JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Хроматин иммунопрецитисцией (ЧИП) является мощным инструментом для понимания молекулярных механизмов регуляции генов. Тем не менее, метод включает в себя трудности в получении воспроизводимого фрагментации хроматина с помощью механической стрижки. Здесь мы предоставляем улучшенный протокол для проведения анализа CHIP с использованием ферментативного пищеварения.

Аннотация

Чтобы выразить клеточные фенотипы в организмах, живые клетки выполняют экспрессию генов соответственно, а транскрипционные программы играют центральную роль в экспрессии генов. Клетовая транскрипционная техника и его белки модификации хроматина координируют регулирование транскрипции. Для анализа транскрипционной регуляции на молекулярном уровне доступны несколько экспериментальных методов, таких как электрофоретический сдвиг подвижности, переходный репортер и хроматин иммунопреципция (ЧиП). Мы подробно описываем в этой статье измененный анализ CHIP из-за его преимуществ в непосредственном показе модификаций гистона и взаимодействия между белками и ДНК в клетках. Одним из ключевых шагов в успешном анализе CHIP является стрижка хроматина. Хотя sonication обыкновенно использован для стрижки chromatin, трудно определить воспроизводимые условия. Вместо того, чтобы стрижка хроматина путем звуковой, мы использовали ферментативное пищеварение с микрококковой нуклеазы (MNase), чтобы получить более воспроизводимые результаты. В этой статье мы предоставляем простой протокол анализов CHIP с использованием MNase.

Введение

Выражение генов в клетках млекопитающих жестко и динамично регулируется, и транскрипция является одним из ключевых шагов. Транскрипция гена в основном регулируется транскрипционными факторами и гистонами. Фактор транскрипции является белком, который связывается с конкретными последовательностями ДНК и контролирует транскрипцию генов. Эти факторы либо способствуют или препятствуют набору РНК-полимеразы II (PolII), котораяинициирует синтез мРНК из геномной ДНК в качестве шаблона 1. Гистон модификации, такие как ацетилирование и метилирование остатков хвоста гистона положительно и негативно влияют на транскрипцию генов, изменяя структуру хроматина2. Поскольку изменения в экспрессии генов влияют на клеточный контекст, важно изучить молекулярные механизмы, с помощью которых регулируется транскрипция.

На сегодняшний день имеется несколько методов исследования регуляции транскрипции генов. Электрофоретическая мобильность сдвиг анализа (EMSA), также называемый гель сдвиг анализ, используется для анализа белка-ДНК взаимодействия3. Ядерный экстракт из интересных клеток инкубируется радиоактивным изотопом (например, 32P) с маркировкой ДНК-зондом и электрофоресом на геле полиакриламидов. Его авторадиограмма показывает, что ДНК-белковый комплекс мигрирует медленнее, чем зонд в геле. При наличии антитела к белку комплекс ДНК-белка-антитела мигрирует в гель медленнее, чем в ДНК-белковый комплекс. Эта сверхсмещенная полоса выявляет специфическую связывание между ДНК и белком. Тем не менее, EMSA определяет только специфическое взаимодействие ДНК-белка в системе, свободной от клеток, и поэтому остается неизвестным, контролирует ли взаимодействие транскрипцию в живых клетках. Переходный репортер ассси, обычно называемый luciferase репортер асссее, был разработан для решения регулировки экспрессии генов в клетках. Как правило, в репортерскую плазмиду вставляется ген ген, который временно трансгруппируется в клетки, и измеряется активность репортера. Разнообразие мутантов удаления позволяет идентифицировать регионы, которые отвечают за регуляцию генов. Несмотря на то, что анализ репортера является полезным инструментом для выявления транскрипционных факторов и связывания последовательностей ДНК, контролирующих транскрипцию, этот метод имеет большой недостаток в том, что репортер плазмида свободна от структуры хроматина и не отражает "реальные" транскрипционно-транскрипционном механизме. Кроме того, изменения в модификациях гистона не могут быть определены системой.

