-Omics Analizleri ve Birincil Hücre Kültürü için Yarasaların Doku Toplama

Özet

Bu, vahşi doğada yakalanan yarasaların genomik, transkripsiyonik ve proteomik analizleri için en uygun doku hazırlığı için bir protokoldür. Bu yarasa yakalama ve diseksiyon, doku koruma ve yarasa dokusunun hücre culturing için protokoller içerir.

Özet

Yüksek iş hacmi ne kadar çok yönlü sektirme teknolojileri ilerledikçe, yüksek kaliteli doku edinimi ve korunması için standartlaştırılmış yöntemler, bu yöntemlerin model olmayan organizmalara uzatılmasına olanak sağlar. Yarasalardan doku toplanmasını optimize etmek için bir dizi protokol, bir dizi yüksek iş elde li sıralama yaklaşımı için geliştirilmiştir. Burada özetlenen yarasaların yakalanması için protokoller, her yarasa için toplanacak istenen demografik ve doku toplama sırasında bir yarasa üzerinde stresi en aza indirmek için optimize yöntemleri vardır. Yüksek molekül ağırlıklı genomik analizler için (i) DNA, (ii) dokuya özgü transkripsiyonlar için RNA ve proteomik düzey analizleri için (iii) proteinler elde etmek için doku toplama ve tedavi yöntemleri özellikle özetlenmiştir. Son olarak, aynı zamanda kanat klipleri canlı birincil hücre kültürleri oluşturarak ölümcül örnekleme önlemek için bir yöntemdir. Bu yöntemlerin temel motivasyonu, her yarasa için potansiyel moleküler ve morfolojik veri miktarını en üst düzeye çıkarmak ve gelecekte yeni yöntemler geliştikçe değerlerini koruyabilmeleri için dokuları korumak için en uygun yolları önermektir. Bu standardizasyon, dünya çapında türlerin kromozom düzeyinde, hatasız genomlarını sıralama girişimleri ortaya çıktıkça özellikle önemli hale gelmiştir ve birçok bilimsel taraf farklı taksonomik dizilimi ne lerdir? Grup. Burada özetlenen protokoller Bat1K için ideal doku toplama ve doku koruma yöntemlerini tanımlar, yarasa her türün genomlarını sıralamak olan konsorsiyum.

Giriş

Yüksek verimli sıralama (HTS) yöntemleri hızla verimlilik gelişmiş ve maliyet azalmıştır, ve şimdi yüzlerce veya binlerce örnek bu yaklaşımları ölçeklendirmek mümkündür. Bu teknolojilerin uygulanması ile elde edilen anlayışlar, biyotıp evrim veekoloji^1,2,3,birden fazla bilimsel disiplinler arasında büyük etkileri vardır. Ancak, birçok HTS uygulamaları kritik bir canlı kaynaktan yüksek kaliteli nükleik asitler güveniyor. Bu sınırlama, uzun okunan^moleküller4dayalı üçüncü nesil sıralama gelişimi ile giderek daha sorunlu hale gelmesi muhtemeldir. Bu nedenlerden dolayı, laboratuvar dışında yabani organizmalardan taze doku örnekleri nin toplanması için en iyi uygulamaların oluşturulmasına odaklanmak gerekir, bu da malzemenin yararını en üst düzeye çıkarır ve ihtiyaç duyulması gereken bireylerin sayısını azaltır. Toplanan.

Bat1K kromozom düzeyinde montaj⁵yarasa her türün genom dizilimi için devam eden bir girişim ile bilim adamları uluslararası bir konsorsiyum . Yarasalar memeli çeşitliliğinin% 20 temsil ve yaşlanma, hastalık ekolojisi, duyusal biyoloji ve metabolizma⁵,⁶anlamak için etkileri var olağanüstü adaptasyonları var. Birçok yarasa da tehdit veya insan sömürüsü nedeniyle tehlike altında⁷ veya hızla patojenler nedeniyle azalan^8,9, ve genom düzeyinde sıralama bu türlerin korunması için büyük önem taşımaktadır. Bat1K şu anda tüm yarasa türlerinin genomlarını dizilemeyi amaçlasa da, yüksek kaliteli genomik sıralama için doku örneklerinin toplanmasının standartlaştırılması organizma biyologları topluluğu nda önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Genomik verilere ek olarak, yarasa adaptasyonlarının çeşitliliğinin işlevsel olarak anlaşılması dokuya özgü transkripsiyon ve protein analizleri gerektirir ve genellikle ayrı toplama protokolleri gerektirir. Ayrıca, tüm taksonomik gruplarda olduğu gibi, -omik analizler için en yüksek kalitede veri elde etmek için optimum doku toplama ve koruma şartiken, hızla değişen teknolojiler ve bağımsız olarak çalışan birden fazla araştırma ekibi.

Yarasa-omics araştırma için en iyi uygulamaları benimsemeihtiyacı, birçok yarasa türünün nadir veya tehdit altında olduğu göz önüne alındığında, özellikle acildir. Kemirgenler ve sivri fareler gibi diğer küçük memelilerin aksine, yarasalar uzun ömürlüdür, olağanüstü DNA onarım mekanizmaları¹⁰ ve yavaş üreme¹¹atfedilebilir , çoğu tür sadece bir veya (birkaç durumda) yılda iki genç doğurma ile. Bu nedenlerden dolayı, yarasa popülasyonları rahatsızlıktan kurtarmak için yavaş olabilir, ve vahşi birçok kişi toplama ne tavsiye edilebilir ne de uygulanabilir. Başka bir deyişle, protokoller tek bir örnek için maksimum veri miktarını elde etmek için optimize edilmeli ve böylece örnekleme çabalarını gereksiz yere çoğaltma gereksinimini azaltmalıdır.

