Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

Özet

Chromatin immünoprecipitation (ChIP) gen yönetmeliğinin moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, yöntem mekanik kesme tarafından tekrarlanabilir kromatin parçalanma elde zorlukları içerir. Burada, enzimatik sindirim kullanarak bir çip tahlil için geliştirilmiş bir protokol sağlar.

Özet

Organizmalarda hücresel fenotipleri ifade etmek için, yaşam hücreleri buna göre gen ifadesi yürütmek, ve transkripsiyon programları gen ifadesinde merkezi bir rol oynamaktadır. Hücresel transkripsiyonel makine ve kromatin modifikasyon proteinleri transkripsiyon düzenleyen koordine. Moleküler düzeyde transkripsiyon düzenlemesi analiz etmek için, elektroforetik hareketlilik vardiya, geçici muhabir ve kromatin immünopetürasyon (çip) gibi çeşitli deneysel yöntemler mevcuttur. Biz doğrudan histon modifikasyonları ve hücrelerde protein ve DNA arasındaki etkileşimleri gösteren avantajları nedeniyle bu makalede ayrıntılı olarak değiştirilmiş bir çip tahlil tarif. Başarılı bir ChIP tahlil önemli adımlardan biri kromatin kesme olduğunu. Sonication genellikle kromatin kesme için kullanılan olsa da, tekrarlanabilir koşulları belirlemek zordur. Yerine sonication tarafından kromatin kesme, biz mikrococcal nükleaz ile enzimatik sindirim kullanılmıştır (mnase) daha tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için. Bu yazıda MNase kullanarak basit bir ChIP assay Protokolü sağlıyoruz.

Giriş

Memelinin hücrelerinde gen ifadesi sıkıca ve dinamik olarak düzenlenir ve transkripsiyon önemli adımlardan biridir. Gen transkripsiyon ağırlıklı olarak transkripsiyon faktörleri ve Histonlar tarafından düzenlenir. Transkripsiyon faktörü belirli DNA dizileri bağlayan ve Gen transkripsiyonu kontrol eden bir proteindir. Bu faktörler ya teşvik veya RNA polimeraz II (polıı), bir şablon¹olarak genomik DNA mRNA sentezini Başlatan işe inhibe. Histon kuyruk kalıntılarının asetilasyon ve metilasyonu gibi histon değişimleri, kromatin yapısını değiştirerek Gen transkripsiyonu olumlu ve olumsuz yönde etkiler². Gen ifadesinde yapılan değişiklikler hücresel içeriği etkilediği için, transkripsiyon tarafından düzenlenmiş moleküler mekanizmaları incelemek önemlidir.

Bugüne kadar, gen transkripsiyon düzenlenmesi için çeşitli yöntemler mevcuttur. Elektroforetik hareketlilik vardiya tahlil (EMSA), aynı zamanda bir jel vardiya tahlil olarak adlandırılan, bir protein-DNA etkileşimi analiz etmek için kullanılır³. Bir nükleer ekstresi, ilgi hücrelerinden bir radyoaktif izotopu (örneğin, ³²P) ile inkübe edilir-etiketli DNA prob ve bir polyacrylamid jel üzerinde elektroforesed. Autoradiogram, DNA-protein kompleksinin bir jeldeki Probtan daha yavaş olduğunu gösteriyor. Proteine karşı bir antikor varlığında, DNA-protein-antikor kompleksi bir jel içinde DNA-protein kompleksinden daha yavaş bir şekilde göç eder. Bu süper kaymalı bant DNA ve protein arasındaki belirli bağı ortaya çıkarır. Ancak, EMSA sadece hücre içermeyen bir sistemde belirli bir DNA-protein etkileşimi belirler ve bu nedenle etkileşim yaşam hücrelerinde transkripsiyon kontrol olup olmadığını bilinmeyen kalır. Geçici muhabir tahlil, yaygın Lusiferaz muhabir tahlil denilen, hücrelerde gen ifade düzenleme adresi için geliştirilmiştir. Tipik olarak, bir faiz geni bir upstream genomik bölge bir muhabir Plasmid içine eklenir, geçmeli hücrelere transfekte, ve muhabir aktivite ölçülür. Çeşitli silme mutantları, gen düzenlemeden sorumlu bölgelerin tanımlanması sağlar. Bir muhabir tahlil transkripsiyon faktörleri ve bağlayıcı DNA dizileri transkripsiyon kontrol tanımlamak için yararlı bir araçtır olsa bile, bu yöntem bir gazeteci plazmid kromatin yapısının ücretsiz ve "gerçek" yansıtmaz büyük bir dezavantajı vardır Transkripsiyon makineleri. Buna ek olarak, histon değişikliklerinin değişiklikleri sistem tarafından belirlenemez.