Развитие метода иммунопреципиции хроматина (ChIP) было основано на сообщениях Джексона и Чалкли о том, что «целая клетка» фиксации с формальдегидом сохранившейся хроматина структуры4,5. С тех пор, многие соответствующие методы были разработаны и улучшены6. В анализах CHIP клетки фиксируются формальдегидом, чтобы связать ДНК и белки. Хроматин фрагментируется, а затем иммунопроцелитируется антителами, представляющими интерес. Иммунный комплекс промывают, а ДНК очищается. Усиление ПЦР с помощью грунтовок, ориентированных на определенный регион генома, свидетельствует о заполняемости белков, представляющих интерес для генома.

Хотя CHIP является мощным инструментом для выявления взаимодействий белков, таких как транскрипционные факторы и модифицированные гистоны с ДНК, метод включает в себя некоторые трудности, такие как шаг фрагментации хроматина, на практике. Соникация широко используется для стрижки хроматина; однако определить воспроизводимые условия обременительно. Лечение микрококковой нуклеазой (MNase) является альтернативным методом стрижки хроматина. MNase является эндо-экзонуклеизом, который переваривает двуцепочечную, одноцепочечную, круговую и линейную ДНК и РНК. Относительно легко определить условия, в том числе количество хроматина и фермента, температуру и время инкубации, для оптимальной фрагментации хроматина. Мы изменили и упростили существующие протоколы, и мы создали простой и воспроизводимый метод. В этом документе содержится протокол для tIP-ассссссса с использованием MNase в клетках млекопитающих.

протокол

1. Подготовка реагентов

  1. Сделать 18,5% параформальдегида (PFA) раствор. Добавьте 0,925 г ПФА, 4,8 мл воды (использовать ультраочищенную воду на протяжении всего протокола) и 35 кЛ 1 М КНв в конической пластиковой трубке 50 мл. Закройте крышку плотно и нагрейте трубку в стакане 400-600 мл, содержащем около 200 мл воды с помощью микроволновой печи. Удалите трубку, прежде чем вода начнет кипеть и вихрь трубки для растворения PFA. Разрешить PFA остыть до комнатной температуры и хранить на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите нагревание и перемешивание до полного растворения PFA. Подготовьте решение PFA непосредственно перед перекрестным соединением (шаг 2.1.3).
  2. Сделать 1,25 М глицин решение. Растворите 14,07 г глицина в 150 мл воды и процедите через фильтр размером 0,22 мкм. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
  3. Сделайте буфер lysis клетки CHIP. Растворите 378 мг PIPES, 10,6 мл 2 М ККЛ и 1,25 г разветвленной октилфенокси поли (этилененосокси)этанола в воде. Отрегулируйте рН до 8,0 с 1 М кН при 4 градусах Цельсия и сделать до 250 мл. Фильтр через фильтр размером 0,22 мкм и храните при 4 градусах Цельсия.
  4. Сделайте буфер пищеварения микрококковой нуклеазой (MNase). Чтобы сделать 1 мл, смешайте 0,1 мл 10-x mNase буфера пищеварения, 10 л 100-x раствора BSA, 10 л 0,1 М дитиотрейтол и 0,88 мл воды.
  5. Сделать 1 M NaHCO3. Растворите 4,2 г NaHCO3 в 50 мл воды и процедите через фильтр размером 0,22 мкм. Хранить при комнатной температуре.
  6. Сделать 10% сульфат атрия додецил (SDS). Растворите 5 г SDS в 50 мл воды. Хранить при комнатной температуре.
  7. Сделайте буфер elution. Смешайте 15 зл 1 М NaHCO3, 15 л 10% SDS, и 120 л воды, чтобы получить 150 л буфера элютации для одного образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение объемов пропорционально в зависимости от количества образцов.
  8. Сделайте 3 M ацетат натрия (pH 5.2) раствор. Растворите 24,6 г ацетата натрия anhydrous в воде. Отрегулируйте рН до 5,2 с уксусной кислотой и составьте 100 мл. Фильтр через фильтр размером 0,22 мкм и хранить при комнатной температуре.

2. Определение условий пищеварения MNase

ПРИМЕЧАНИЕ: В шаге 2 протокола, примере использования VCaP, раковые клетки простаты человека представлены. Любые линии клеток млекопитающих могут быть использованы; см. Примечание на ступенях.

