 ml 40 % Acrylamid:Bisacrylamid (29:1), 5,2 ml 1,5 m Tris-HCl (pH 8,8) , 200 l von 10% SDS, 200 l mit 10% Ammoniumpersulfat und 20 l TEMED.
  6. Mischen Sie das Stapelgel, indem Sie das 50 ml-Rohr mehrmals invertieren. Pipette die Stapelgelmischung über dem auflösenden Gel an die Oberseite des Geräts.
  7. Legen Sie einen Gelkassettenkamm mit der entsprechenden Anzahl von Bahnen in das Stapelgel. Absorbieren Sie einen Überlauf der Gelmischung mit einem empfindlichen Aufgabenwischer (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das Stapelgel vollständig polymerisieren.
  8. Überfluten Sie das westliche Gelgerät mit 1x Western-Laufpuffer (5x Konzentration: 250 mM Tris-Cl [pH 8.3], 1,92 M Glycin, 0,5% SDS und 10 mM EDTA).
  9. Ziehen Sie den Gelkassettenkamm vorsichtig aus dem Stapelgel. Erlauben Sie dem 1x westlichen Laufpuffer, die Ladebrunnen zu füllen. Spülen Sie jeden Brunnen mit 1x western Laufpuffer mit einer Spritze vor dem Laden der Proben.
  10. Laden Sie die westlichen Immunoblot-Proben in jedes entsprechende Gel (Eingangsproben, koimmunvorzipierte Proben und Post-IP-Proben). Laden Sie die westlichen Gelproteinmarker.
  11. Die koimmunpräzipierten Proben für die Coomassie/Silberfärbung in ein anderes Gel eintragen. Laden Sie die westlichen Gelproteinmarker.
  12. Schließen Sie das Laufgelgerät an eine Stromquelle an und führen Sie die Gele bei 100 V aus, bis der Ladefarbstoff das auflösende Gel erreicht. Erhöhen Sie die Spannung auf 140 V, bis der Ladefarbstoff den Boden des Auflösenden Gels erreicht.

7. Western Blot Transfer

  1. Zerlegen Sie den westlichen Gelapparat. Schneiden und entsorgen Sie das Stapelgel, so dass das auflösende Gel intakt bleibt.
  2. Übertragen Sie die auflösenden Gele vorsichtig in ein sauberes Tablett, das mit einem westlichen Transferpuffer gefüllt ist (25 mM Tris, 194 mM Glycin, 0,005% SDS, 20% Methanol) und tränken Sie sie 15 min.
  3. Montieren Sie das Gel-Transfergerät wie folgt.
    1. Schneiden Sie drei PVDF-Transfermembranen und sechs Stück Filterpapier (siehe Materialtabelle)auf die Größe des auflösenden Gels.
    2. Die PVDF-Membran 5 min in Methanol einweichen. 5 min in Wasser hydratisieren. Legen Sie die PVDF-Membran in den westlichen Transferpuffer, bis sie einsatzbereit ist.
    3. Legen Sie die Gelhalterkassette in ein Glasbackblech, das teilweise mit einem westlichen Transferpuffer gefüllt ist, mit der schwarzen Seite an der Unterseite.
    4. Legen Sie ein mit westlichem Transferpuffer getränktes Schaumstoffpad gegen die schwarze Seite der Gelhalterkassette.
    5. Befeuchten Sie ein Stück Filterpapier im westlichen Transferpuffer und legen Sie es auf das Schaumstoffpad. Legen Sie das Auflösendes Gel auf das Filterpapier.
      HINWEIS: Legen Sie das auflösende Gel in die richtige Ladeausrichtung, die auf die PVDF-Membran übertragen werden soll.
    6. Legen Sie eine PVDF-Transfermembran auf das auflösende Gel. Befeuchten Sie ein Stück Filterpapier mit einem westlichen Transferpuffer und legen Sie es auf die PVDF-Transfermembran.
    7. Legen Sie ein weiteres Schaumstoffpad mit westlichem Transferpuffer auf das Filterpapier. Falten Sie vorsichtig die weiße Seite der Gelhalterkassette auf dem eingeweichten Schaumstoffpad. Verriegeln Sie die Kassette fest.
    8. Legen Sie die Gelhalterkassette in die Elektrodenbaugruppe des Transfergeräts. Wiederholen Sie die Schritte 7.3.4-7.3.8 für jedes verbleibende Auflösungsgel.
    9. Füllen Sie den Transfergerätetank mit einem westlichen Transferpuffer. Legen Sie eine Rührstange in den Gerätetank.
    10. Stellen Sie den Gerätetank auf eine Rührplatte. Stellen Sie die Rühreinstellung auf 5-6 ein, um sicherzustellen, dass die Rührstange nicht feststeckt oder die Gelhalterkassetten trifft.
    11. Schließen Sie das Gel-Transfergerät an eine Stromquelle an und übertragen Sie das Gel bei 100 V für 1 h bei 4 °C.