Kromatin immünoprecipitation (çip) yönteminin gelişimi Jackson ve chalkley 'nin raporlarına dayalı olarak "tüm hücre" formaldehit ile sabitleme kromatin yapısı^4,5. O zamandan beri, birçok ilgili teknikler geliştirilmiştir ve geliştirilmiş⁶. Çip testinde hücreler formaldehit ile çapraz bağlantı DNA ve proteinleri ile sabitlenir. Kromatin parçalanmış ve sonra ilgi antikorları ile immunoprecip,. Bağışıklık kompleksi yıkanır ve DNA 'Yı arındırılır. Genomun belirli bir bölgeye hedeflenen astar ile PCR amplifikasyon genom ilgi proteinlerin doluluk ortaya çıkarır.

Çip, transkripsiyon faktörleri ve değiştirilmiş Histonlar gibi proteinlerin DNA ile etkileşimlerini belirlemek için güçlü bir araçtır, ancak uygulamada kromatin parçalanma adımı gibi bazı zorluklar vardır. Sonication yaygın kromatin parçalama için kullanılır; Ancak, tekrarlanabilir koşulları belirlemek için hantal. Micrococcal nükleaz (mnase) tedavisi kromatin kesme için alternatif bir yöntemdir. MNase çift telli, tek telli, dairesel ve doğrusal DNA ve RNA 'yı özleyen bir Endo-exonuclease. Optimum kromatin parçalanma için Kromatin ve enzim, sıcaklık ve inkübasyon süresi miktarları da dahil olmak üzere koşulları belirlemek nispeten kolaydır. Mevcut protokolleri değiştirdi ve basitleştirdik ve basit ve tekrarlanabilir bir yöntem kurduk. Bu yazıda, memelinin hücrelerinde MNase kullanan bir ChIP tahlil Protokolü sağlanmaktadır.

Protokol

1. Reaktiflerin hazırlanması

1. 18,5% civarında formaldehite (PFA) çözümünü yapın. 0,925 g PFA, 4,8 mL su (protokol boyunca ultrapurified su kullanın) ve 35 μL 1 M KOH bir 50 mL konik plastik tüp ekleyin. Sıkıca kapağı kapatın ve bir mikrodalga kullanarak yaklaşık 200 ml su içeren bir 400-600 ml cam kabı Tüp ısı. Su kaynatmaya başlamadan önce tüpü çıkarın ve PFA 'yı çözmek için tüpü girdap yapın. PFA 'nın oda sıcaklığında soğumasını ve buzun üzerinde depolanmasına izin verin.
   Not: PFA tamamen çözülür kadar tekrar ısıtma ve karıştırma. Çapraz bağlanma işleminden hemen önce PFA çözümünü hazırlayın (adım 2.1.3).
2. 1,25 M glisin çözüm olun. 0,22 μm gözenek boyutunda filtre ile 150 mL su ve filtrede 14,07 g gcine çözülür. 4 °C ' de saklayın.
3. Çip hücre liziz tamponu yapın. Çözünür 378 mg borular, 10,6 mL 2 M KCl, ve 1,25 g dallanmış octylphenoksi Poly (ethyleneoxy) etanol içinde su. PH 'yi 4 °C ' de 1 M KOH ile 8,0 olarak ayarlayın ve 250 mL 'ye kadar yapın. 0,22 μm gözenek boyutunda filtre ve 4 °C ' de depolayın.
4. Micrococcal nükleaz (mnase) sindirim tamponu yapın. 1 ml, mix 0,1 ml 10X mnase sindirim tamponu, 10 μL 100x BSA çözeltisi, 10 μL 0,1 M ditiyotreitol ve 0,88 ml su yapmak için.
5. 1 M NaHCO₃olun. 50 mL su ve filtre ile 0,22 μm gözenek boyutunda filtre ile NaHCO₃ 4,2 g 'yi eritin. Oda sıcaklığında saklayın.
6. % 10 sodyum dodecil sülfat (SDS) yapın. 50 mL suda 5 gr SDS çözülür. Oda sıcaklığında saklayın.
7. Elüsyon arabelleği yapın. 1 M NaHCO₃, 15 μL,% 10 SDS ve 120 μL su, bir örnek Için 150 μL elüsyon tamponu elde etmek Için 15 μL karıştırın.
   Not: Örnekleri sayısına göre orantılı olarak birimleri artırın.
8. 3 M sodyum asetat (pH 5,2) solüsyonu yapın. Su içinde susuz sodyum asetat 24,6 g eriyebilir. PH 5,2 asetik asit ile ayarlayın ve 100 mL makyaj. 0,22 μm gözenek boyutunda filtre ve oda sıcaklığında saklayın.