  1. Препарат перекрестного хроматина
    1. Поддержание клеток VCaP в глюкозе DME-высокой дополнился 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) при 37 градусах По Цельсия в инкубаторе двуокиси углерода. Семена VCaP клетки на 4 х 106 клеток в шесть 6 см блюда в 4 мл культуры средств массовой информации и культуры в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующие культурные носители для каждой линии ячейки. До 10 х 106 клеток могут быть посеяны в 6 см или 10 см блюдо. Для взвешенных клеток, семенных клеток в T25 колбы. Количество блюд или колб зависит от количества доз проверены на пищеварение MNase. Если 4 дозы проверены, подготовить 6 блюд или колбы. Смотрите также шаг 2.2.
    2. Отсоедините клетки VCaP от одной тарелки с помощью трипсина и посчитайте клетку. Рассчитайте номер ячейки в одном блюде. Для взвешенных клеток, удалить небольшое количество клеточной подвески из одной колбы и рассчитывать номер ячейки.
    3. Добавьте 0,229 мл из 18,5% PFA к 6-сантиметровому блюду в 4 мл культурных носителей при окончательной концентрации 1%. Аккуратно, но тщательно закружить блюдо или колбу, чтобы равномерно распределить PFA. Инкубировать при комнатной температуре ровно 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе хроматин и белки пересекаются. Как PFA является токсичным, выполнять этот шаг в химический капот дыма и использовать надлежащее индивидуальное защитное оборудование.
    4. После 10 мин добавьте 0,47 мл раствора гличина 1,25 М при конечной концентрации 125 мМ. Инкубировать при комнатной температуре 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глицин нейтрализует избыток PFA, чтобы остановить дальнейшее перекрестное соединение.
    5. Аспир формальдегид /глицин/культура СМИ. Вымойте клетки, добавив 4 мл фосфат-буферного солья (PBS) дважды. Для подвесных клеток перенесите суспензию клетки в коническую трубку 15 мл и центрифугу при температуре 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Призадыхать супернатант и добавить один средний объем PBS и полностью приостановить. Повторите этот шаг. Утилизировать жидкие отходы должным образом, так как они содержат формальдегид.
    6. Подготовка PBS, содержащий протеазы и фосфатазы ингибитор коктейль (PIC) путем добавления 1/100 том 100x PIC для PBS. Аспирировать PBS из блюда и добавить 1 мл на блюдо PBS, содержащий PIC. Очистите клетки и перенесите суспензию клетки в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Для подвесных ячеек просто перенесите подвеску на трубку 1,5 мл.
    7. Центрифуги трубки на 3000 х г в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы восстановить клетки гранулы. Удалите PBS полностью с помощью пипетки. Запись номера ячейки на трубку и хранить клетки гранулы на -80 градусов по Цельсию.
  2. Лизис клеток и пищеварение MNase
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем реагента в следующих шагах основан на одной трубке, содержащей 6 х 106 ячеек. Регулировка объема реагента пропорционально в зависимости от числа клеток; когда одна трубка содержит 2 х 106 ячеек, используйте 100 qL буфера лизиса ячейки CHIP (шаг 2.2.1), буфер пищеварения MNase (шаг 2.2.3), и буфер разбавления ChIP (шаг 2.2.5), и 10 qL 0.5 M EDTA (pH 8.0) (шаг 2.2.4).
    1. Оттепель хранимых клеточных гранул (клеток VCaP, содержащих 6 х 106 ячеек на трубку), подготовленных в шаге 2.1.7 на льду. Подготовьте буфер lysis ячейки CHIP, дополненный PIC, добавив 1/100 том 100x PIC в буфер. Добавьте 300 кЛ буфера лиза циза клетки CHIP, дополненного PIC, и тщательно приостановите гранулы. Вихрь трубки для 15 с и инкубировать подвеску на льду в течение 10 минут.
    2. Центрифуга при 9000 х г в течение 3 мин при 4 градусах по Цельсию и полностью удалите супернатант. Приостановите действие гранул в 300 кл.л буфера пищеварения MNase.
    3. Разбавить MNase (2000 гель единицы / QL) с MNase пищеварения буфера дать 50 единиц геля / Л. Добавить 0, 0,5, 1, 2, 4 л 50 геля единиц / L MNase к подвеске и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение ровно 10 мин, смешивая инверсии каждые 2,5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 1 показывает оптимальное количество MNase в нескольких клеточных линиях.
    4. Добавьте 30 юл 0,5 М EDTA (pH 8.0), чтобы завершить переваривание MNase и вихрь кратко. Инкубировать в течение 5 мин на льду. Центрифуга при 9000 х г в течение 5 мин при 4 градусах по Цельсию и полностью удалите супернатант.