Burada, bu protokol özellikle genomik ve transkripsiyon dizilimi ve protein analizleri için yarasa dokusunun toplanması ve örnekleştirilmesi için standartlaştırılmış yöntemlere odaklanmaktadır. En önemli önceliği, yarasa dokularının toplanması, dokuların ihracatı, stresin hayvana en aza itilmesi ve uzun süreli depolama koşullarına kadar etik ve sorumlu bir şekilde toplanmasını sağlamaktır. Toplanan farklı malzemelerin kullanışlılığını gelecekte de ön plana etmek amacıyla ayrıntılı diseksiyonlar geliştirilmiştir. Bu el yazması, yarasaları popülasyonlar üzerindeki etkiyi en aza indirmek ve bilimsel değeri en üst düzeye çıkarmak amacıyla insancıl bir şekilde toplamak için adım adım bir kılavuz sağlar. Bu protokolün odak yarasalar kullanılmak üzere özel iken, adımların çoğu diğer omurgalı takson, özellikle memeliler ile ilgilidir.

Doku koleksiyonuna genel bakış
Depolama sıcaklığı ve koruyucu madde seçimi de dahil olmak üzere doku toplama prosedürü, planlanan herhangi bir downstream analizlerin niteliğine göre belirlenecektir. Ancak, mümkün olduğunda, belirli bir analiz planlanmamış olsa bile, doku gelecekteki yarar maksimize etmek için yöntemler bir dizi altında toplanır şiddetle tavsiye edilir. Genel olarak, doku toplanır ve nükleik asitler (DNA ve RNA) veya protein sonraki analizleri için korunur. Bu uygulamaların her biri için, doku en iyi sıvı azot (LN2) doğrudan flaş donma ile korunabilir. Ancak, LN2 hemen daldırma her zaman alanında mümkün değildir. Teknoloji ilerledikçe, DNA ve RNA'yı ortam sıcaklıklarında depolamak için özel şişeler gibi kaynaklar daha kolay kullanılabilir hale gelmektedir. Bu protokoldeki tüm bu materyalleri doğrulamamış olsak da, diğer araştırmacıları burada sunduklarına göre yeni malzemelerin performansını karşılaştırmalı olarak analiz etmeye teşvik ediyoruz. LN2'ye erişilemediği durumlarda, örneğin Amazon'daki küçük uçak üzerinden siteye erişim nedeniyle LN2 taşımacılığının mümkün olmadığı durumlarda, farklı uygulamalar için ideal olarak dokuları korumak için yöntemler salıyoruz. Buna ek olarak, canlı hücrelerin yetiştirilip yayıldığı dokuları toplamak için bir yöntem salıyoruz. Aşağıda, bu ilgili amaçlariçin malzeme toplamak için önemli hususlar ı özetliyoruz ve toplama yöntemlerine genel bir bakış Tablo 1'deverilmiştir.

DNA için doku
Toplanan tüm toplanan dokular için, depolama ortamı standart veya yüksek molekül ağırlıklı (HMW) DNA çıkarma için kullanılabilir olup olmadığını belirleyecektir. HMW uzun okuma sıralama için gereklidir ve şu anda kromozom düzeyinde genom derlemeleri oluşturmak için gerekli, ya da bir "platin standart" genom. Düşük molekül ağırlığı (LMW) DNA flaş dondurulmuş elde edilebilir, AllProtect (bundan böyle "doku dengeleme çözümü" olarak anılacaktır), hatta RNAlater (bundan böyle "RNA stabilizasyon çözümü")-korunmuş numuneler (flaş dondurulmuş numuneler optimal kalsa da ). Standart laboratuvar yöntemleriyle izole edilen DNA (örn. silika jel membran spin kolonları, fenol-kloroform), yine de ~20 kilobaza (kb) kadar DNA parçaları verebilir. Bu nedenle, yeterli verim olması koşuluyla, bu izole DNA formu tek bir kesici uç boyutu kitaplığı hazırlığı için kullanılabilir, hangi insert boyutu genellikle ~ 500 baz çiftleri (bp) ve ~ 100 bp kısa sıra okuma¹²oluşturulur . Bu DNA özellikle tam uzunlukta kromozomel verilerin gerekli olmadığı "sıralama" projeleri veya çalışmaları için yararlıdır. HMW DNA (10-150 kb) daha zorludur ve sadece hasat tan sonra LN2'de hızla yanıp sönen ve ekstraksiyona kadar en fazla -80 °C'de tutulan doku kullanılarak güvenilir bir şekilde elde edilebilir.

Düşük molekül ağırlığı veya parçalanmış DNA genellikle PCR ve kısa okunur sıralama¹³ile gen amplifikasyonu da dahil olmak üzere hedefli yaklaşımlar için yeterlidir. SADECE bir veya birkaç genhedef LMW DNA kullanarak PCR tabanlı araştırmalar adaptasyon ve yarasa duyusal biyoloji^6molekülerevrimi anlamak son derece bilgilendirici olmuştur ,¹⁴, fizyoloji¹⁵, filogenetik ^5,16, ve koruma^17,18. Düşük molekül ağırlığı ve parçalanmış DNA'nın başarılı hedefli sekans ları yeniden ele geçirilirken, yarasalar¹⁹dahil olmak üzere çok sayıda omurgalı grubu da gösterilmiştir. Bu yöntemler genellikle düşük molekül ağırlığı analizleri için DNA elde etmek için yaygın yollar olduğu gibi, dışkı örnekleri ve bukkal swabs veya kanat biyopsisi yumruklar yoluyla öldürücü olmayan doku örnekleme, yarasa için maliyet-etkin ve minimal invaziv^{20, 21. yıl.}

Ancak, kalite büyük ölçüde örneğin²²depolandığı ortam türüne bağlıdır. Bukkal swabs ve biyopsi yumruklarının sistematik ve kantitatif karşılaştırmalar sonra, kanat biyopsi salgı yumruklar DNA sürekli daha yüksek seviyelerde verim gösterilmiştir ve toplama sırasında yarasa için daha az stresli²². Bu karşılaştırmalar aynı zamanda kanat yumruğu nun gösterge silikasında korunduğunda en iyi sonuçların elde edildiğini de gösterdi (örneğin, nem gözlendiğinde renk değiştiren silika jel boncuklardan yapılmış bir desiccant türü) etanol veya DMSO²²; ancak doku stabilizasyon solüsyonu dahil diğer depolama ortamları incelenmemekle birlikte. Kanat yumrukları da kültür fibroblast hücreleri büyümek için kullanılabilir, Kacprzyk ve ark²³ gibi ve aşağıda açıklandığı gibi (bölüm 6 bakınız). Bu yöntemler için, kanat veya üropatagium hafifçe uzatılmalı ve temiz bir biyopsi yumruğu, genellikle çapı 3 mm, örnek elde etmek için kullanılmalıdır. Bu yaklaşım kalıcı bir hasara neden gibi görünüyor, çoğu durumda hafta içinde iyileşiyor yaralar^{ile 24}.