2. MNase sindirim koşullarının belirlenmesi

Not: Protokol 2 adımda, VCaP kullanarak bir örnek, insan prostat kanseri hücreleri sunulmuştur. Herhangi bir memelinin hücre hatları kullanılabilir; adımları Not bakın.

1. Çapraz bağlı kromatin hazırlanması
   1. 37 ° c 'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile karbon dioksit kuluçside bulunan DME-yüksek glikoz VCaP hücrelerini koruyun. Tohum VCaP hücreleri 4 x 10⁶ hücreler altı 6 cm yemekleri 4 ml Kültür Medya ve kültür 3 gün.
      Not: Her hücre satırı için uygun kültür ortamını kullanın. 10 x 10⁶ hücreye kadar 6 cm veya 10 cm tabak içinde tohumluk olabilir. Askıya alınan hücreler için, T25 flasks içindeki Tohum hücreleri. Yemek veya flsorların sayısı, MNase sindirimi için kaç dozın test edildiğine bağlıdır. Eğer 4 doz test ediliyorsanız, 6 yemek veya flsora hazırlayın. Ayrıca bkz: adım 2,2.
   2. Tripsin kullanarak bir çanak VCAP hücreleri ayırın ve hücreyi saymak. Bir çanak içinde hücre numarasını hesaplayın. Askıya alınan hücreler için, küçük bir miktar hücre süspansiyonunu bir Flask ve Count hücre numarasından kaldırın.
   3. % 1 ' lik son konsantrasyonda 4 mL kültür medyasında 6 cm 'ye kadar 18,5% PFA 0,229 mL ekleyin. Yavaşça ama tamamen PFA eşit dağıtmak için bir çanak veya Flask girdap. Tam olarak 10 dakika oda sıcaklığında inküye.
      Not: Bu adımda kromatin ve proteinler crosslinked. PFA toksik olduğu için, bir kimyasal duman kaputu bu adımı yürütmek ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
   4. 10 dakika sonra, 125 mm son konsantrasyonda 1,25 M glisin çözeltisi 0,47 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe.
      Not: Glycine daha fazla çapraz bağlantı durdurmak için aşırı PFA nötralize.
   5. Aspirate formaldehit/gcine/Kültür medya. İki kez fosfat-tamponlu tuz (PBS) 4 mL ekleyerek hücreleri yıkayın. Askıya alınan hücreler için, hücre süspansiyonunu 15 mL Konik Tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika 300 x g 'de santrifüjün. Süpernatant aspirate ve PBS bir orta hacim eklemek ve tamamen askıya. Bu adımı yineleyin. Formaldehit içerdiğinden beri sıvı atıkları düzgün şekilde atın.
   6. PBS 'ye 100 x PIC 1/100 hacim ekleyerek proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli (PIC) içeren PBS hazırlayın. Bir çanak PBS aspirate ve PIC içeren PBS çanak başına 1 mL ekleyin. Hücreleri kazımak ve hücre süspansiyonunu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Askıya alınan hücreler için, süspansiyonu 1,5 mL tüpüne aktarmanız yeterlidir.
   7. Santrifüjü tüpler 3.000 x g 'de 5 dakika oda sıcaklığında hücre Pelet kurtarmak için. PBS 'i tamamen pipet kullanarak çıkarın. Tüp başına hücre numarasını kaydedin ve Cell Pelet-80 °c ' de saklayın.