    5. Подготовьте буфер разбавления CHIP, дополненный PIC, добавив 1/100 том 100x PIC в буфер. Повторное увеличение гранул в 300 л буфера разбавления ЧИП, дополненного PIC.
    6. Сонифицировать подвеску на льду с помощью звукового сигнала, оснащенного микротиповым зондом. Используйте следующие условия звукования: амплитуда 2, обработанное время 15 с, пульс ON 5 s, пульс OFF 30 s. Возьмите 1 кЛ подвески и пятно на слайд стекла и наблюдать за ними с помощью микроскопа. Убедитесь, что структура ячейки почти сломана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1А показаны репрезентативные микрофотографии суспензии клеток VCaP до и после звуковой передачи. Этот шаг предназначен для высвобождения переваренных хроматин в супернатант, нарушая ядерные мембраны. Настройка питания должна быть скорректирована до менее 5% от максимальной мощности и попробуйте звукование в течение 5 с три раза с более чем 30-s интервал. Если контроль мощности доступен, отрегулируйте настройку мощности до 5 Вт и обработайте образцы для общего количества 15 с, как упоминалось выше, чтобы дать общую мощность 70-75 J. Проверьте, сломана ли структура ячейки, как упоминалось выше. Если этого недостаточно, повторите еще раз. Состояние, описанное выше, практически применяется ко всем клеточным линиям, проверенным.
    7. Центрифуга при 9000 х г в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию, перенесите супернатант в новую микроцентрифуговую трубку 1,5 мл и сохраните 20 л переваренных хроматина для ступени 2.3. Храните остаток при -80 градусах Цельсия.
  3. Обратная перекрестная связь, очищение ДНК и анализ переваренного хроматина
    1. Добавьте 75 л воды, 4 л из 5 M NaCl и 1 л протеиназа К в винтовую трубку 1,5 мл. Добавьте 20 зЛ переваренных хроматина из различных условий пищеварения MNase, приготовленных в шаге 2.2.7 к трубам, содержащим воду, NaCl и протеиназа K. Закройте крышку плотно, полностью перемешайте и инкубировать трубку при 65 градусах Цельсия за одну ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предназначен для удаления перекрестных связей между белком и ДНК.
    2. Подготовьте две микроцентрифуги 1,5 мл на состояние. Добавьте 100 кл л фенола: хлороформ:изоамилалкоголь (25:24:1) (PCI) в одну трубку 1,5 мл. Добавьте в другую трубку 10 зл 3 М ацетата натрия (pH 5.2) и 2 Л л гликогена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование хлороформа:изоамилалкоголь не является необходимым7. Увеличение объема может привести к низкому восстановлению ДНК после выпадения этанола8.
    3. Centrifuge трубки, содержащие переваренный хроматин от шага 2.3.1 кратко и добавить 100 Зл Л PCI. Закройте крышку плотно, и вихрь энергично образуется эмульсия. Центрифуга трубки на максимальной скорости (например, 20000 х г)для 30 с при комнатной температуре.
    4. Аккуратно возьмите верхнюю фазу, содержащую ДНК, и добавьте в трубку, содержащую PCI, подготовленную в шаге 2.3.2. Вихрь энергично и центрифуги трубки, как шаг 2.3.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если нижняя фаза загрязнена, центрифуги трубки снова, или удалить большую часть нижней фазы во-первых, центрифуга трубки, и принять верхнюю фазу.
    5. Тщательно возьмите верхнюю фазу, описанную в шаге 2.3.4, и добавьте в трубку, содержащую ацетат натрия и гликоген, приготовленный в шаге 2.3.2. Добавьте 250 л этанола. Смешайте инверсией и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Центрифуга трубки на максимальной скорости (например, 20000 х г)в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация раствора при комнатной температурене влияет на восстановление ДНК 8,9.
    6. Подтвердите гранулы на дне трубки. Тщательно удалите супернатант, чтобы не нарушить гранулы и добавить 500 зл 70% этанола. Центрифуга трубки на максимальной скорости (например, 20000 х г)в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
    7. Удалите супернатант полностью и высушите гранулы в течение примерно 5 минут при комнатной температуре. Растворите гранулы в 20 л из 10 мм Трис HCl/1 mM EDTA (pH 8.0) (TE). Измеряйте концентрацию ДНК с помощью УФ-спектрофотометра.
    8. Смешайте 0,5 мкг ДНК с гель загрузки красителя и нанесите на 2% агарозный гель. Электрофориз пробы при 100 В в буфере трис-ацетат-ЭДТА до фиолетового красителя мигрировали в две трети геля и пятно гель с 0,5 мкг/мл бромистого этидия в течение 10 минут. Сфотографируй гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробнее о рисунке 2.