8. Immunoblotting

  1. Entfernen Sie die Gelhalterkassette und legen Sie die schwarze Seite gegen ein sauberes Glasbackblech. Öffnen Sie die Kassette und entsorgen Sie das Schaumstoffpad und Filterpapier sorgfältig. Markieren Sie eine Ecke der PVDF-Membran, um die richtige Ladeausrichtung zu identifizieren. Halten Sie die Membran nass.
    HINWEIS: Die PVDF-Membran kann luftgetrocknet und in einem sauberen, versiegelten Behälter gelagert werden. Rehydrieren Sie die Membran durch Wiederholung der Schritte 7.3.2.
  2. Legen Sie die Membran in 100 ml Blockierlösung (5% Milch, 1x TBS und 0,1% Tween 20). Blockieren Sie die Membran durch sanftes Schaukeln bei Raumtemperatur (18-20 °C) für 1 h.
  3. Schneiden Sie die Membran über dem 25 kDa Proteinmarker. Legen Sie den oberen Teil der Membran, der Proteinbänder größer als 25 kDa enthält, in eine Blockierende Lösung, die B23 Maus monoklonalEs IgG1 (1:500 Verdünnung) enthält. Über Nacht blockieren, bei 4 °C schaukeln.
  4. Platzieren Sie den unteren Teil der Membran, der Proteinbänder kleiner als 25 kDa enthält, in eine Blockierende Lösung, die M2-Mausmonoklonig1 enthält (1:1.000 Verdünnung, siehe Materialtabelle). Über Nacht blockieren, bei 4 °C schaukeln.
  5. Waschen Sie die Membran 3x für 10 min in 25 ml westliche Waschlösung (1x TBS, 0.1% Tween 20) auf einer Schaukelplattform.
  6. Inkubieren Sie die Membranen in Ziegenanti-Maus IgG1-HRP (1:5.000 Verdünnung) in Blockierlösung für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt. Waschen Sie die Membran 3x für 10 min in 25 ml westliche Waschlösung auf einer Schaukelplattform.
  7. Bereiten Sie Chemilumineszenz westlichen Blotting Substrat. Verwenden Sie eine p1000 Mikropipette, um das Substrat zur Membran hinzuzufügen.
  8. Entwickeln Sie jede Membran in Chemilumineszenz westlichen Blotting Substrat für 5 min. Entfernen Sie die Membran aus dem Substrat. Überschüssiges Substrat mit einem empfindlichen Aufgabenwischer absorbieren (siehe Tabelle der Materialien).
  9. Legen Sie die Membran in einen sauberen Blattschutz, der an der Innenseite einer Kassette verklebt ist. Nehmen Sie die Kassette in einen dunklen Raum und legen Sie ein Blatt Film in die Kassette. Verriegeln Sie die Kassette an Ort und Stelle und brüten Sie für 5–15 min. Entfernen Sie den Film aus der Kassette und entwickeln Sie ihn.