2. Hücre lizis ve MNase sindirim
   Not: Aşağıdaki adımlarda reakajın hacmi 6 x 10⁶ hücre içeren bir tüp dayanır. Reaktif birimini hücre numarasına göre orantılı olarak ayarlayın; bir tüp 2 x 10⁶ hücre içeriyorsa, 100 μL Chip hücre liziz tamponu (adım 2.2.1), mnase sindirim tamponu (adım 2.2.3) ve çip seyreltme tamponu (adım 2.2.5) ve 10 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0) (Step 2.2.4) kullanın.
   1. Buz üzerinde adım 2.1.7 hazırlanmış saklanan hücre Pelet (VCAP hücreleri, tüp başına 6 x 10⁶ hücre içeren) çözüyor. ChIP hücre lizis arabelleği, 100x PIC tampon 1/100 hacmi ekleyerek PIC ile tamamlayıcı hazırlayın. Ekle 300 μL CHIP hücre liziz tampon PIC ile tamamlayıcı ve iyice Pelet pelletini. 15 s için tüp Vortex ve 10 dakika boyunca buz üzerinde süspansiyon inküye.
   2. 4 °C ' de 3 dakika için 9.000 x g 'de santrifüjün ve süpernatant tamamen çıkarın. 300 μL mnase sindirim tamponu içinde Pelet resuspend.
   3. 50 jel üniteler/μL vermek için MNase sindirim tamponu ile seyreltme MNase (2.000 jel ünitesi/μL).% 0, 0,5, 1, 2, 4 μL, 50 jel üniteleri/μL 'yi süspansiyona ekleyin ve tam olarak 10 dakika boyunca, her 37 dakikada bir inversiyon ile karıştırılarak 2,5 °C ' de inküye yapın.
      Not: Tablo 1 , birkaç hücre çizgindeki En Iyi mnase miktarını gösterir.
   4. MNase sindirimi ve Vortex 'i kısaca sonlandırmak için 30 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0) ekleyin. Buz üzerinde 5 dakika boyunca inküye. 4 °C ' de 5 dakika için 9.000 x g 'de santrifüjün ve süpernatant tamamen çıkarın.
   5. ChIP seyreltme tamponunu PIC ile takviye ederek 1/100 hacim 100x PIC 'i tampona ekleyerek hazırlayın. 300 μL yonga seyreltme tamponu resuspend PIC ile desteklenmektedir.
   6. Bir mikrotip prob ile donatılmış bir sonicator kullanarak buzun üzerinde süspansiyonu sonikat. Aşağıdaki sonication koşullarını kullanın: amplitüd 2, işlenmiş zaman 15 s, nabız 5 s, darbe kapalı 30 s. 1 μL süspansiyon ve spot bir slayt cam üzerine alın ve bir mikroskop kullanarak onları gözlemlemek. Hücre yapısının neredeyse bozulduğundan emin olun.
      Not: Şekil 1a önce ve sonra sonication VCAP hücre süspansiyon temsilcisi mikrofotoğraf gösterir. Bu adım nükleer membranlar kırarak süpernatant içine sindirilmiş Kromatin serbest içindir. Bir güç ayarı maksimum güç% 5 ' ten daha az ayarlanması ve 30 s aralığından daha fazla 5 s üç kez sonication deneyin. Watt kontrolü mevcut ise, güç ayarı 5 W olarak ayarlayın ve toplam güç vermek için yukarıda belirtildiği gibi toplamda 15 s için örnekleri işlemek 70-75 J. hücre yapısının yukarıda belirtildiği gibi kırılıp bozulmadığını kontrol edin. Yeterli değilse, bir kez daha tekrarlayın. Yukarıda açıklanan koşul, test edilen tüm hücre satırlarına pratik olarak uygulanır.