3. ХроматинИммунопреция

  1. Препарат переваренных хроматина
    1. Приготовь клетки. Для клеток адептов, семена 2-10 х 106 клеток на блюдо в 2 блюда (6 см или 10 см) на лечение группы и позволяют клеткам прикрепляться к нижней части блюд в течение более 1 дня. Для взвешенных клеток, семена в 2 T25 колбы на лечение группы. Относитесь к клеткам по желанию.
    2. Возьмите одно блюдо или колбу от каждой группы и подсчитайте номер ячейки, как описано в шаге 2.1.2. Подготовьте перекрестный хроматин, как уже упоминалось в шагах 2.1.3-2.1.7.
    3. Лизе клеточной гранулы и MNase пищеварения, как описано в шагах 2.2.1-2.2.7. Используйте оптимальное количество MNase для переваривания хроматина, как это определено в шаге 2. Хранить переваренный хроматин при -80 градусах По Цельсию.
    4. Обратная перекрестная связь 20 зл и л переваренных хроматина и очищение ДНК, как описано в шаге 2.3.8. Измерьте концентрацию ДНК, описанную в шаге 2.3.7. Электрофорезы образцы в 2% агарозный гель, чтобы проверить размер переваренных хроматин, как упоминалось в шаге 2.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация ДНК идентична концентрации хроматина, накопленного в шаге 3.1.3.
    5. Разбавить обратный перекрестный переваренный образец хроматина со ступени 3.1.4, чтобы дать 10 нг/Л с водой и последовательно разбавить, чтобы сделать концентрации 1, 0,1, и 0,01 нг/Л. Хранить при -20 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти образцы используются для стандартов ПЦР в реальном времени.
  2. Иммунопрециция
    ПРИМЕЧАНИЕ: В шагах 3.2-3.5 протокола определяется заполняемость 3.2-3.5 протокола, антитриметилированный гистон H3 лизин 4 (H3K4me3) заполняемость в клетках VCaP. Смотрите также Рисунок 3.
    1. Оттепель переваривается хроматин от шага 3.1.3. Храните все образцы на льду.
    2. Подготовьте буфер разбавления CHIP, дополненный PIC, добавив 1/100 том 100x PIC в буфер. Разбавить переваренный хроматин до 5 мкг/500 л с буфером разбавления CHIP, дополненным PIC. Подготовьте 1000 qL плюс дополнительные для (1) IP с неиммунным IgG (Контроль IgG), (2) IP с H3K4me3.
    3. В качестве входной пробы (1% от одного ИС) добавьте 5 кЛ 5 мкг/500 мл переваренных хроматина. Храните образец при -80 градусах По Цельсию.
    4. Добавьте 500 мл каждый из 5 мкг/500 юл переваренный хроматин в 1,5 мл винтовой трубки в качестве образца IP. Добавьте 2 мкг антител в трубку. Закройте крышку и инкубировать трубку при 4 градусах Цельсия на ночь с нежным смешивания с помощью качалки платформы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя оптимальное количество антител должно быть определено эмпирически, 2 мкг на ИС рекомендуется в первую очередь.
    5. Добавьте 30 зл и содержание белка ChIP-класса G магнитных бусин ок на IP. Инкубировать трубку при 4 градусах по Цельсию на 2 ч с нежным смешиванием с помощью качалки платформы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предмыкать магнитные бусины не стоит.
  3. Мытье иммунного комплекса и обращение вспять перекрестных ссылок
    1. Спин вниз трубки от шага 3.2.5 кратко. Поместите трубку в полиэтиленовую стойку, содержащую неодиниумные магниты на 1 мин. Тщательно удалите супернатант аспирией.
    2. Добавьте 0,5 мл на трубку низкосолевого иммунного комплекса стирального буфера. Разогнать бусинки, осторожно нажав или кратко вихря трубки. Инкубировать трубку при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут с нежным смешиванием с помощью качалки платформы. После 5 мин повторите шаг 3.3.1.
    3. Добавьте 0,5 мл буфера с высоким содержанием соли иммунного комплекса для мытья по трубе. Разогнать и вымыть бисер в виде шага 3.3.2. После стирки повторите шаг 3.3.1.
    4. Добавьте 0,5 мл буфера иммунного комплекса LiCl на трубку. Разогнать и вымыть бисер в виде шага 3.3.2. После стирки повторите шаг 3.3.1.
    5. Поместите трубку в магнитную стойку на 1 мин. Удалите оставшийся супернатант полностью.
    6. Добавьте в трубку 150 л буфера элюции. Вихрь трубки для разгона бисера полностью. Закройте крышку и инкубировать трубку при 65 градусах По Цельсию в течение 30 минут, смешивая путем инверсии или вихря каждые 5 минут, чтобы разогнать бисер тщательно.