HMW DNA (10-150 kb) daha zorludur ve şu anda sadece hasat tan sonra LN2'de hızla yanıp sönen ve ekstraksiyona kadar en fazla -80 °C'de tutulan doku kullanılarak güvenilir bir şekilde elde edilir. HMW DNA (10-150 kb) uzun okunan DNA dizilimi ve dolayısıyla de novo genom montajı için çok önemlidir. Gerçekten de, çoğu ticari kitleri bazı standart HMW DNA izole etmek için kullanılabilir iken, ortaya çıkan molekül boyutları genellikle üçüncü nesil sıralama teknolojilerinin gereksinimlerini karşılamak değil [örneğin, Bu Pasifik Biosciences (PacBio) gibi şirketler tarafından başlatılan, Oxford Nanopore Teknolojileri, ve 10x Genomik, ya da Biyonano Genomik veya Dovetail Genomics tarafından sunulan montaj yöntemleri ile]. Bu nedenle, "ultra HMW" DNA (>150 kb) için yeni bir talep vardır. Yarasalardan ultra HMW DNA elde ederken, karaciğer, beyin veya kas taze örnekleri tüm uygundur, ancak bu hemen herhangi bir depolama tampon veya kriyoprotektif olmadan LN2 dondurulmuş flaş olmalıdır. Bu adımların tam bir açıklaması bu makalenin kapsamı dışındadır, ancak başka bir yerde²⁵mevcuttur.

RNA için doku
RNA, DNA'dan daha az kararlı olan tek iplikçikli bir moleküldür. RNA'nın birçok şekli olmasına rağmen, -omik analizler mRNA (haberci RNA) ve küçük RNA'lara (örneğin mikroRNA'lar) odaklanma eğilimindedir. Transkripsiyondan sonra, mRNA intron içermeyen ve genlerin/genomların kodlama kısmını temsil eden olgun bir transkript oluşturmak üzere birleştirilmiştir. Kodlama genleri genom boyutunun küçük bir kısmını (%1-2) oluşturuyor ve bu da mRNA'nın hedefalınmasını genler için dizi verilerini elde etmek için uygun maliyetli bir araç haline getiriyor. MikroRNA'lar, mRNA'nın proteinlere çevrilme sürecini düzenleyen bir RNA sınıfıdır ve bu nedenle önemli düzenleyici efektörlerdir. RNA transkriptleri tek tek sıralanabilir, ya da daha yaygın olarak -omics analizleri için^{26,27,28,29,30}, bir transkriptom un bir parçası olarak; diğer bir deyişle, belirli bir örnekte bulunan tüm RNA transkriptlerinin toplamıdır.

Sıralama çeşitli yöntemler (yani, kısa okunan RNA-seq veya uzun okunan tüm izoform Seq yoluyla) aşağıdaki yapılabilir, hem RNA bolluğu ve izoform kullanımı analizi sağlayan. mRNA transkriptlerinin miktarı ve çeşitliliği hücreler ve dokular arasında değiştiğinden, RNA dizilemesi gen ekspresyonunu ve regülasyonunun örnekler arasında incelenmesini ve karşılaştırılmasını mümkün kılabilir. Bu yöntemler giderek biyolojik olarak bilgilendirici hale geldikçe, küçük RNA'ların ve bütün isoform sıralamanın sıralanmasına olan ilgi artmaktadır. RNA farklı sınıflarda sıralamak için doku örneklerihazırlanması bu el yazması sunulan aynı şekilde yapılabilir, sadece sonraki çıkarma yöntemleri^31,32farklı . Son olarak, transkripsiyonlar protein kodlayan genomun yüksek kapsama alanı alt kümesini sunduğundan, biraraya getirilen veri seti genom montajı ve ek açıklamalarında yararlı olabilir, bu da farklı dokular arasında RNA-seq verilerinin toplanmasını Bat1K girişimi.

DNA'nın aksine, RNA kimyasal olarak kararsızdır ve rna bazlı virüslere karşı savunma stratejisi olarak doku lysates'inde her yerde bulunan RNase enzimleri tarafından da hedef alınır. Bu nedenlerden dolayı, hücre ve dokularda RNA fraksiyonu örnekleme ve/veya ötenazi noktasından kısa bir süre sonra bozulmaya başlar. Bu nedenle RNA'nın korunması, bozulmasını önlemek için adımlar gerektirir. Bu genellikle 4 °C'de taze toplanan dokunun, dokularda doğal olarak bulunan RNa'ları inaktive etmek için RNA stabilizasyon çözeltisi gibi bir stabilizatör ajanda korunmasını ve ardından uzun süreli depolama için dondurulmayı içerir. Tercih edilen bir alternatif olarak, doku LN2 dondurulmuş flaş olabilir; yukarıda belirtildiği gibi, ln2'nin sahaya taşınması ve doku ların erimesini önlemek için seviyelerinin korunması lojistik açıdan zor layıcı olabilir.

Protein için doku
Protein bileşimi ve göreceli bolluk rna için tartışılan benzer bir şekilde hücre ve dokular arasında değişir; ancak proteinler rna'dan ortalama olarak daha kararlıdır. Proteomik kullanılarak protein tanımlaması tipik olarak protein dizisinin bir kısmıyla eşleşir, tam olarak değil, ancak dokular arasında ifade hakkında bilgi sağlayabilir ve mevcut patojenleri karakterize edebilir. Birçok protein dizisi memeliler arasında korunduğundan, proteomik yarasa örnekleri toplama sırasında steril protokoller (örneğin eldivenler, forsepsler) gerektiren korunmuş insan proteinleriyle kolayca kontamine edilebilir. LN2'de parlama dondurma, proteinlerin bozulmasını önlemenin en iyi yolu olsa da, kuru buz, -20 °C'lik dondurucular ve hatta buz başka bir yol yoksa uygundur. Sıcaklıklar arttıkça diferansiyel protein arızası riski de artar. Doku stabilizasyon çözümü gibi stabilizasyon ajanları oda sıcaklığında dokuların protein fraksiyonunun korunmasında etkilidir ve flaş donma uygun olmadığında kısa süreli koruma için uygundur (bir haftaya kadar).