   7. 4 °c ' de 10 dakika 9.000 x g 'de Santrifüjü, süpernatant 'ı yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüjlü tüpüne aktarın ve adım 2,3 için 20 μl sindirilmiş kromatini kaydedin. Kalanı-80 °C ' de saklayın.
3. Ters Crosslinking, DNA arıtma, ve sindirilmiş kromatin Analizi
   1. 1,5 mL 'Lik vida tüpüne 75 μL su, 4 μL 5 M NaCl ve 1 μL proteinaz K ekleyin. Su, NaCl ve proteinaz K içeren tüplere adım 2.2.7 hazırlanan çeşitli MNase sindirim koşullarından 20 μL sindirilmiş kromatin ekleyin. kapağı sıkıca kapatın, tamamen karıştırın ve 65 °C ' de tüpün geceleyin.
      Not: Bu adım, protein ve DNA arasındaki çapraz kaldırılması içindir.
   2. Durum başına iki 1,5 mL mikrosantrifüjü tüpleri hazırlayın. 100 μL fenol ekleyin: kloroform: isoamylalcohol (25:24:1) (PCI) bir 1,5 mL tüp. 10 μl 3 M sodyum asetat (pH 5,2) ve 2 μL glikojen başka bir tüp ekleyin.
      Not: Kloroform kullanımı: isoamilalkol gerekli değildir⁷. Hacmi artan etanol yağış sonra düşük DNA kurtarma neden olabilir⁸.
   3. Adım 2.3.1 kısaca sindirilmiş kromatin içeren tüp Santrifüjü ve 100 μL PCI ekleyin. Kapağı sıkıca kapatın ve emülsiyon oluşturmak için şiddetle Vortex. Tüpü maksimum hızda santrifüjler (örn. 20.000 x g) Oda sıcaklığında 30 sn.
   4. Dikkatle DNA içeren üst faz almak ve adım 2.3.2 hazırlanan PCI içeren tüp ekleyin. Vortex şiddetle ve boru adım 2.3.3 olarak santrifüj.
      Not: Alt faz kontamine ise, tüpü tekrar santrifüjün veya ilk alt fazın çoğunu çıkarın, tüpü santrifüjün ve üst fazı alın.
   5. Dikkatle adım 2.3.4 açıklandığı gibi üst aşama almak ve adım 2.3.2 hazırlanan sodyum asetat ve glikojen içeren tüp ekleyin. 250 Ekle μL etanol. İnversiyon ile karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe. Tüpü maksimum hızda santrifüjün (örn. 20.000 x g), 4 °c ' de 30 dakika.
      Not: Oda sıcaklığında çözümün inkübasyon DNA kurtarma^8,9etkilemez.
   6. Tüpün altındaki pelleti onaylayın. Dikkatlice süpernatant kaldırmak böylece Pelet rahatsız etmek ve eklemek 500 μL 70% etanol. Tüpü 4 °C ' de 5 dakika boyunca maksimum hızda (örn. 20.000 x g) santrifüjün.
   7. Süpernatant tamamen çıkarın ve oda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika boyunca Pelet kuru. 20 μL 10 mM Tris içinde Pelet çözülür · HCl/1 mM EDTA (pH 8,0) (TE). UV spektrofotometresi kullanarak DNA konsantrasyonu ölçmek.
   8. Jel yükleme boyası ile 0,5 μg DNA 'yı karıştırın ve% 2 agaroz jeli için geçerlidir. Elektroforlu numuneler, 100 V 'de Tris-asetat-EDTA tamponunda, mor boya jel iki üçte taşındıktan ve 10 dakika boyunca 0,5 μg/mL etidium bromür ile bir jel lekelenene kadar. Jelin resmini çekin.
      Not: Ayrıntı için Şekil 2 ' ye bakın.