9. Coomassie Färbung

  1. Zerlegen Sie den westlichen Gelapparat. Schneiden und entsorgen Sie das Stapelgel, so dass das auflösende Gel intakt bleibt. Übertragen Sie das auflösende Gel vorsichtig auf ein sauberes Tablett, das mit 25 ml Reinstwasser gefüllt ist.
  2. Inkubieren Sie das Gel auf einer Schaukelplattform für 15 min. Verwenden Sie sanftes Schaukeln, um zu verhindern, dass das auflösende Gel bricht. Entsorgen Sie das Reinstwasser und wiederholen Sie den Waschschritt 2x mehr.
    HINWEIS: Wenn SDS-Blasen nach den Waschschritten verbleiben, kann das Gel über Nacht in Reinstwasser gewaschen werden. Rest-SDS kann zu einer hohen Hintergrundfärbung des Gels führen.
  3. Mischen Sie das Coomassie-Fleckenreagenz, indem Sie die Flasche invertieren (siehe Materialtabelle). Legen Sie 100 ml Coomassie-Fleckenreagenz, um das auflösende Gel zu bedecken und das Gel für 1 h auf einer Schaukelplattform zu bebrüten. Entsorgen Sie das Coomassie-Fleckenreagenz und waschen Sie das Gel in entionisiertem Wasser auf einer Schaukelplattform für 15 min.
  4. Entsorgen Sie das entionisierte Wasser. Wiederholen Sie den Waschschritt 2x mehr. Waschen Sie das Gel weiter, bis die gewünschte Auflösung von Proteinbändern beobachtet wird.

10. Silberfärbung

  1. Zerlegen Sie den westlichen Gelapparat. Schneiden und entsorgen Sie das Stapelgel, so dass das auflösende Gel intakt bleibt. Übertragen Sie das auflösende Gel vorsichtig auf ein sauberes Tablett, das mit 25 ml Reinstwasser gefüllt ist.
  2. Inkubieren Sie das Gel auf einer Schaukelplattform für 15 min. Verwenden Sie sanftes Schaukeln, um zu verhindern, dass das auflösende Gel bricht. Entsorgen Sie das Reinstwasser und wiederholen Sie den Waschschritt 2x mehr.
    HINWEIS: Wenn SDS-Blasen nach den Waschschritten verbleiben, kann das Gel über Nacht in Reinstwasser gewaschen werden. Rest-SDS kann zu einer hohen Hintergrundfärbung des Gels führen.
  3. Fixieren Sie das Gel in 30% Ethanol:10% Essigsäurelösung (6:3:1 Wasser:Ethanol:Essigsäure) über Nacht bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Gel in einer 10% Ethanollösung für 5 min bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie die Ethanollösung und waschen Sie weitere 5 min.
  4. Bereiten Sie die Sensibilisator-Arbeitslösung aus dem Pierce Silver Stain Kit vor, indem Sie einteiligesilberfarbene Fleckensensibilisator mit 500 Teilen Reinstwasser (50 l Sensibilisator mit 25 ml Reinstwasser) mischen. Inkubieren Sie das lösende Gel in der Sensibilisator-Arbeitslösung für 1 min. Waschen Sie das Gel in Reinstwasser für 1 min, ersetzen Sie das Wasser, und waschen Sie das Gel erneut für 1 min.
  5. Bereiten Sie die Schmutzbearbeitungslösung vor, indem Sie einteiligen Silberfleckverstärker mit 50 Teilen Silberfleck (500 l Enhancer mit 25 ml Silberfleck) mischen. Inkubieren Sie das Gel in der Fleckenarbeitslösung für 30 min.
  6. Bereiten Sie Entwickler-Arbeitslösung durch Mischen 1 Teil Silber Fleck Enhancer mit 50 Teile Silber Fleck Entwickler (500 L Enhancer mit 25 ml Entwickler). Bereiten Sie 5% Essigsäurelösung als Stop-Lösung vor. Waschen Sie das Gel mit reinem Wasser für 1 min, ersetzen Sie das Wasser, und waschen Sie das Gel für eine zusätzliche 1 min.
  7. Ersetzen Sie das Wasser durch die Entwicklerlösung und brüten Sie, bis die gewünschte Proteinbandintensität aufgelöst ist (5 min). Ersetzen Sie die Entwicklerlösung durch Stop-Lösung und inkubieren Sie 10 min.