Belirli bir dokunun enzimatik profili doğrudan orada proteinin korunmasını etkiler. Kas gibi düşük enzimatik aktiviteye sahip dokular, ev dondurucuda yüksek sıcaklıklarda bile protein profillerini koruyabilir. Buna karşılık, karaciğer dokusu enzimatik reaktif, ve proteinleri hazırlık sırasında aşağılayıcı yüksek olasılıklar var. Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) örneklerinden insan proteomik profilleri elde etmek için protokollerin giderek artan sayıda dokuların paraformaldehit sabitleme toplama üzerine donma düşük maliyetli protein korunması için söz tutar düşündürmektedir uygulanabilir^33,34. Koruma süresine ve durumuna son derece bağlı olmasına rağmen, proteinler formalin-sabit, etanol le korunmuş yarasa örneklerinden immünohistokimya ile tespit edilmiştir³⁵. Bu yaklaşım proteomik düzeyde örnekleme için ölçeklenebilir değildir, ancak flash-donma kullanılamadığında ve diğer stabilizasyon ajanları çok pahalı olduğunda formalin sabit yarasa dokularının protein profilleri verme potansiyelini vurgular.

Hücre kültürü için doku
Örnekleme dokusu ve parlama dondurma kullanılacak sonlu miktarda malzeme sunar ve malzeme kullanıldıktan sonra artık kullanılamaz. Alternatif olarak, hücre kültürleri hemen kullanılabilir veya gelecekteki çalışmalar için korunmuş canlı hücreler sağlar. Kültürler de doku örnekleri küçük olduğunda verimi artırmak için hücrelerin genişlemesini kolaylaştırmak. Özellikle doku toplamanın sınırlı olduğu durumlarda yararlıdır, örneğin öldürücü olmayan örneklemenin gerekli olduğu ve bu nedenle koruma için geniş etkileri olan nadir türlerle yapılan deneyler gibi. Açıklanan hangi hücre kültürü kanat membran dokusunun öldürücü olmayan örnekleme yoluyla mümkün olduğu bir protokol, ancak birden fazla doku tipleri ile culturing mümkündür^36,37. Burada sağlanan protokol yapışık hücreler için seçer. Kullanılan kaynak doku ve büyüme ortamının birleşimi bu protokolü fibroblastları seçmek ve büyütmek için uygun hale getirir, ancak istenirse diğer hücre tipleri için alternatif protokoller kullanılabilir. Bat1K projesi kapsamında, nadir ve tehdit altındaki türler için kanat zarlarının öldürücü olmayan örneklemesi ve numunelerin kültürlenme yoluyla genişlemesinin, kullanılan çoklu teknolojiler için gerekli DNA hacmini oluşturmak için gerekli olduğu tahmin edilmektedir⁵ .

Yarasa yakalama
Yarasaları kullanan tüm insanlar yarasa yetkin bir araştırmacı tarafından eğitilmeli ve bir dizi ön maruziyet enjeksiyonu ile kuduz aşısı yapılmalıdır. Isırılırsa, bir dizi daha maruz kalma sonrası enjeksiyonları hala gereklidir. Yarasaları yakalamak için standart yöntemler sis ağları(Şekil 1) ve arp tuzakları(Şekil 2)içerir. Sis ağları en yaygın olarak kullanılan ve düşük ve orta aktivite ile alanlar için ideal, onlar yarasa sıkıntıen en aza indirmek için en çok bakım gerektiren gibi. Küçük yarasalar özellikle savunmasızdır ve hızlı bir şekilde eğiliminde değilse stresten ölebilir. Sık yapılan net denetimler yarasa yaralanmasını ve mortalitenin yanı sıra sis ağına zarar verebilir. Uygun doku toplama doku taze olmasını gerektirir, çünkü bu ayrıntı önemlidir, ve yarasalar sis ağları nauygun dikkat araştırmacı düzgün örnekleri işlemeden önce gereksiz mortalite veya erken mortaliteye yol açabilir. Birkaç yarasa en az sıkıntı ile bir arp tuzağında dinlenebilir çünkü, bu yaklaşım yüksek yarasa aktivitesi olan alanlar için idealdir, bir mağara veya büyük tünek yakın gibi. Morfolojik ve demografik bilgilerin toplanması için uygun yarasa yakalama ve veri işleme için ayrıntılı talimatlar ek yöntemler mevcuttur.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (protokol #2013-2034).

1. Ötenazi

1. Bir isoflurane anestezi veya başka bir mevcut anestezik ile bir pamuk topu nemlendirin.
2. Bir resealable, hava geçirmez plastik torba içine pamuk topu yerleştirin. Çanta rahat bir bez yarasa çantası bir çanta tutmak için yeterince büyük olmalıdır.
3. Poşetin anestezi ile nüfuz etmesine birkaç dakika kaldıktan sonra, yarasaiçeren bir yarasa torbasını plastik torbaya yerleştirin.
4. Yarasa ötenazi yapılana kadar birkaç dakika bekleyin. Yarasalar ~ 20 g veya daha az ağırlık yaklaşık 5-10 dakika. Yarasalar bu kadar 20 dakika kadar gerektirebilir daha büyük gerektirir. Anestezinin yayılmasını en üst düzeye çıkarmak için mümkün olan en ince bez malzemenin kullanılması tavsiye edilir.
5. Diseksiyon başlamadan önce yarasa ötenazi olduğundan emin olmak için nefes ve kalp atışı kontrol edin.

2. Diseksiyon Hazırlığı

1. Aşağıdaki protokolü kullanarak tüm enstrümantasyonları diseksiyonlar arasında temiz tutun.
2. Aletleri su ve bulaşık sabunu ile yıkayın. Çamaşır suyu nükleik asitleri parçalayacak gibi, diseksiyon alanından uzak, % 10 çamaşır suyu ile silin.
3. %70 etanol ile silin.
4. RNAse dekontaminasyon reaktifi ile silin.
5. Her diseksiyondan sonra bu bölümü tekrarlayın.