3. Chromatinimmünoprecipitation

1. Sindirilmiş kromatin hazırlanması
   1. Hazır olun. Yapışma hücreleri için, tohum 2-10 x 10⁶ hücreler her çanak başına 2 yemekler (6 cm veya 10 cm) tedavi grubu ve hücreler için yemek alt eklemek için izin 1 günden fazla. Askıya alınan hücreler için, tedavi grubu başına 2 T25 flsordan tohum. Hücreler istediğiniz gibi davranın.
   2. Her gruptan bir çanak veya Flask alın ve adım 2.1.2 ' de açıklandığı gibi hücre numarasını saymak. Adım olarak belirtildiği gibi çapraz bağlı kromatin hazırlayın 2.1.3-2.1.7.
   3. Hücre Pelet ve mnase sindirim adımda açıklandığı gibi Lyse 2.2.1-2.2.7. 2. adımda belirlendiği gibi kromatin sindirmek için en uygun MNase miktarını kullanın. -80 °C ' de sindirilmiş kromatin saklayın.
   4. 20 μL sindirilmiş kromatin ters Crosslink ve adım 2.3.8 açıklandığı gibi DNA arındırmak. 2.3.7 adımda açıklandığı gibi DNA konsantrasyonunu ölçün. Electrophorese örnekleri 2% agaroz jel içinde belirtildiği gibi sindirilmiş kromatin boyutunu kontrol etmek için 2,3.
      Not: DNA konsantrasyonu, adım 3.1.3 'de hazırlanan, saklanan sindirilmiş kromatin ile aynıdır.
   5. 1, 0,1 ve 0,01 ng/μL konsantrasyonları yapmak için su ve seri seyreltme 10 ng/μL vermek için adım 3.1.4 ters çapraz bağlantılı sindirilmiş kromatin örnek seyreltin.-20 °C ' de mağaza.
      Not: Bu örnekler gerçek zamanlı PCR standartları için kullanılır.
2. İmmünopresipitasyon
   Not: adımları 3.2-3.5 protokol, Anti-trimethylated histon H3 lizin 4 (H3K4me3) VCAP hücrelerinde doluluk belirlenir. Ayrıca bkz. Şekil 3.
   1. Çözme adım 3.1.3 den kromatin sindirilmiş. Tüm numuneleri buzda tutun.
   2. ChIP seyreltme tamponunu PIC ile takviye ederek 1/100 hacim 100x PIC 'i tampona ekleyerek hazırlayın. PIC ile takviye edilen ChIP seyreltme tamponu ile 5 μg/500 μL 'ye seyreltilmiş kromatin. Hazırlamak 1.000 μL artı ekstra (1) IP ile nonimmün IgG (kontrol IgG), (2) IP ile H3K4me3.
   3. 1,5 mL 'Lik bir vida tüpüne giriş örneği olarak (bir IP 'nin% 1 ' i) 5 μL 5 μg/500 μL sindirilmiş kromatin ekleyin. Örnek-80 °C ' de saklayın.
   4. 1,5 mL 'Lik bir vida tüpüne IP örneği olarak 5 μg/500 μL sindirilmiş kromatin her biri 500 μL ekleyin. Tüpe 2 μg antikor ekleyin. Kapağı kapatın ve sallanan bir platform kullanarak yumuşak karıştırma ile gece 4 °C ' de tüpün inküyesi.
      Not: Optimum antikor miktarı ampirik olarak belirlenmelidir, ancak ilk başta 2 μg IP başına önerilir.
   5. IP başına 30 μL ChIP-Grade protein G manyetik boncuk ekleyin. Sallanan bir platform kullanarak yumuşak karıştırma ile 2 saat boyunca tüpün 4 °C ' de inküsünü yapın.
      Not: Manyetik boncuk ön yıkama gerekli değildir.
3. Yıkama bağışıklık kompleksi ve ters çapraz
   1. Adım 3.2.5 kısaca tüp aşağı spin. 1 dakika için Neodinyum mıknatıslar içeren bir polietilen rafa tüp yerleştirin. dikkatlice aspirasyon ile süpernatant çıkarın.
   2. Düşük tuz bağışıklık karmaşık yıkama tampon tüp başına 0,5 mL ekleyin. Hafifçe dokunarak veya kısa bir süre tüp vortekslenir boncuklar dağıtır. Sallanan bir platform kullanarak yumuşak karıştırma ile 5 dakika boyunca tüpü 4 °C ' de kulkayın. 5 dakika sonra, 3.3.1 adım tekrarlayın.
   3. 0,5 mL yüksek tuz bağışıklık karmaşık yıkama tampon tüp başına ekleyin. Bir adım 3.3.2 olarak boncukların dağılın ve yıkayın. Yıkamadan sonra, 3.3.1 adımını tekrarlayın.
   4. 0,5 mL LiCl bağışıklık karmaşık yıkama tampon tüp başına ekleyin. Bir adım 3.3.2 olarak boncukların dağılın ve yıkayın. Yıkamadan sonra, 3.3.1 adımını tekrarlayın.
   5. Tüpü 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. kalan süpernatant tamamen çıkarın.