11. In-Gel-Reduktion, Alkylierung und Verdauung von Coomassie-gefärbten Gelbändern

  1. Schneiden Sie die Gelbänder aus dem Gel mit einer sauberen Rasierklinge. Schneiden Sie jedes Gelband in ca. 5 mm Würfel und legen Sie es in ein sauberes 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
  2. Die Gelstücke entkernen, indem sie mit 100 mM Ammoniumbicarbonat in 1:1 Acetonitrile: Wasser bei Raumtemperatur für 15 min. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt.
  3. Trocknen Sie die Gelstücke für 5 min in einer Vakuumzentrifuge. Reduzieren Sie die Proteine, indem Sie die getrockneten Gelstücke mit 10 mM Dithiothreitol in 100 mM Ammoniumbicarbonat bedecken und 1 h bei 56 °C inkubieren.
  4. Pipette von jedem Überstand. Alkylieren Sie die Proteine, indem Sie die Gelstücke mit 100 mM Iodoacetamid in Wasser bedecken und sie 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
  5. Pipette aus dem Überstand und schrumpfen Sie die Gelstücke, indem Sie sie mit Acetonitril bedecken und schütteln Sie sie sanft bei Raumtemperatur für 15 min. Pipette aus dem Überstand und wieder aufziehen die Gelstücke, indem Sie sie mit 100 mM Ammoniumbicarbonat bedecken und schütteln sie bei Raumtemperatur für 15 min.
  6. Wiederholen Sie Schritt 11.5. Trocknen Sie die Gelstücke für 5 min in einer Vakuumzentrifuge.
  7. Bedecken Sie die Gelstücke mit 50 ng/l Sequenzierungsgrad modifiziertes Trypsin (siehe Materialtabelle)in 100 mM Ammoniumbicarbonat. Lassen Sie das Gel für 5 min anschwellen; dann Pipette von jeder verbleibenden Lösung. Bedecken Sie die Gelstücke mit 100 mM Ammoniumbicarbonat und lassen Sie sie vollständig wieder anschwellen, wobei zusätzliche 100 mM Ammoniumbicarbonat hinzugefügt werden, so dass die Gelstücke vollständig abgedeckt sind.
  8. Die Gelstücke über Nacht bei 37 °C bebrüten. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 1/10 des Volumens von 10% Ameisensäure in Wasser hinzufügen. Sammeln Sie den Überstand aus jeder Röhre.
  9. Extrahieren Sie die Gelstücke, indem Sie sie mit 1% Ameisensäure in 60% Acetonitril bedecken und 15 min mit sanftem Schütteln inkubieren.
  10. Reduzieren Sie das Volumen der kombinierten Überstande in einer Vakuumzentrifuge auf weniger als 20 l, wobei Sie darauf achten, dass die Überstande vollständig getrocknet wird. Fügen Sie 1% Ameisensäure hinzu, um das Gesamtvolumen wieder auf 20 l zu bringen.

12. Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie

HINWEIS: Die Proben wurden mit einem Massenspektrometer analysiert, das mit Ultra-HPLC, einer Nanospray-Quelle und einer Spalte ausgestattet war (siehe Tabelle der Materialien). Die Lösungsmittel A und B sind 0,1 % Ameisensäure in Wasser bzw. Acetonitril.