3. Doku Örnekleri için Şişelerin Hazırlanması

1. RNA için:
   1. Gecikmeleri önlemek için herhangi bir diseksiyon başlamadan önce tüm şişeleri hazırlayın.
   2. Her numune için gerekli şişe sayısını bir kenara koyun. Her tüpü, toplanacak doku tipive standart numune tanımlama bilgilerini etiketle. Şişeleri %50 dolu RNA stabilizatör çözeltisi doldurun ve ideal olarak 4 °C'ye kadar soğutun.
   3. Şişeleri RNA stabilizatör çözeltisi ile tamamen doldurmamaya dikkat edin, aksi takdirde tüp LN2'ye yerleştirirken patlayabilir. Doku örnekleri alırken, büyük doku topaklarının RNA stabilizatör çözeltisi tarafından tam olarak nüfuz edilmeyeceğini unutmayın. Bu nedenle, bir boyutta 0,5 cm'den büyük olmayan küçük parçalar halinde dokuyu kesin ve RNA stabilizasyon çözeltisi: doku için en az 10:1 hacimlik bir oranı koruyun.
   4. En azından, diseksiyonlu dokuların RNA stabilizatör çözeltisine yerleştirilmesi gerekir, LN2'ye erişim veya mevcut olmayan soğuk hava depolarına erişim olsa bile.
2. DNA için:
   NOT: Nükleer DNA içeriği hemen hemen tüm dokular için aynıdır; bu nedenle, örnekleme esnek olabilir. Ancak, kas dokusunda mitokondri yüksek yoğunlukları nükleer genom için okuma kaybına yol açabilir unutulmamalıdır³⁸.
   1. Düşük molekül ağırlıklı DNA için, silika depolamak için kanat zarının bir veya daha fazla kopyasını alın ve/veya Kaslar RNA stabilizasyon çözeltisinde veya doku stabilizasyon çözeltisinde depolayın.
   2. Ultra HMW DNA için, herhangi bir depolama reaktifi olmadan LN2'de parlama-donma, ardından -80 °C veya daha soğuk uzun süreli depolamaya aktarın. Kranial diseksiyonu itibaren, beyin dokusu ultra HMW DNA almak için en uygun doku^tipi39, postkraniyal diseksiyonlar ise, karaciğer veya kas daha uygundur⁴⁰.
   3. Kranial diseksiyon için bazı dokular için RNA stabilizatör çözeltisinin 5 mL şişesini (standart 2 mL şişelerin aksine) kullanın. Tüm şişeler kriyojenik olmalı. Parçalara ayırırken şişeleri buzda tutun.

4. RNA için Kranial Diseksiyon

1. Ötenaziden hemen sonra, numunenin kafasını büyük bir makas veya kemik kesicilerle ayırın(Şekil 3).
2. Optik sinir ayırmak için yeterince güçlü kuvvet kullanarak forceps ile gözleri çıkarın. Gözleri 2 mL RNA stabilizatör çözeltisi içine yerleştirin.
3. Seçtiğiniz aracı kullanarak, saç, fasya ve burun deri de dahil olmak üzere kafatası kasları, kafatası cilt. Burnun ön ucunu kırmamaya dikkat edin.
4. Makas kullanarak, boyunbaşlayan kafatasıventral kısmı(Şekil 3)bir sagittal kesim yapmak, beyne zarar vermemeye özen.
5. Forseps kullanarak, kafatasının her iki tarafını da hafifçe çatlayana ve beyin açığa çıkana kadar geri çekin.
6. Kafatasının kaudal ucunda, kokleae şimdi yanal başın her iki tarafında görünür olmalıdır. Onlar sol ve sağ tarafında küçük, küresel kemikler, sadece boyun ve masseter kasları postertral vardır. Forseps kullanarak kokleae'yi yavaşça çekin ve 2 mL'lik bir RNA stabilizasyon çözeltisi içine koyun.
7. Yavaşça forceps ile beyin (çok yumuşak olacak) kazıyın. Koku ampul görünür hale gelecektir, kafatasıiç ventral kısmında oturan. Koku ampulü bağlı tutmaya çalışın.
8. Koku ampul zaten kaldırılmış değilse, yavaşça doku kazıyın, ve kribriform plaka belirgin hale gelecektir. Bu araştırmacı odaklı tutmak için kritik bir kemiktir. Birden fazla foramen ile kafatasının en ön bölge olarak tanımlanabilir ve koku ampul dinlenir hangi noktada iki oluklar.
9. Mümkünse, beyin şeklini sağlam tutun ve şekli korumak için hemen kuru buzun üzerine yerleştirin veya 5 mL'lik RNA stabilizasyon çözeltisi içinde. Eğer immünohistokimya beyin üzerinde yapılacaksa, varsa %4 paraformaldehit yerleştirin.
10. Üst ve alt çenenin birleştiği yerde iki kesi yapın ve çeneyi çıkarın.
11. Mandibula çıkarıldıktan sonra, kafatasının kalan kısmından rostrum (üst çene) çıkarın. Çenenin kribriform plakayı içerdiğinden emin olun.
12. Burnu RNA stabilizatör çözeltiye yerleştirin ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Bu yoğun bir doku olduğu için, RNA stabilize çözeltisi tüm doku nüfuz izin vermek için zaman gerektirir.
13. Burun şişesini RNA stabilizatör çözeltisinde bir gece bekletmekten sonra LN2'ye yerleştirin.
14. Alt mandibula itibaren, makas ile dil kesti ve daha sonra rna bir 2 mL şişe yerleştirin.
15. Bu protokol kafatasının çoğunu kaybediyor. Dişler, özellikle mandibula dan, kurtarılabilir ve tür tanı için yararlı olabilir. Kemik dokusu 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde saklanabilir.

5. RNA için Postkraniyal Diseksiyon

1. Karın boşluğunu delmek için neşter kullanın, kaburgalara kadar uzunlamasına bir kesi(Şekil 3). Bu iskelet çerçevesini kaybeder. Kemik korunacaksa, dikkatli bir şekilde kas deriden kesip yumuşak doku diseksiyonu tamamlandıktan sonra 1x PBS saklayın.
2. Pektoral kas ortaya çıkarmak için cilt şerit, kas en az iki örnek almak, RNA stabilizasyon çözeltisi için bir ve HMW DNA için dondurulmuş kalmak için bir, LN2 koymak için bir şişe hemen yerleştirerek.
3. Göğüs kafesini kesin ve akciğerden örnekler toplamak için kaburgaları çekin.
4. Tüm alınabilir ama yarıya kesilmelidir kalp toplamak, böylece RNA stabilize çözeltisi iyice ıslatır.
5. Karaciğerden örnek al. En az iki karaciğer örneği alın, biri HMW DNA'sı için donmuş olarak kalacak, hemen boş bir şişeye koyup LN2'ye koyun. Karaciğer çok enzimatik, ve örnekleri yeterince küçük RNA stabilize çözeltisi için tam olarak emmek için yapmak önemlidir.
6. Karaciğerden safra boşaltmak için işlevleri hepatik kanal, pankreas ve ince bağırsak karaciğer bağlanır. Bu damar kolayca karaciğer inferior / posterior kısmını probing ve posterior bir şekilde damar izleme ile tanımlanabilir. Kanal genellikle yeşilimsi bir renk, de. Pankreas ve safra kesesi bulmak ve ayrı ayrı toplamak için hepatik kanalı izleyin. RNA stabilizatör çözeltisinin ilgili şişelerine yerleştirin.
7. Mide toplamak ve, yanında, tabanında ve mor farklı bir gölge olarak görünen, tüy gibi dalak olduğunu. Pankreas da burada beyaz bir yapı olarak görülmelidir (Şekil 3). RNA stabilizatör çözeltisinin ilgili şişelerine yerleştirin.
8. Küçük ve kalın bağırsak küçük örnekleri toplamak. RNA stabilizatör çözeltisinin ilgili şişelerine yerleştirin. Bağırsaklar da endoparazit taraması olabilir. Eğer bir parazitolog sahadaysa, parazitler için bir muayene yapılabilir. Bu daha sonra yapılacakise, tüm bağırsak 5 mL kriyojenik şişe alınabilir.
9. Böbreklerden birini al ve kanallarını mesaneye kadar takip et. RNA stabilizatör çözeltisinin ilgili şişelerine yerleştirin.
10. Testisler (eğer erkek) veya rahim ve yumurtalıklar (eğer kadın) aracılığıyla bulmak için bir rehber olarak diğer böbrek kullanın. Mümkünse bir veya her iki gonad toplayın.
11. Ayrı şişelerde kanat cildinin çeşitli bölgelerinden örnekleri tutun (kas vs kas olmayan parçası).

6. Doku Kültürü Toplama ve Hazırlama

1. %20 fetal sığır serumu (FBS), %1 penisilin/streptomisin (P/S) ve 50 μg/ mL gentamisin içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası (DMEM) oluşturarak hücreler için büyüme ortamı hazırlayın. Büyüme medya aliquots protokolün her gün taze yapılmalıdır.
2. Toplama yapıldıktan sonra, kanat biyopsisi yumrukları doğrudan iyi kapatılmış 1,5 mL santrifüj tüp içinde 1 mL soğuk büyüme ortamına yerleştirilmelidir. Mühürlemek için tüpü parafilm'e sarın.
3. Tüpler daha sonra numuneleri 4 °C'de tutmak için soğutma elemanlarına sahip polistiren bir kutuiçinde taşınmalıdır. Ulaşım hızlandırılmalıdır; rağmen, sağlıklı hücreler kadar bu şekilde depolanmış olan yumruklar yapılabilir 6 gün ama daha az optimal²³.
4. Doku kültürü tesisine nakledildikten sonra, aşağıdaki protokol hücre kültürleri oluşturmak için kullanılabilir. Standart steril teknikler protokolün geri kalanı için kullanılmalıdır^41.

7. Gün 1 Doku Kültürü: Doku İzni

1. Tüpün içeriğini (kanat zarı biyopsisi içeren büyüme ortamı) 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın.
2. Büyüme ortamını dikkatlice çıkarın. Biyopsiyi 500 μL steril PBS ile iki kez hafifçe yıkayın.
3. Tüpe 500 μL kollajenaz IV (1 mg/ mL) ekleyin. Bu tek tek hücrelere doku sindirimine neden olacaktır.
4. Ajitasyon olmadan 37 °C'de bir gecede (maksimum 16 saat) kuluçkaya yatın.

8. Gün 2 Doku Kültürü: Kaplama Hücreleri

1. Taze büyüme ortamı nı ve 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.
2. Kullanılacak plakanın her kuyunun her kuyusu için 2 mL taze, önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyerek 6 kuyulu doku kültür plakası hazırlayın (3 mm kanat biyopsisi başına 1 kuyu). Bu plakayı 37 °C ve %5 CO₂ kuluçka makinesinde gerektiğinde (adım 8.7) saklayın.
3. Hücreleri içeren 15 mL'lik tüpü kuvözden çıkarın ve 1 mL taze büyüme ortamı ekleyerek sindirim reaksiyonuna son verir (önceden 37 °C'ye ısıtılmış).
4. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için p1000 pipet ucu ile çözeltiyi dikkatlice triturating ederek hücreleri yeniden askıya alın.
5. Yavaşça 300 x g3 dakika için bir tablo üst santrifüj hücreleri aşağı spin .
   NOT: Küçük doku parçaları süspansiyonda veya 15 mL borunun duvarına bağlı olarak görülebilir. Ancak bu hücre süspansiyon uyrama hazırlık etkilemez
6. P1000 pipetli sıvının %80-90'ını hafifçe çıkararak süpernatant'ı atın.
   NOT: Hala görünürse, doku parçasını atmayın ve bir sonraki adımda hafifçe triturate (8.7).
7. Önceden ısıtılmış büyüme ortamının 500°L'sinde peleti yeniden askıya alın, peletin veya büyük parçalarının artık görünmediğinden ve hücrelerin yeterince askıya alınmasını sağlamak için süspansiyonu hafifçe triturate. Hücrelerin varlığı nedeniyle medya bulutlu görünebilir.
   NOT: Bu aşamada, hücre süspansiyonunun kalitesini ve kanat klibinden elde edilen hücrelerin verimini değerlendirmek için uygulanabilir bir hücre sayısı yapılabilir (daha fazla ayrıntı için 10.11. adıma bakınız).
8. Yavaşça 6 kuyu plaka tek bir kuyuiçine hücre süspansiyon tüm hacmi pipet.
   NOT: Yukarıdaki adımı hemen gerçekleştirin ve hücrelerin 8.7 adımdan sonra yerleşmesine izin vermeyin. Hücre süspansiyonuna yavaşça kuyunun yüzeyine damla gibi dağıtmak için bir pipet kullanın. Bu, kuyunun ortasında ki hücrelerin kümelenmesine neden olacağından, tüm çözeltiyi kuyunun ortasına sokmayın.
   NOT: Doku parçası hala görülebiliyorsa, onu kültür kabına iyi aktarmayın.
9. Hücrelerin kuyu yüzeyinde tek bir katmanda dağiyete yol alabilmek için plakayı yanyana ve önden arkaya 2x-3x'ten yavaşça sallayın.
10. Mikroskop altında kaplanmış hücreleri kontrol edin, onlar toplanmış ve yüzen ama çok yoğun görünen tek hücreler olmalıdır gibi.
11. Plakayı 37 °C ve %5 CO_2'yeayarlanmış bir kuluçka makinesine dikkatlice yerleştirin.
12. ~ 24 saat sonra, kültürün sağlığını belirlemek için mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. Hücreler artık plaka yüzeyine iliştirilmeli ve düzleştirilmiş görünmelidir(Şekil 4A). Mikroskoptan bakıldığında kültürde farklı hücre tipleri görülebilir.
13. Büyük olasılıkla bağlı olmayan bazı yüzen hücreler olacaktır. Bu hücrelerin bir kısmı ölü. Kuyuda yüksek oranda yüzen hücreler görünüyorsa, ortam yenilenmelidir. Bu durumda, dikkatlice iyi den orta ~ % 50 aspire ve yavaşça hücreleri rahatsız etmemek için kuyunun yan tarafında önceden ısıtılmış büyüme ortamı 1 mL ekleyin.
14. Hücreleri 37 °C ve %5 CO₂olarak önceden ayarlanmış bir kuluçka makinesinde saklar. Hücreler düzenli olarak mikroskop altında gözlemlenmelidir (ama günde bir kereden fazla değil) medya ferahlığı veya bölme ihtiyacını belirlemek için.
    NOT: Hücreler yeni kaplandığında, hızlı bir şekilde bölünür ve bu nedenle her gün kontrol edilmelidir. Kültürde bir süre sonra, büyüme yavaşlayacak ve her 48-72 saat kontrol edilebilir.

9. Ferahlatıcı Medya

1. Büyümelerini ve kültür kalitelerini gözlemlemek için mikroskop altındaki hücreleri düzenli olarak kontrol edin. Ortamın rengini kalitesinin bir göstergesi olarak izleyin. Hücreler en fazla 3 gün boyunca aynı ortamda kalmalı veya hangisi önce gelirse, geçiş gerekli olana kadar.
   1. Hücreler hızla büyüyor ve ortam yorucu ise, bu da göz için görünür olacak, medya rengi kırmızıdan sarıya dönecek gibi.
2. Gerektiğinde kuyudan ortamın ~%50'sini dikkatlice aspire edin ve hücreleri rahatsız etmemek için kuyunun kenarına yaklaşık aynı hacimde ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin.
3. Hücreleri 37 °C ve %5 CO₂ kuluçka makinesine geri döndürün.

10. Passaging Hücreleri

1. Passaging hücreleri varolan bir kültürü alıp yeni kuyulara bölmeyi ifade eder. Geçiş, hücreler ~%80'lik bir konfluent olduğunda [yani kuyu yüzeyinin ~%80'ini işgal ettiklerinde ve plastiğin sadece ~%20'si hala boşluk olarak görülebildiğinde) gerçekleşmelidir(Şekil 4B)].
2. Dikkatle aspire ve büyüme ortamının ~ 90% atın.
3. Hücreleri rahatsız etmemek için kuyunun duvarına 1 mL steril PBS ekleyerek hücreleri çok nazikçe yıkayın. Yavaşça plaka ileri geri ve yan yana 2x-3x kaya. Dikkatlice aspire ve plaka tüm PBS atın.
4. Hücreleri tekrar yıkamak için adım 10.3'u tekrarlayın.
5. Yavaşça 250 μL tripsin-EDTA (Sigma Aldrich, Cat #T4049) kuyuya ekleyin ve oda sıcaklığında 1,5 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Trypsin-EDTA çözeltisinin plakayı hafifçe sallayarak kuyunun tüm yüzeyini kapladığından emin olun.
6. 1 mL taze önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyerek reaksiyonu söndürün.
7. Pipet yukarı ve aşağı ~ 5x plaka yüzeyinden hücreleri yıkamak ve hücrelerin süspansiyon olduğundan emin olmak için.
   NOT: Çözelti hücrelerin varlığı nedeniyle bulutlu olmalıdır.
8. Hücre süspansiyonuna 15 mL'lik bir tüp yerleştirin ve hücreleri 3 000 x g'da3 dakika boyunca masa üstü bir santrifüjde döndürün.
9. P1000 pipetli sıvının %80-90'ını hafifçe çıkararak süpernatant'ı atın.
10. Önceden ısıtılmış büyüme ortamının 1 mL'lik peletini yeniden askıya alın ve süspansiyonu hafifçe triturate. Peletveya peletin büyük parçalarının artık görünmediğinden ve hücrelerin tek hücreli süspansiyonda olduğundan emin olun.
11. Burada açıklandığı gibi otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak, ya da el ile referans video⁴²ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir hemositometre kullanarak . Uygun hücreleri tespit etmek için 1:1'deki askıdaki hücrelerden 10 μL aliquot'u Trypan mavisi ile karıştırın.
12. 1 dk ve pipet 10 μL çözelti için sayım slayt üzerine kuluçka. Uygun ayarları kullanarak hücreleri saymak için sayım slaytını otomatik bir hücre sayacına ekleyin. Verim 6 kuyu plakası bir confluent tek kuyudan yaklaşık 1-2 milyon hücre olmalıdır, bu hücre ve türlerin büyüklüğüne bağlı olarak değişebilir rağmen. Hücreler tek bir hücre süspansiyonunda değilse, hücre sayısı doğru olmayacaktır.
13. Bu hücre kültürleri genellikle 1:2 bölünmüş tolere edecek [yani, hücrelerin bir confluent kuyu iki yeni kuyu (toplam) ayrılabilir. Bunu yapmak için, hücreleri tekrar hafifçe triturate, sonra iki yarıya hücre süspansiyon almak (~ 730 μL her) ve damla moda önceden ısıtılmış büyüme ortamı 750 μL içeren iki yeni kuyuların her içine yerleştirin.
    NOT: 2-3 gün sonra kuyular aksamalı ve tekrar bölünmeye hazır olmalıdır. Bu noktada, bir hücre kuyusunda uygun donma protokolü (bölüm 11) tarafından korunması önerilir. Hücrelerin daha fazla stokları arzu olarak daha fazla geçişler sırasında dondurulmuş olabilir.
    NOT: ~6 pasajdan sonra, hücreler senescence girmek eğilimindedir ve artık bölmek. Bu, hücrelerin artık bölünemeyeceğiniveya hücre sayılarını artırmak için genişletilemedileemeyeceğinin bir göstergesidir. Bu aynı zamanda hücrelerin çok daha uzun süre canlı olmayacağının bir göstergesidir.