   6. 150 μL 'i tüpe ekleyin. Boncuk tamamen dağıtmak için tüp Vortex. Kapağı kapatın ve tüpün 65 °c ' de 30 dakika boyunca inversiyon ya da her 5 dakikada bir vortekslenir ile karıştırılarak boncukları iyice dağıtın.
   7. Kuluçklama sırasında, 1,5 mL 'Lik bir vida tüpü hazırlayın ve 6 μL 5 M NaCl ve 2 μL 'ye adım 3.2.3 'de hazırlanan% 1 giriş örneği ekleyin. 150 μL elüsyon tampon, 6 μL 5 M NaCl ve 2 μL proteinaz K-1% giriş örneğine ekleyin.
   8. İnkübasyon sonra, tüp aşağı döndür. Tüpü 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant 'i, adım 3.3.7 hazırlanan NaCl ve proteinaz K içeren vida tüpüne aktarın.
   9. Kapağı kapatın ve tamamen karıştırın tüm IP ve giriş örnekleri Vortex. Tüp 65 ° c 'de bir gecede inkübe.
4. DNA arıtma
   1. Tüp 2.3.2 içinde açıklandığı gibi hazırlayın ve 100 μL yerine 150 μL PCI ekleyin. Başka bir tüpte, 12 μL 3 M sodyum asetat (pH 5,2) ve 2 μL glycogen ekleyin.
   2. Boruyu kuluçdan çıkarın. Tüp Döndür ve 150 μL PCI ekleyin.
   3. Vortex güçlü tüp emülsiyon oluşturmak için. Tüpü maksimum hızda santrifüjler (örn. 20.000 x g) Oda sıcaklığında 30 sn.
   4. Üst fazın 140 μL değerini, 3.4.1 ' de hazırlanan PCI içeren tüpe dikkatlice aktarın. 3.4.3 adım yineleyin.
      Not: Ayrıca bkz: adım 2.3.4.
   5. Üst fazın 120 μL değerini, 3.4.1 ' de hazırlanan sodyum asetat ve glikojen içeren tüpe dikkatlice aktarın.
      Not: Ayrıca bkz: adım 2.3.4.
   6. 300 Ekle μL etanol. İnversiyon ile karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe.
   7. Tüpü maksimum hızda santrifüjün (örn. 20.000 x g), 4 °c ' de 30 dakika. Adım 2.3.6 ' de açıklandığı gibi Pelet yıkayın.
   8. Adım 2.3.7 açıklandığı gibi Pelet kurutduktan sonra, 50 μL te Pelet çözülür. -20 °C ' de saklayın.
5. Gerçek zamanlı PCR kullanarak DNA parçalarının tespiti
   1. Aşağıdaki örnekleri çözün: (1) kontrol IgG ile IP, (2) Anti-H3K4me3 ile IP, (3) 1% giriş örneği. Çözülme ayrıca 4 dozunda hazırlanan standartlar adım 3.1.5 (Toplam 7 numune).
      Not: Giriş ve IP örneklerinde DNA miktarlarının ölçülmesini yapmak için aynı gruptan standartlar kullanın.
   2. 8 numune için PCR çalışma çözümünü yapın. Mix 40 μL 2x gerçek zamanlı PCR supermix, 8 μL her 4 μM ileri ve ters astar, ve 8 μL su.
      Not: Bir PCR reaksiyon karışımı 5 μL 2x gerçek zamanlı PCR supermix, 1 μL her 4 μM ileri ve ters astar ve 1 μL su içerir. Primer diziler Tablo 2' de listelenir.
   3. Aliquot 8 μL PCR çalışma solüsyonu bir PCR plakasının bir kuyusu içine. Adım 3.4.8 veya standartlardaki adım 3.1.5 2 μL örnek ekleyin.
   4. PCR plakasını mühürleyin ve aşağıdaki koşulları kullanarak PCR çalıştırın: 1) 95 °C ilk denatürasyon için 3 dakika, 2) 95 °C için 10 s denaturation, 3) 56 °C için 30 s tavlama, 4) 72 °C 30 s uzatma ve veri toplama için , 2. adımları yineleyin) 55 döngüleri için 4). Bisiklet sonrası, PCR ürününün erime eğrisini ölçün. Verileri analiz edin.
      Not: Şekil 3 için ham veriler Tablo 3' te gösterilir. Standart eğri kullanarak numunelerin başlangıç miktarını (SQ) hesaplayın. Çarpın SQ 1% giriş 100 tarafından bir SQ ayarlamak için 1% giriş örnek bir IP olarak ayarlanmış SQ giriş (EQ. 1) vermek. % Giriş değeri (yüzde giriş yöntemi, EQ. 2) vermek için giriş SQ ayarlanarak IP örnek SQ Böl. Kat zenginleştirme hesaplamak için, kontrol IgG (kat zenginleştirme yöntemi, EQ. 3) ile IP tarafından Anti-H3K4me3 ile IP SQ Böl.
      Giriş SQ ayarlandı = (SQ 1% giriş) x 100 (1)
      H3K4me3 = 100 x (Anti-H3K4me3 ile IP SQ)/(giriş SQ ayarlandı) yüzdesi giriş (2)
      H3K4me3 = kat zenginleştirme (Anti-H3K4me3 ile IP SQ)/(SQ kontrol IgG ile IP) (3)