  1. Laden Sie die verdauten Proteine in hochrückeliche Polypropylen-Autosampler-Fläschchen. Laden Sie die Durchstechflaschen in den Probenmanager eines UPLC-Systems.
  2. Injizieren Sie 6 l jeder Probe. Jede Probe mit 99 % Lösungsmittel A/1% Lösungsmittel B auf die Fangsäule des Nanoflies für 1,5 min bei 8 l/min laden.
  3. Elute die Peptide in das Massenspektrometer mit einem linearen Gradienten von 3% bis 35% des Lösungsmittels B über 30 min, gefolgt von einem Gradienten von 35% bis 50% des Lösungsmittels B über 4 min und 50% bis 90% des Lösungsmittels B über 1 min. Halten Sie 90% Acetonitril für 3 min; dann reduzieren Sie die %B zurück auf 3% über 5 min.
  4. Erfassen Sie positive Ionenprofil-Massenspezifikationsdaten im Auflösungsmodus (20.000 Auflösung). Erfassen Sie Daten von 100 bis 2.000 Da mit einer Rate von einem Scan alle 0,6 s. Erfassen Sie Daten im MS E-Modus durch abwechselnde Scans ohne Kollisionsenergie und Scans mit erhöhter Kollisionsenergie.
  5. Für die erhöhte Kollisionsenergie, Rampe die Kollisionsenergie in der Trap-Zelle von 15 V bis 40 V. Erwerben Sie einen Schleusenmassenscan alle 30 s, mit dem +2-Ionen von [Glu1]-Fibrinopeptid B als Sperrmasse. Erfassen Sie eine Datendatei mit einer leeren Injektion von Lösungsmittel A, wobei die gleiche Erfassungsmethode zwischen jedem Probenpaar verwendet wird, um die Übertragung zu steuern.

13. Datenanalyse für Dierometrie

  1. Kopieren Sie die Massenspektrometrie-Ergebnisdateien auf den Computer, auf dem eine quantitative und qualitative Proteomik-Forschungsplattform (z. B. ProteinLynx Global Server) ausgeführt wird. Die Datenanalyse ist sehr CPU-intensiv und sollte auf einem separaten, leistungsstarken Datenanalysecomputer durchgeführt werden.
  2. Erstellen Sie ein neues Projekt für die Daten. Erstellen Sie eine neue Mikrotiterplatte, die die Autosampler-Platte darstellt. Weisen Sie die Proben der gleichen Position in der Mikrotiterplatte zu wie ihre Position im Autosampler.
  3. Weisen Sie die einzelnen Beispielverarbeitungsparameter zu. Zu verwendende Parameter sind automatische chromatographische Spitzenbreite und MSTOF-Auflösung; Niedrigenergieschwelle, 100 Zählungen; Erhöhte Energieschwelle, 5 Zähler; Intensitätsschwelle, 500 zählt.
  4. Weisen Sie die einzelnen Beispielworkflowparameter zu. Parameter, die verwendet werden können, sind Datenbank, verkettetes humanes SwissProt und HIV, mit umgekehrten Sequenzen; automatische Peptid- und Fragmenttoleranz; min Fragment-Ionen-Matches pro Peptid, 3; min Fragmention-Matches pro Protein, 7; min Peptid-Matches pro Protein, 1; primäres Verdauungsreagenz, Trypsin; verpasste Spaltungen, 1; feste Modifikatorreagenzien, Carbamidmethyl C; variable Modifikatorreagenzien, Oxidation M; falsche Ermittlungsrate, 100.
  5. Wählen Sie die Beispiele aus, und wählen Sie Prozessneueste Rohdatenaus. Wenn die Suche abgeschlossen ist, wählen Sie die Beispiele aus und wählen Sie Daten in Gerüst exportieren (Version 3). Öffnen Sie Gerüst, erstellen Sie eine neue Datei, und importieren Sie jede Datei, die von der Proteomics-Plattform exportiert wird, als neue Biosample unter Verwendung der Vorläuferionenquantifizierung.
  6. Wenn alle Dateien importiert wurden, fahren Sie mit dem Bildschirm Daten laden und analysieren fort. Wählen Sie dieselbe Datenbank aus, die für die Suche und den Import von Daten verwendet wird, indem Sie LFDR-Scoring und standardexperimentelle Proteingruppierung verwenden. Legen Sie die Anzeigeoptionen auf Protein-Identifikationswahrscheinlichkeitfest, den Proteinschwellenwert auf 20 %, die Minimale Anzahl von Peptiden auf 1 und den Peptidschwellenwert während der Analyse auf 0 %.

Ergebnisse

Rev-NoLS Ein- und Mehrpunkt-Argininmutationen, die einer Vielzahl subzellulärer Lokalisierungsmuster entsprechen, wurden in ihrer Fähigkeit untersucht, mit zellulären Wirtsfaktoren im Vergleich zu WT Rev. WT Rev-3'flag und pcDNA-flag zu interagieren. Vektor wurden in der HLfB-Kultur ausgedrückt. Proteinkomplexe wurden aus dem gesamten Zelllysat verarbeitet und mit Silberfleckreagenz gebeizt. Rev-NoLS-3'flag ist in Abbildung 1(ca. 18 kDa) in drei verschiedenen Lysepufferbedingung...

Diskussion

Massenspektrometrische Analysen, die Rev-NoLS-Mutationen und WT Rev in Gegenwart von HIV-1 verglichen, wurden bewertet, um Nukleolar-Faktoren zu verstehen, die am Virusreplikationszyklus beteiligt sind. Dadurch würden Nukleolar-Komponenten identifiziert, die für die virale Infektiosität erforderlich sind. Nucleolar B23 hat eine hohe Affinität zu Rev-NoLS und Funktionen in der Nukleolarlokalisation von Rev3 und nukleozytoplasmatischem Transport von Rev-gebundenen HIV mRNAs22

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren würdigen Dr. Barbara K. Felber und Dr. George N. Pavlakis für die HLfB-Anhängerkultur, die von den National Institutes of Health (NIH) AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious zur Verfügung gestellt wird. Krankheiten (NIAID), NIH. Die Autoren würdigen auch Finanzquellen des NIH, Grants AI042552 und AI029329.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidFisher ChemicalA38S-212
AcetonitrileFisher ChemicalA955-500
Acrylamide:BisacrylamideBioRad1610158
Ammonium bicarbonateFisher ChemicalA643-500
Ammonium persulfateSigma-Aldrich7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gelSigma-AldrichA2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgGSigma-AldrichF3165
BioMax MS filmCarestream8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mLBio-Rad5000006
B23 mouse monoclonal IgGSanta Cruz Biotechnologiessc-47725
Bromophenol blueSigma-AldrichB0126
Carnation non-fat powdered milkNestleN/A
Cell scraperThermoFisher Scientific179693PK
C18IonKey nanoTile columnWaters186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishesFisher Scientific08-772-22
DithiothreitolThermo ScientificJ1539714
1 x DPBSCorning21-030-CVRS
ECL Estern blotting substratePierce32106
Ethanol, 200 proofFisher ChemicalA409-4
FBSGibco16000044
Formic AcidFisher ChemicalA117-50
GelCode blue stain reagentThermoFisher24590
GlycerolFisher Chemical56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-2005
IodoacetamideACROS Organics122270050
KimWipe delicate task wiperKimberly Clark Professional34120
L-glutamineGibco25030081
MethanolFisher Chemical67-56-1
NanoAcuity UPLCWatersN/A
Pierce Silver Stain KitThermo Scientific24600df
15-mL Polypropylene conical tubeFalcon352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDaThermo Scientific26616
Protease inhibitor cocktailRoche4693132001
Purified BSANew England BiolabsB9001
PVDF  Western blotting membraneRoche3010040001
Sodium PyruvateGibco11360070
10 x TBSFisher BioreagentsBP2471500
TEMEDBioRad1610880edu
Triton X-100 detergent solutionBioRad1610407
Trizaic sourceWatersN/A
trypsin-EDTACorning25-051-CIS
Tween 20BioRad1706531
Synapt G2 mass spectrometerWatersN/A
Whatman filter paperTisch Scientific10427813

Referenzen

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