11. Donma Canlı Canlı Hücreleri

1. DMEM'i %20 FBS, %10 DMSO, %1 P/S ve 50 μg/ mL gentamisin ile birleştirerek dondurucu ortam hazırlayın.
2. Donma, geçiş işlemine göre peletlenmiş hücreler alınarak gerçekleştirilir. Pelet, 8.1-8.9 adıma göre 6 kuyuplakasının (~1-2 milyon hücreyi temsil eden) %80-90'lık bir kuyudan hazırlanmalıdır.
3. Peleti 1,5 mL dondurucu ortamda yeniden askıya alın.
4. İki ayrı cryovial'ın her birine ~750 μL hücre süspansiyonu yerleştirin.
5. Bir kriyojenik donma kabına şişeleri yerleştirin, hangi hücrelerin hücre canlılığını korumak için yavaş yavaş donma ile sonuçlanır. Hemen -80 °C'ye yerleştirin.
6. 24-48 saat sonra, uzun süreli depolama için ln2 hücrelerin cryovials aktarın. Bu şekilde depolanan, hücreler canlandı olabilir ve yıllarca yaşayabilir olacaktır.

12. Dondurulmuş Hücreleri Eritme

1. Kullanılacak her kuyuda 2 mL önceden ısıtılmış büyüme ortamı içeren 6 kuyuluk bir plaka hazırlayın (erimekte olan hücrelerin şişe başına 1 kuyusu). Plakayı 37 °C ve %5 CO₂ kuluçka makinesinde ihtiyaç duyulana kadar saklayın.
2. LN2'den bir şişe hücre alın ve hücreleri hızla eritmek için ılık su banyosuna (37 °C) yerleştirin. Bu 2-3 dakika sürer.
   NOT: Dondurucu ortamdaki DMSO çözüldükten sonra hücreler için toksik olduğundan şişeleri 3-5 dakikadan daha uzun süre eritmekten bırakmayın.
3. Şişedeki çözelti çözülür çözülmez, çözeltiyi homojenize etmek için yavaşça yukarı ve aşağı pipet ler yerleştirin ve hemen tüm çözeltiyi (~750 μL) 6 kuyulu bir plakanın bir kuyuya yerleştirin (adım 12.1'de önceden hazırlanmış).
4. Hücrelerin kuyu yüzeyine tek bir katmanda dağalanın yardımcı olmak için plakayı yavaşça bir taraftan diğer yana ve önden arkaya 2-3 kez sallayın.
5. Hücreleri 37 °C ve %5 CO₂ kuluçka makinesinde 24-48 saat boyunca kuvöze yerleştirin.
6. Yukarıda açıklandığı gibi hücreleri izleyin ve iletin.

Sonuçlar

Dna
Standart düşük molekül ağırlığı (LMW) analizleri için DNA üç neotropikal yarasa türünden çıkarıldı. Bu yazıda açıklanan protokoller izleyerek Dominik Cumhuriyeti ve Kosta Rika'dan bölgede doku örnekleri toplanmıştır. Diseksiyonun ardından, rna stabilizasyon çözeltisine (beyin, karaciğer ve bağırsak) küçük parçalar (en ince kısımda 0,5 cm) yerleştirildi, flaş donduruldu ve -80 °C'de depolandı. Ekstraksiyonlar RNase tedavisi<...

Tartışmalar

Bu el yazmasında tartışılan protokol yarasaların çeşitli yüksek işlemmoleküler analizleri için en iyi örnekleme uygulamalarını açıklayınız. Tüm başarılı -omics çalışmaları yüksek kaliteli doku gerektirir, ancak örnekleme yarasa dokusu, yanı sıra diğer model olmayan organizmalar, genellikle kontrollü bir laboratuvar ayarı ile aynı standartlara ayarlanamayan alan koşullarında oluşur. Örnekleme genellikle elektrik ve donduruculara sınırlı erişim de dahil olmak üzere en az kaynaklar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf Safelock tubes	Fischer Scientific	10509691	1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes	Sarstedt	62,554,002	15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials	Thomas Scientific	1154P75	cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3 mm biopsy punch	Medline	MIL3332	wing biopsy punch for cell culture
6 well plate	Greiner	83,392	Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent	Qiagen	76405	for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber	Bio-Rad	145-0011	Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
Collagenase IV	Stemcell Technologies	7909	For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650-5X5ML	Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	12491-015	culture media
Dulbecco's PBS	Invitrogen	14190169	Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS)	Fischer Scientific	10270106	Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt	Sigma Aldrich	G1264-250MG	Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0050	Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate
PARAFILM	Sigma	P7793	Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x	Invitrogen	15140130	Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4	Thermo Fisher	10010023	salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water
RNAlater	Thermo Fisher	AM7021	RNA stabilizing solution
RNAse away	Genetech	83931-250mL	breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel	Fisher Scientific	7631-86-9	dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Automated cell counter
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013	Cell stain used to assess cell viability
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049	For dissociation of cells during splitting