    7. Во время инкубации подготовьте винтовую трубку 1,5 мл и добавьте 6 л 5 М NaCl и 2 л протеиназа K. Оттепель 1% входной образец подготовлен в шаге 3.2.3. Добавьте 150 юл элевционного буфера, 6 л 5 M NaCl и 2 л протеиназа K до 1% входной образца.
    8. После инкубации, спина вниз трубки. Поместите трубку в магнитную стойку в течение 1 мин и перенесите супернатант в винтовую трубку, содержащую NaCl и протеиназа K, подготовленные в шаге 3.3.7.
    9. Закройте крышку и вихрь все IP и входные образцы, чтобы полностью смешать. Инкубировать трубку при 65 градусах Цельсия на ночь.
  4. Очистка ДНК
    1. Подготовьте трубку, как описано в 2.3.2, и добавьте 150 кЛ PCI вместо 100 КЛ. В другой трубке добавьте 12 л из 3 М ацетата натрия (pH 5.2) и 2 Злгликогена.
    2. Удалите трубку из инкубатора. Спин вниз трубки и добавить 150 л PCI.
    3. Вихрь энергично трубки для формирования эмульсии. Центрифуги трубки на максимальной скорости (например, 20000 х г) для 30 с при комнатной температуре.
    4. Тщательно перенесите 140 л верхней фазы в трубку, содержащую PCI, подготовленную в шаге 3.4.1. Повторите шаг 3.4.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите также Примечание в шаге 2.3.4.
    5. Тщательно перенесите 120 л верхней фазы в трубку, содержащую ацетат натрия и гликоген, приготовленный в шаге 3.4.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите также Примечание в шаге 2.3.4.
    6. Добавьте 300 л этанола. Смешайте инверсией и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
    7. Центрифуга трубки на максимальной скорости (например, 20000 х г)в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. Вымойте гранулы, как описано в шаге 2.3.6.
    8. После сушки гранулы, как описано в шаге 2.3.7, растворите гранулы в 50 Зл Te. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  5. Обнаружение фрагментов ДНК с использованием ПЦР в реальном времени
    1. Оттепель следующие образцы: (1) IP с управлением IgG, (2) IP с анти-H3K4me3, (3) 1% входной образец. Оттепель также 4 дозы стандартов подготовлены в шаге 3.1.5 (всего 7 образцов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стандарты одной и той же группы для количественной оценки количества ДНК в образцах ввода и ИС.
    2. Сделать ПЦР рабочее решение для 8 образцов. Смешайте 40 зл 2x в режиме реального времени ПЦР супермикс, 8 qL каждый из 4 ММ вперед и обратные грунтовки, и 8 л воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одна смесь реакции ПЦР содержит 5 qL 2x в режиме реального времени ПЦР супермикс, 1 Зл каждый из 4 ММ вперед и обратный грунтовки, и 1 л воды. Последовательность праймерперечислений указана в таблице 2.
    3. Aliquot 8 Л рабочего раствора ПЦР в одну скважину пластины ПЦР. Добавьте 2 qL образцов со ступени 3.4.8 или стандарты от шага 3.1.5.
    4. Печать пЦР пластины и запустить ПЦР, используя следующие условия: 1) 95 КК в течение 3 мин для первоначального денатурации, 2) 95 КК для 10 с для денатурации, 3) 56 КК для 30 с для annealing, 4) 72 КК для 30 с для расширения и сбора данных , повторные шаги 2) до 4) для 55 циклов. После езды на велосипеде измерьте кривую плавления продукта ПЦР. Проанализируйте данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные данные для рисунка 3 отображаются в таблице 3. Рассчитайте стартовое количество образцов с помощью стандартной кривой. Умножьте S в 1% входна на 100, чтобы настроить образец ввода 1% на один IP, чтобы дать скорректированный СЗ в вводах (Eq. 1). Разделите СЗ в выборке IP путем корректировки СЗ в ввода, чтобы дать% вхоженной стоимости (процентный метод ввода, Eq. 2). Чтобы рассчитать обогащение складок, разделите СЗ в ИС с анти-H3K4me3 по S'в IP с контролем IgG (метод разогнания, Eq. 3).
      Скорректированная СЗ при вводах - (СЗ в 1% входных данных) x 100 (1)
      Процент ввода H3K4me3 и 100 х (СЗ в IP с анти-H3K4me3) / (Скорректированный СЗ при вводах) (2)
      Сложить обогащение H3K4me3 ( (СЗ в IP с анти-H3K4me3) / (СЗ в IP с контролем IgG) (3)