Sonuçlar

Kromatin sindirme bir çip tahlil için önemli adımlardan biridir. Biz nükl oligomerlerin bir karışımını elde etmek için Kromatin sindirmek için MNase kullandık. Mnase sindirim aşamasında, MNase nükleer membran üzerinden gidebilir ve kromatin sindirebilir. Ancak, sindirilmiş kromatin membrandan geçemez ve çekirdekte kalır. Nükleden sindirilmiş Kromatin serbest bırakmak için, kısa sonication gereklidir. Şekil 1a önce ve sonra VCAP hücre süspansiyon sonication mikro...

Tartışmalar

Sonication yaygın olarak parçalanmış kromatin elde etmek için kullanılan olsa da, zaman alıcı ve tekrarlanabilir koşulları tanımlamak için hantal. Bu protokolde, enzimin sindiriminin yeniden üretilebilen koşulları tespit etmek daha kolay olması gerektiğinden MNase sindirimi kullandık. MNase sindirim sonra kısa bir sonication adım (bkz: adım 2,2) hücre membranı kırmak ve sindirilmiş Kromatin serbest bırakmak için gerekli oldu. Bu nedenle, bizim protokolünde sonication güç mümkün olduğunca ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Thermo Scientific	AM9010
2 M KCl	Thermo Scientific	AM9010
2x iQ SYBR Green supermix	Bio-Rad	1706862
5 M NaCl	Thermo Scientific	AM9010
50 bp DNA ladder	New England Biolabs	N3236S
Agarose	Research Product International	A20090
Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol	Millipore Sigma	I8896	IGEPAL CA-630
ChIP-grade protein G magnetic beads	Cell signaling technology	9006S
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer	Millipore Sigma	20-153	Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl.
Gel Loading Dye Purple (6x)	New England Biolabs	B7024S
Glycine	Bio-Rad	161-0724	Electropheresis grade
Glycogen	Millipore Sigma	G1767	19-22 mg/mL
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)	Thermo Scientific	78445
High Salt Immune Complex Wash Buffer	Millipore Sigma	20-155	Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl.
Histone H3K4me3 antibody (pAb)	Active Motif	39915
LiCl Immune Complex Wash Buffer	Millipore Sigma	20-156	Buffer composition: 0.25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1.
Low Salt Immune Complex Wash Buffer	Millipore Sigma	20-154	Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 well)	Millipore Sigma	20-400	Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
Micrococcal nuclease	New England Biolabs	M0247S	comes with 10x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 at 25 °C) and 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3	JT Baker	3506-01
Normal rabbit IgG	Millipore Sigma	12-370
PIPES	Millipore Sigma	P6757
Proteinase K	Millipore Sigma	3115887001
Real-time PCR system	Bio-Rad	CFX96, C1000
RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody	Active Motif	39749
SDS	Boehringer Mannheim	100155	Electropheresis grade
sodium acetate	Millipore Sigma	S5636
Sonicator equipped with a microtip probe	QSONICA	Q700	Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)	Thermo Scientific	15593031	pH 8.05