Результаты

Переваривание хроматина является одним из важных шагов для анализчив ЦИП. Мы использовали MNase для переваривания хроматина, чтобы получить смесь нуклеосомного олигомеров. В шаге пищеварения MNase, MNase может пройти через ядерную мембрану и переварить хроматин. Однако переваренный хроматин...

Обсуждение

Хотя sonication обыкновенно использован для того чтобы получить фрагментированный хроматин, оно требующий много времени и громоздкое для того чтобы определить воспроизводимые условия. В этом протоколе мы использовали пищеварение MNase, потому что пищеварение ферментов должно быть легче опр...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование поддерживается Genentech роялти в город надежды. Эта работа не поддерживается в целом или частично Национальными институтами здравоохранения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA (pH 8.0)Thermo ScientificAM9010
2 M KClThermo ScientificAM9010
2x iQ SYBR Green supermixBio-Rad1706862
5 M NaClThermo ScientificAM9010
50 bp DNA ladderNew England BiolabsN3236S
AgaroseResearch Product InternationalA20090
Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolMillipore SigmaI8896IGEPAL CA-630
ChIP-grade protein G magnetic beadsCell signaling technology9006S
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution BufferMillipore Sigma20-153Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl.
Gel Loading Dye Purple (6x)New England BiolabsB7024S
GlycineBio-Rad161-0724Electropheresis grade
GlycogenMillipore SigmaG176719-22 mg/mL
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)Thermo Scientific78445
High Salt Immune Complex Wash BufferMillipore Sigma20-155Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl.
Histone H3K4me3 antibody (pAb)Active Motif39915
LiCl Immune Complex Wash BufferMillipore Sigma20-156Buffer composition: 0.25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1.
Low Salt Immune Complex Wash BufferMillipore Sigma20-154Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 well)Millipore Sigma20-400Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
Micrococcal nucleaseNew England BiolabsM0247Scomes with 10x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 at 25 °C) and 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3JT Baker3506-01
Normal rabbit IgGMillipore Sigma12-370
PIPESMillipore SigmaP6757
Proteinase KMillipore Sigma3115887001
Real-time PCR systemBio-RadCFX96, C1000
RNA pol II CTD phospho Ser5 antibodyActive Motif39749
SDSBoehringer Mannheim100155Electropheresis grade
sodium acetateMillipore SigmaS5636
Sonicator equipped with a microtip probeQSONICAQ700Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)Thermo Scientific15593031pH 8.05

Ссылки

  1. Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
  2. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
  5. Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
  6. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  7. Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).
  8. Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
  9. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  10. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  11. Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
  12. Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
  13. Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
  14. Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
  15. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
  16. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
  17. Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
  18. Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
  19. Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

147IIH3 4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены