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Résumé

Il s'agit d'un protocole pour la préparation optimale des tissus pour les analyses génomiques, transcriptomiques et protéomiques des chauves-souris capturées à l'état sauvage. Il comprend des protocoles pour la capture et la dissection des chauves-souris, la préservation des tissus et la culture cellulaire du tissu de chauve-souris.

Résumé

À mesure que les technologies de séquençage à haut débit progressent, des méthodes normalisées d'acquisition et de préservation de tissus de haute qualité permettent d'étendre ces méthodes aux organismes non modèles. Une série de protocoles visant à optimiser la collecte des tissus chez les chauves-souris a été mise au point pour une série d'approches de séquençage à haut débit. Il s'agit de protocoles pour la capture des chauves-souris, de données démographiques souhaitées à recueillir pour chaque chauve-souris et de méthodes optimisées pour minimiser le stress sur une chauve-souris pendant la collecte des tissus. Plus précisément décrits sont des méthodes pour la collecte et le traitement des tissus pour obtenir (i) l'ADN pour les analyses génomiques de poids moléculaire élevé, (ii) l'ARN pour les transcriptomes spécifiques aux tissus, et (iii) les protéines pour les analyses de niveau protéomique. Enfin, également décrit est une méthode pour éviter l'échantillonnage mortel en créant des cultures cellulaires primaires viables à partir de clips d'ailes. Une motivation centrale de ces méthodes est de maximiser la quantité de données moléculaires et morphologiques potentielles pour chaque chauve-souris et de suggérer des moyens optimaux pour préserver les tissus afin qu'ils conservent leur valeur au fur et à mesure que de nouvelles méthodes se développent à l'avenir. Cette normalisation est devenue particulièrement importante à mesure que des initiatives visant à séquencer des génomes d'espèces sans chromosome et sans erreur ont vu le jour, dans lesquelles de multiples parties scientifiques sont à l'origine du séquençage de différents génomes taxonomiques. Groupes. Les protocoles décrits ci-dessus définissent les méthodes idéales de collecte et de préservation des tissus pour Bat1K, le consortium qui séquence les génomes de chaque espèce de chauve-souris.

Introduction

Les méthodes de séquençage à haut débit (HTS) ont rapidement progressé en efficacité et ont diminué en coût, et il est maintenant possible d'étendre ces approches à des centaines ou des milliers d'échantillons. Les connaissances obtenues par l'application de ces technologies ont d'énormes impacts dans de multiples disciplines scientifiques, de la biomédecine à l'évolution et à l'écologie1,2,3. Pourtant, de nombreuses applications HTS s'appuient de façon critique sur les acides nucléiques de haute qualité à partir d'une source vivante. Cette limitation est susceptible de devenir de plus en plus problématique avec le développement du séquençage de troisième génération basé sur des molécules à longue lecture4. Pour ces raisons, il est nécessaire de concentrer les efforts sur l'établissement de pratiques exemplaires pour la collecte d'échantillons de tissus frais provenant d'organismes sauvages à l'extérieur du laboratoire, ce qui maximise l'utilité du matériel et réduit le nombre d'individus qui doivent être calme.

Bat1K est un consortium international de scientifiques avec une initiative en cours pour séquencer le génome de chaque espèce de chauve-souris à l'assemblage au niveau chromosomique5. Les chauves-souris représentent 20% de la diversité des mammifères et ont des adaptations exceptionnelles qui ont des implications pour comprendre le vieillissement, l'écologie des maladies, la biologie sensorielle, et le métabolisme5,6. De nombreuses chauves-souris sont également menacées ou en voie de disparition en raison de l'exploitation humaine7 ou diminuent rapidement en raison d'agents pathogènes8,9, et le séquençage au niveau du génome est d'une grande importance pour la conservation de ces espèces. Bien que Bat1K vise actuellement à séquencer les génomes de toutes les espèces de chauves-souris, la normalisation de la collecte d'échantillons de tissus pour le séquençage génomique de haute qualité demeure un défi majeur dans la communauté des biologistes de l'organisation. En plus des données génomiques, la compréhension fonctionnelle de la diversité des adaptations des chauves-souris nécessite des analyses de transcriptome et de protéines spécifiques aux tissus, nécessitant souvent des protocoles de collecte distincts. En outre, comme pour tous les groupes taxonomiques, bien qu'une collecte et une conservation optimales des tissus soient essentielles pour obtenir des données de la plus haute qualité pour les analyses -omics, il est souvent difficile de communiquer les meilleures pratiques en raison de l'évolution rapide des technologies et plusieurs équipes de recherche travaillant de façon indépendante.

La nécessité d'adopter des pratiques exemplaires pour la recherche sur les chauves-souris est particulièrement urgente, étant donné que de nombreuses espèces de chauves-souris sont rares ou menacées. Contrairement à d'autres petits mammifères comme les rongeurs et les persévisses, les chauves-souris sont de longue durée, attribuables à des mécanismes exceptionnels de réparation de l'ADN10 et à la reproduction lente11, la plupart des espèces donnant naissance à un seul ou (dans quelques cas) deux jeunes par an. Pour ces raisons, les populations de chauves-souris peuvent être lentes à se remettre de la perturbation, et la collecte de nombreux individus dans la nature n'est ni souhaitable ni faisable. En d'autres termes, les protocoles doivent être optimisés pour obtenir la quantité maximale de données pour un seul spécimen, réduisant ainsi la nécessité de reproduire inutilement les efforts d'échantillonnage.

Ici, ce protocole se concentre spécifiquement sur les méthodes normalisées pour la collecte et l'échantillonnage du tissu de chauve-souris pour le séquençage génomique et transcriptomique et les analyses de protéines. Sa priorité absolue est de s'assurer que les tissus des chauves-souris sont recueillis de manière éthique et responsable, allant du processus de délivrance des permis pour la collecte, l'exportation de tissus à la minimisation du stress à l'animal, et les conditions d'entreposage à long terme. Des dissections élaborées ont été développées dans le but de mettre à l'épreuve l'utilité des différents matériaux collectés. Ce manuscrit fournit un guide étape par étape pour recueillir les chauves-souris d'une manière humaine qui vise à minimiser l'impact sur les populations et à maximiser la valeur scientifique. Bien que l'objectif de ce protocole soit spécifiquement utilisé chez les chauves-souris, bon nombre des étapes sont pertinentes pour d'autres taxons vertébrés, en particulier les mammifères.

Aperçu de la collection de tissus
La procédure de collecte des tissus, y compris la température de stockage et le choix de l'agent de conservation, sera déterminée par la nature des analyses en aval prévues. Cependant, il est fortement recommandé que, dans la mesure du possible, le tissu soit recueilli selon une gamme de méthodes afin de maximiser son utilité future, même si aucune analyse spécifique n'est prévue. En général, le tissu est recueilli et conservé pour des analyses ultérieures des acides nucléiques (ADN et ARN), ou des protéines. Pour chacune de ces applications, le tissu peut être conservé de façon optimale par congélation éclair directe dans l'azote liquide (LN2). Cependant, l'immersion immédiate en LN2 n'est pas toujours possible sur le terrain. À mesure que la technologie progresse, les ressources telles que les flacons spécialisés pour stocker l'ADN et l'ARN à des températures ambiantes sont de plus en plus facilement disponibles. Bien que nous n'ayons pas validé tous ces documents dans ce protocole, nous encourageons d'autres chercheurs à analyser comparativement la performance de nouveaux matériaux par rapport à ce que nous présentons ici. Nous fournissons des méthodes pour préserver idéalement les tissus pour différentes applications dans les situations où l'on ne peut pas accéder à la LN2, par exemple lorsque le transport LN2 n'est pas possible en raison de l'accès au site par petit avion en Amazonie. En outre, nous fournissons une méthode pour recueillir les tissus à partir desquels les cellules vivantes peuvent être cultivées et propagées. Ci-dessous, nous exposons les principales considérations pour la collecte de matériel pour chacune de ces fins respectives et un aperçu des méthodes de collecte est donné dans le tableau 1.

Tissu pour l'ADN
Pour tous les tissus récoltés recueillis, le support de stockage déterminera s'il peut être utilisé pour l'extraction de l'ADN standard ou à poids moléculaire élevé (HMW). HMW est nécessaire pour le séquençage à longue lecture et actuellement nécessaire pour générer des assemblages de génome de niveau chromosomique, ou un génome « standard de platine ». L'ADN de faible poids moléculaire (LMW) peut être extrait à partir de flash congelés, AllProtect (désormais appelé «solution de stabilisation des tissus»), ou même RNAlater (désormais "solution de stabilisation de l'ARN") échantillons conservés (bien que les échantillons congelés flash restent optimales ). L'ADN isolé selon les méthodes de laboratoire standard (p. ex., colonnes de spin de membrane de gel de silice, phénol-chloroforme) peut encore produire des fragments d'ADN allant jusqu'à 20 kilobases (kb). Par conséquent, à condition qu'il y ait un rendement suffisant, cette forme d'ADN isolé peut être utilisée pour la préparation de la bibliothèque de taille d'insert unique, dans laquelle la taille de l'insert est souvent de 500 paires de base (bp), et des lectures de séquence séquencés courtes de 100 pb sont générées12. Cet ADN est particulièrement utile pour les projets ou études de « reséquençage » dans lesquels des données chromosomiques pleine longueur ne sont pas nécessaires. L'ADN HMW (10-150 kb) est plus difficile et ne peut être obtenu de façon fiable à l'aide de tissus qui ont été rapidement congelés flash dans LN2 après la récolte et maintenus à un maximum de -80 oC jusqu'à l'extraction.

Un faible poids moléculaire ou un ADN fragmenté est souvent suffisant pour les approches ciblées, y compris l'amplification génétique par PCR et le séquençage à lecture courte13. Les investigations basées sur PCR utilisant l'ADN de LMW qui ciblent seulement un ou quelques gènes ont été très instructives en comprenant l'adaptation et l'évolution moléculaire de la biologie sensorielle de chauve-souris6,14, physiologie15,phylogénétique 5,16, et la conservation17,18. La reconquête ciblée réussie de séquence de faible poids moléculaire et d'ADN fragmenté a également été démontrée pour de nombreux groupes de vertébrés, y compris les chauves-souris19. Ces méthodes sont souvent rentables et peu invasives pour la chauve-souris, car les échantillons fécaux et l'échantillonnage non létal des tissus par des écouvillons buccals ou des poinçons de biopsie des ailes sont également des moyens courants d'obtenir de l'ADN pour les analyses de faible poids moléculaire20, 21.

Cependant, la qualité dépend fortement du type de support dans lequel l'échantillon est stocké22. Après des comparaisons systématiques et quantitatives des écouvillons buccaux et des poinçons de biopsie, les poinçons de biopsie d'aile ont été montrés pour produire des niveaux uniformément plus élevés d'ADN et étaient moins stressants à la chauve-souris pendant la collection22. Ces comparaisons ont également montré que les meilleurs résultats ont été obtenus lorsque le poinçon d'aile a été conservé dans la silice indicateur (c.-à-d., un type de dessiccant fait de perles de gel de silice qui change de couleur lorsque l'humidité est observée) plutôt que dans d'autres médias de stockage populaires tels que l'éthanol ou le DMSO22; bien que, d'autres médias de stockage comprenant la solution de stabilisation de tissu n'aient pas été examinés. Les poinçons d'aile peuvent également être utilisés pour cultiver des cellules fibroblastes en culture, comme dans Kacprzyk etal.23 et comme décrit ci-dessous (voir la section 6). Pour ces méthodes, l'aile ou l'uropatagium doit être étendu doucement, et un poinçon de biopsie propre, typiquement 3 mm de diamètre, devrait être employé pour obtenir l'échantillon. Cette approche ne semble causer aucun dommage durable, avec des cicatrices guérissant plus de semaines dans la plupart des cas24.

L'ADN HMW (10-150 kb) est plus difficile et n'est actuellement obtenu que de façon fiable à l'aide de tissus qui ont été rapidement congelés en LN2 après la récolte et maintenus à un maximum de -80 oC jusqu'à l'extraction. L'ADN HMW (10-150 kb) est crucial pour le séquençage de l'ADN à longue lecture et donc pour l'assemblage du génome de novo. En effet, bien que la plupart des kits commerciaux puissent être utilisés pour isoler certains ADN HMW standard, les tailles de molécules qui en résultent ne répondent souvent pas aux exigences des technologies de séquençage de troisième génération [par exemple, celles lancées par des entreprises telles que Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, et 10x Genomics, ou par le biais de méthodes d'assemblage offertes par Bionano Genomics ou Dovetail Genomics]. En tant que tel, il ya une nouvelle demande pour "ultra HMW" ADN (-150 kb). Lors de l'obtention de l'ADN ultra HMW de chauves-souris, des échantillons frais de foie, le cerveau ou le muscle sont tous appropriés, mais ceux-ci doivent être immédiatement flash congelés dans LN2 sans aucun tampon de stockage ou cryoprotecteur. Une description complète de ces étapes est au-delà de la portée du présent document, mais sont disponibles ailleurs25.

Tissu pour ARN
L'ARN est une molécule à brin unique qui est moins stable que l'ADN. Bien qu'il existe de nombreuses formes d'ARN, les analyses des -omics ont tendance à se concentrer sur l'ARNm (ARN messager) et les petits ARN (p. ex., microARN). Après la transcription, l'ARNm est épissé pour former une transcription mature qui ne contient pas d'introns et représente la partie codante des gènes/génomes. Les gènes codants représentent une infime fraction de la taille du génome (1 %-2 %), ce qui fait du ciblage de l'ARNm un moyen rentable d'obtenir des données de séquence pour les gènes. Les microARN sont une classe d'ARN qui régulent le processus de traduction de l'ARNm en protéines et sont donc d'importants effecteurs réglementaires. Les transcriptions d'ARN peuvent être séquencées individuellement, ou plus généralement pour des analyses de -omics26,27,28,29,30, dans le cadre d'un transcriptome ; c'est-à-dire le total de toutes les transcriptions d'ARN présentes dans un échantillon donné.

Le séquençage peut être effectué selon plusieurs méthodes (c.-à-d. par l'intermédiaire de l'ARN-seq à lecture courte ou du seq isoforme entier à lecture longue), permettant l'analyse de l'abondance de l'ARN et de l'utilisation de l'isoforme. Comme la quantité et la diversité des transcriptions de l'ARNm varient selon les cellules et les tissus, le séquençage de l'ARN permet d'étudier et de comparer l'expression et la régulation des gènes entre les échantillons. L'intérêt pour le séquençage des petits ARN et le séquençage isoforme entier est de plus en plus, car ces méthodes sont de plus en plus biologiquement informatives. La préparation d'échantillons de tissus pour séquencer différentes classes d'ARN peut être effectuée de la même manière que celle présentée dans ce manuscrit, avec seulement les méthodes d'extraction ultérieures différentes31,32. Enfin, parce que les transcriptomes offrent un sous-ensemble de couverture élevée du génome codant en protéines, l'ensemble de données assemblé peut être utile dans l'assemblage et l'annotation du génome, faisant de la collecte de données ARN-seq à travers une gamme de différents tissus une composante importante de la Initiative Bat1K.

Contrairement à l'ADN, l'ARN est chimiquement instable et également ciblé par les enzymes RNase, qui sont omniprésentes présents dans les lysates tissulaires comme une stratégie défensive contre les virus à base d'ARN. Pour ces raisons, la fraction d'ARN dans les cellules et les tissus commence à se dégrader peu de temps après le point d'échantillonnage et/ou d'euthanasie. La préservation de l'ARN nécessite donc des mesures pour prévenir sa dégradation. Il s'agit généralement de préserver les tissus fraîchement recueillis à 4 oC dans un agent stabilisateur tel que la solution de stabilisation de l'ARN pour inactiver les RNases naturellement présents dans les tissus, suivi s'entrelace pour un stockage à plus long terme. Comme alternative préférée, le tissu peut être congelé flash dans LN2; bien que, comme indiqué ci-dessus, le transport de LN2 sur le terrain et le maintien des niveaux pour empêcher le dégel des tissus peuvent être difficiles sur le plan logistique.

Tissu pour protéines
La composition des protéines et l'abondance relative varient d'une manière semblable à celle de l'ARN entre les cellules et les tissus; cependant, les protéines sont en moyenne plus stables que l'ARN. L'identification protéique à l'aide de la protéomique correspond généralement à une fraction de la séquence protéique, et non à l'ensemble, mais elle peut fournir des informations sur l'expression entre les tissus et caractériser les agents pathogènes présents. Comme de nombreuses séquences protéiques sont conservées chez les mammifères, les échantillons de chauves-souris pour la protéomique peuvent facilement être contaminés par des protéines humaines conservées, nécessitant des protocoles stériles (p. ex. gants, forceps) pendant la collecte. Alors que la congélation éclair dans LN2 est le meilleur moyen de prévenir la dégradation des protéines, l'utilisation de la glace sèche, -20 congélateurs C, et même la glace sont appropriés s'il n'y a pas d'autres moyens. À mesure que les températures augmentent, le risque de dégradation différentielle des protéines augmente également. Les agents stabilisateurs tels que la solution de stabilisation des tissus sont efficaces pour préserver la fraction protéique des tissus à température ambiante et conviennent à la conservation à court terme (jusqu'à une semaine) lorsque la congélation éclair n'est pas viable.

Le profil enzymatique d'un tissu donné influence directement la préservation des protéines qui s'y contancient. Les tissus à faible activité enzymatique comme le muscle peuvent préserver les profils protéiques même à des températures plus élevées dans un congélateur domestique. En revanche, le tissu hépatique est enzymatiquement réactif, et ses protéines ont des probabilités plus élevées de dégradation pendant la préparation. Le nombre croissant de protocoles pour l'obtention de profils protéomiques humains à partir d'échantillons de paraffine strucinfixe fixe en forme (FFPE) suggère que la fixation paraformaldéhyde des tissus est prometteuse pour la conservation des protéines à faible coût lorsque la congélation lors de la collecte n'est pas faisable33,34. Bien qu'elles dépendent fortement du temps et de l'état de conservation, les protéines ont été identifiées par immunohistochimie à partir de spécimens de chauves-souris conservés à l'éthanol et à l'éthanol fixés parformaline 35. Cette approche n'est pas évolutive pour l'échantillonnage de niveau protéomique, mais met en évidence le potentiel pour les tissus de chauves-souris formalin-fixes de produire des profils de protéines lorsque le flash-congélation n'est pas disponible et d'autres agents stabilisateurs sont trop coûteux.

Tissu pour la culture cellulaire
L'échantillonnage des tissus et la congélation éclair offre une quantité finie de matériel à utiliser, et une fois que le matériau est utilisé, il n'est plus disponible. Alternativement, les cultures cellulaires fournissent des cellules vivantes qui peuvent être immédiatement utilisées ou préservées pour de futures études. Les cultures facilitent également l'expansion des cellules pour augmenter le rendement lorsque les échantillons de tissus sont petits. Il est particulièrement utile dans les cas où la collecte de tissus est limitée, comme les expériences avec des espèces rares dans lesquelles l'échantillonnage non létal est essentiel et a donc de vastes implications pour la conservation. Décrit est un protocole dans lequel la culture cellulaire est possible par l'échantillonnage non létal du tissu de membrane d'aile, mais la culture est possible avec les types multiples de tissu36,37. Le protocole fourni ici sélectionne pour les cellules adhérentes. La combinaison du tissu source et des supports de croissance utilisés rend ce protocole approprié pour sélectionner et cultiver des fibroblastes, mais si désiré, d'autres protocoles peuvent être utilisés pour sélectionner pour d'autres types de cellules. Dans le cadre du projet Bat1K, on prévoit que pour les espèces rares et menacées, l'échantillonnage non létal des membranes des ailes et l'expansion des échantillons par la culture sont essentiels pour générer le volume d'ADN nécessaire pour les multiples technologies utilisées5 .

Capture de chauve-souris
Toutes les personnes qui manipulent des chauves-souris devraient être formées par un chercheur compétent en chauves-souris et vaccinées contre la rage avec une série d'injections pré-exposition. En cas de morsure, une autre série d'injections post-exposition est encore nécessaire. Les méthodes standard de capture des chauves-souris comprennent les filets de brume (figure 1) et les pièges à harpe (figure 2). Les filets de brume sont le plus couramment utilisés et idéaux pour les zones où l'activité est faible à modérée, car ils nécessitent le plus de soin pour minimiser la détresse des chauves-souris. Les petites chauves-souris sont particulièrement vulnérables et peuvent mourir du stress si elles n'ont pas tendance à le faire rapidement. Les inspections fréquentes des filets minimisent les blessures et la mortalité des chauves-souris ainsi que les dommages au filet de brume. Ce détail est important parce que la collecte appropriée des tissus exige que le tissu soit frais, et une attention inappropriée aux filets de brume dans les chauves-souris peut conduire à une mortalité inutile ou prématurée avant que le chercheur puisse traiter correctement les échantillons. Étant donné que plusieurs chauves-souris peuvent se reposer dans un piège à harpe avec un minimum de détresse, cette approche est idéale pour les zones où l'activité des chauves-souris est élevée, comme près d'une grotte ou d'un grand perchoir. Des instructions détaillées pour la capture appropriée des chauves-souris et le traitement des données pour la collecte d'informations morphologiques et démographiques sont disponibles dans les méthodes supplémentaires.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université Stony Brook (protocole #2013-2034).

1. Euthanasie

  1. Humidifiez une boule de coton avec un anesthésique isoflurane ou un autre anesthésique disponible.
  2. Placer la boule de coton dans un sac en plastique hermétique et hermétique. Le sac doit être assez grand pour tenir un sac dans un sac de chauve-souris en tissu confortablement.
  3. Après plusieurs minutes de laisser le sac imprégner d'anesthésique, placez un sac de chauve-souris contenant la chauve-souris dans le sac en plastique.
  4. Attendez plusieurs minutes jusqu'à ce que la chauve-souris soit euthanasiée. Les chauves-souris de 20 g ou moins de poids nécessitent environ 5 à 10 min. Les chauves-souris plus grandes que celle-ci peuvent nécessiter jusqu'à 20 min. Notez que la durée peut également dépendre de la perméabilité du sac de chauve-souris. Il est recommandé d'utiliser le matériau tissuleur le plus fin possible pour maximiser la diffusion de l'anesthésique.
  5. Vérifiez s'il y a de la respiration et du rythme cardiaque pour vous assurer que la chauve-souris a été euthanasiée avant le début de la dissection.

2. Préparation de la dissection

  1. Gardez toute l'instrumentation propre entre les dissections, en utilisant le protocole suivant.
  2. Laver les instruments avec de l'eau et du savon à vaisselle. Essuyez-les avec 10% d'eau de Javel, loin de la zone de dissection, comme l'eau de Javel décomposera les acides nucléiques.
  3. Essuyez avec 70% d'éthanol.
  4. Essuyez avec le réactif de décontamination DE RNAse.
  5. Répétez cette section après chaque dissection.

3. Préparation des Vials pour les échantillons de tissus

  1. Pour l'ARN :
    1. Préparer toutes les fioles avant de commencer les dissections pour éviter les retards.
    2. Réserver le nombre de flacons nécessaires pour chaque spécimen. Étiquetez chaque tube avec le type de tissu qui sera recueilli, ainsi que des informations d'identification standard des spécimens. Remplir les flacons 50% plein de solution de stabilisation de l'ARN, et idéalement réfrigérer à 4 oC.
    3. Veillez à ne pas remplir complètement les flacons avec la solution de stabilisation d'ARN, sinon le tube peut exploser en le plaçant dans LN2. Lorsque vous prenez des échantillons de tissus, rappelez-vous que de gros morceaux de tissu ne seront pas complètement imprégnés par la solution de stabilisation de l'ARN. Par conséquent, couper le tissu en petits morceaux de pas plus grand que 0,5 cm dans une dimension, et maintenir un rapport d'au moins 10:1 volume pour la solution de stabilisation de l'ARN:tissu.
    4. Au minimum, les tissus disséqués doivent être placés dans la solution de stabilisation de l'ARN, même si l'accès au LN2 ou aux entrepôts frigorifiques n'est pas disponible.
  2. Pour l'ADN :
    REMARQUE :     La teneur en ADN nucléaire est la même pour presque tous les tissus; par conséquent, l'échantillonnage peut être flexible. Cependant, il convient de noter que des densités plus élevées de mitochondries dans le tissu musculaire peut conduire à une perte de lectures pour le génome nucléaire38.
    1. Pour l'ADN de faible poids moléculaire, prendre une ou plusieurs répliques de la membrane d'aile pour le stockage dans la silice, et / ou le muscle pour le stockage dans la solution de stabilisation de l'ARN ou la solution de stabilisation des tissus.
    2. Pour l'ADN ultra HMW, le flash-freeze en LN2 sans réactif de stockage, puis le transfert au stockage à long terme à -80 oC ou plus froid. De la dissection crânienne, le tissu cérébral est le type de tissu le plus approprié pour récupérer l'ADN ultra HMW39, tandis que des dissections postcrâniennes, du foie ou du muscle sont plus appropriés40.
    3. Pour la dissection crânienne, utiliser des flacons de 5 ml (par opposition aux flacons standard de 2 ml) de solution de stabilisation de l'ARN pour certains tissus. Tous les flacons doivent être cryogéniques. Gardez les flacons sur la glace tout en disséquant.

4. Dissections crâniennes pour l'ARN

  1. Immédiatement après l'euthanasie, décapiter le spécimen avec une grande paire de ciseaux ou de coupeurs d'os (figure 3).
  2. Retirez les yeux avec des forceps en utilisant une force assez forte pour détacher le nerf optique. Placez les yeux dans une fiole de 2 ml de solution de stabilisation de l'ARN.
  3. À l'aide de votre outil de choix, la peau du crâne à partir de cheveux, fascia, et les muscles du crâne, y compris la peau sur le nez. Veillez à ne pas casser l'extrémité avant du nez.
  4. À l'aide de ciseaux, faire une coupe sagittale sur la partie ventrale (figure 3) du crâne à partir du cou, en prenant soin de ne pas endommager le cerveau.
  5. À l'aide de forceps, retirez doucement les deux côtés du crâne jusqu'à ce qu'il se soit ouvert et que le cerveau soit exposé.
  6. À l'extrémité caudale du crâne, les cochlée doivent maintenant être visibles latéralement de chaque côté de la tête. Ils sont petits, os sphériques sur le côté gauche et droit, juste rostral au cou et postérieur aux muscles masseur. À l'aide de forceps, tirez doucement les cochlées et placez-les dans une fiole de 2 ml de solution de stabilisation de l'ARN.
  7. Gratter doucement le cerveau (qui sera très doux) avec des forceps. L'ampoule olfactive deviendra visible, assis à la partie ventrale de l'intérieur du crâne. Essayez de garder l'ampoule olfactive attachée.
  8. Si l'ampoule olfactive n'a pas déjà été enlevée, gratter doucement le tissu, et la plaque cribriforme deviendra apparente. Il s'agit d'un os critique pour garder le chercheur orienté. Il peut être identifié comme la région la plus antérieure du crâne avec plusieurs foramen et le point où deux rainures où repose l'ampoule olfactive.
  9. Si possible, garder la forme du cerveau intacte et immédiatement placer sur la glace sèche pour garder la forme ou dans une fiole de 5 ml de solution de stabilisation de l'ARN. Si l'immunohistochimie doit être faite sur le cerveau, placez dans le paraformaldehyde de 4%, si disponible.
  10. Faire deux incisions où la mâchoire supérieure et inférieure se joindre, et enlever la mandibule.
  11. Une fois la mandibule enlevée, retirer la tribune (mâchoire supérieure) de la partie restante du crâne. Assurez-vous que la mâchoire comprend la plaque cribriforme.
  12. Placer le nez dans la solution de stabilisation de l'ARN et le stocker à 4 oC pendant la nuit. Parce qu'il s'agit d'un tissu dense, il faut du temps pour permettre à la solution de stabilisation de l'ARN d'imprégner l'ensemble du tissu.
  13. Placez le flacon de nez dans LN2 après le trempage de nuit dans la solution de stabilisation d'ARN.
  14. De la mandibule inférieure, couper la langue avec des ciseaux et placer dans une fiole de 2 ml d'ARN pour plus tard.
  15. Ce protocole confisque la majeure partie du crâne. Les dents, en particulier celles de la mandibule, peuvent être récupérées et peuvent être utiles pour le diagnostic des espèces. Le tissu osseux peut être stocké dans 1x salin tamponné par phosphate (PBS).

5. Dissections postcrâniennes pour l'ARN

  1. Utiliser un scalpel pour percer la cavité abdominale, en faisant une incision longitudinale jusqu'aux côtes (figure 3). Cela perd le cadre squelettique. Si l'os doit être préservé, disséquez soigneusement de la peau dans le muscle et stockez dans 1x PBS après la dissection molle de tissu est complète.
  2. Dénuder la peau pour révéler le muscle pectoral, prendre au moins deux échantillons de muscle, un pour la solution de stabilisation de l'ARN et un pour rester congelé pour l'ADN HMW, en plaçant immédiatement dans une fiole à mettre dans LN2.
  3. Couper à travers le sternum et retirer les côtes pour prélever des échantillons du poumon.
  4. Recueillir le cœur, qui peut être pris entier, mais doit être sectionné en deux, de sorte que la solution de stabilisation de l'ARN imbibe à fond.
  5. Prenez des échantillons du foie. Prenez au moins deux échantillons de foie, l'un pour rester congelé pour l'ADN HMW, en plaçant immédiatement dans un flacon vide à mettre dans LN2. Le foie est très enzymatique, et il est important de faire les échantillons assez petits pour la solution de stabilisation de l'ARN pour tremper complètement po
  6. Le conduit hépatique, qui fonctionne pour drainer la bile du foie, relie le foie au pancréas et à l'intestin grêle. Ce vaisseau est facilement identifiable en sondant la partie inférieure/postérieure du foie et en traçant le vaisseau d'une manière postérieure. Le conduit est souvent d'une couleur verdâtre, ainsi. Suivez le conduit hépatique pour trouver le pancréas et la vésicule biliaire et de recueillir ces séparément. Placer dans des flacons respectifs de solution de stabilisation d'ARN.
  7. Recueillir l'estomac et, à côté de lui, à sa base et apparaissant comme une nuance différente de violet, est la rate en forme de plume. Le pancréas devrait également être visible ici sous la forme d'une structure blanche (figure 3). Placer dans des flacons respectifs de solution de stabilisation d'ARN.
  8. Recueillir de petits échantillons de l'intestin grêle et gros. Placer dans des flacons respectifs de solution de stabilisation d'ARN. Les intestins peuvent également être examinés pour l'endoparasite. Si un parasitologue est sur le terrain, une inspection des parasites peut être effectuée. Si cela doit être fait à un moment ultérieur, l'intestin entier peut être pris dans une fiole cryogénique de 5 ml.
  9. Prenez l'un des reins et suivez leurs conduits jusqu'à la vessie. Placer dans des flacons respectifs de solution de stabilisation d'ARN.
  10. Utilisez l'autre rein comme guide pour trouver les testicules (si mâle) ou l'utérus et à travers elle les ovaires (si femelle). Recueillir une ou les deux gonades, si possible.
  11. Conservez des échantillons de différentes parties de la peau de l'aile dans des flacons séparés (partie musculaire vs non musculaire).

6. Collection et préparation de la culture tissulaire

  1. Préparer le milieu de croissance des cellules en constituant le médium d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 20 % de sérum bovin fœtal (SGF), 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S) et 50 g/mL de gentamycine. Aliquots de médias de croissance devrait être fait frais chaque jour du protocole.
  2. Après la collecte, les poinçons de biopsie d'aile doivent être placés directement dans 1 ml de milieu de croissance froid dans un tube de centrifugeuse bien scellé de 1,5 ml. Envelopper le tube dans le parafilm pour sceller.
  3. Les tubes doivent ensuite être transportés dans une boîte en polystyrène avec des éléments de refroidissement pour garder les échantillons à 4 oC. Le transport devrait être accéléré; bien que, les cellules saines peuvent être faites à partir de poinçons qui ont été stockés de cette manière pour un jusqu'à 6 jours, mais moinsoptimalement 23.
  4. Une fois transporté à l'installation de culture tissulaire, le protocole suivant peut être utilisé pour générer des cultures cellulaires. Les techniques stériles standard devraient être utilisées pour le reste du protocole41.

7. Jour 1 Culture tissulaire : dissociation des tissus

  1. Transférer le contenu du tube (milieu de croissance contenant la biopsie de la membrane de l'aile) dans un tube de centrifugeuse conique de 15 ml.
  2. Retirez soigneusement le milieu de croissance. Laver doucement la biopsie deux fois avec 500 L de PBS stérile.
  3. Ajouter 500 l de collagène IV (1 mg/ml) dans le tube. Cela entraînera la digestion du tissu dans les cellules individuelles.
  4. Incuber toute la nuit (maximum 16 h) à 37 oC sans agitation.

8. Jour 2 Culture tissulaire: Cellules de plaquage

  1. Faire un milieu de croissance frais et le réchauffer à 37 oC.
  2. Préparer une plaque de culture de 6 puits en ajoutant 2 ml de milieu de croissance frais et préréchauffé dans chaque puits de la plaque à utiliser (1 puits par biopsie de l'aile de 3 mm). Conserver cette assiette dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 % jusqu'à ce que nécessaire (étape 8,7).
  3. Retirez le tube de 15 ml contenant les cellules de l'incubateur et étanchez la réaction de digestion en ajoutant 1 ml de milieu de croissance frais (pré-chauffé à 37 oC).
  4. Resuspendre les cellules en tritutant soigneusement la solution avec une pointe de pipette P1000 pour obtenir une suspension de cellule unique.
  5. Faites tourner doucement les cellules dans une centrifugeuse de table pendant 3 min à 300 x g.
    REMARQUE: De petits morceaux de tissu peuvent encore être visibles en suspension ou attachés à la paroi du tube de 15 ml. Toutefois, cela n'a pas d'impact sur la préparation de la suspension cellulaire
  6. Jeter le supernatant en enlevant doucement 80% à 90% du liquide avec une pipette P1000.
    REMARQUE : s'il est encore visible, ne jetez pas le morceau de tissu et tritulez-le doucement à l'étape suivante (8,7).
  7. Resuspendre la pastille dans 500 oL de milieu de croissance pré-chauffé, triturate doucement la suspension pour s'assurer que la pastille ou les gros fragments de la pastille ne sont plus visibles et que les cellules sont suffisamment suspendues. Les médias peuvent sembler nuageux en raison de la présence de cellules.
    REMARQUE: À ce stade, un nombre de cellules viable peut être effectué afin d'évaluer la qualité de la suspension des cellules et le rendement des cellules dérivées de l'agrafe d'aile (voir l'étape 10.11 pour plus de détails).
  8. Doucement pipette le volume entier de suspension cellulaire dans un seul puits d'une plaque de 6 puits.
    REMARQUE: Effectuez l'étape ci-dessus immédiatement et ne laissez pas les cellules se déposer après l'étape 8.7. Utilisez une pipette pour distribuer délicatement la suspension cellulaire sur la surface du puits d'une manière déroulante. Ne pas pipet toute la solution dans le centre du puits, car cela se traduirait par les cellules s'agglutiner au milieu du puits.
    REMARQUE: si le morceau de tissu est encore visible, ne le transférez pas bien dans le récipient de culture.
  9. Ébranlez doucement la plaque d'un côté à l'autre et d'un 2x à l'arrière pour aider les cellules à se répartir sur la surface du puits en une seule couche.
  10. Vérifiez les cellules plaquées sous le microscope, car elles devraient être des cellules simples qui semblent en boule et flottantes mais très denses.
  11. Placer délicatement la plaque dans un incubateur préréglé à 37 oC et 5 % de CO2.
  12. Après 24 h, observez les cellules au microscope pour déterminer la santé de la culture. Les cellules doivent maintenant être fixées à la surface de la plaque et apparaître aplaties (figure 4A). Différents types de cellules peuvent être visibles dans la culture en regardant à travers le microscope.
  13. Il y aura probablement des cellules flottantes qui ne se sont pas attachées. Une partie de ces cellules sont mortes. S'il y a une forte proportion de cellules flottantes visibles dans le puits, les médias doivent être rafraîchis. Dans ce cas, aspirez soigneusement 50% du milieu du puits et ajoutez doucement 1 ml de milieu de croissance pré-chauffé sur le côté du puits afin de ne pas déranger les cellules.
  14. Maintenir les cellules dans un incubateur préréglé à 37 oC et 5 % de CO2. Les cellules doivent être observées au microscope régulièrement (mais pas plus d'une fois par jour) pour déterminer le besoin de rafraîchissement ou de fractionnement des médias.
    REMARQUE: Lorsque les cellules sont nouvellement plaquées, elles se divisent rapidement et doivent donc être vérifiées tous les jours. Après un certain temps dans la culture, la croissance ralentira, et ils peuvent être vérifiés tous les 48-72 h.

9. Médias rafraîchissants

  1. Vérifiez régulièrement les cellules au microscope pour observer leur croissance et leur qualité de la culture. Surveillez la couleur des médias comme indicateur de sa qualité. Les cellules doivent rester dans le même support pendant un maximum de 3 jours ou jusqu'à ce que le passage soit nécessaire, selon le premier.
    1. Si les cellules se développent rapidement et épuisent le support, cela sera également visible à l'œil, car la couleur du média passera du rouge au jaune.
  2. Chaque fois que nécessaire aspirez soigneusement 50% du milieu du puits et ajoutez doucement à peu près le même volume de milieu de croissance pré-chauffé sur le côté du puits afin de ne pas déranger les cellules.
  3. Remettre les cellules dans l'incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.

10. Cellules de passage

  1. Les cellules de passage se réfèrent à la prise d'une culture existante et à la division en nouveaux puits. La passage devrait avoir lieu lorsque les cellules sont des confluents de 80 % [c.-à-d. lorsqu'elles occupent 80 % de la surface du puits et que seulement 20 % du plastique est encore visible sous forme de lacunes (figure 4B)].
  2. Aspirez soigneusement et jetez 90 % du milieu de croissance.
  3. Laver les cellules très doucement en ajoutant 1 ml de PBS stérile à la paroi du puits afin de ne pas déranger les cellules. Basculer doucement la plaque d'avant en arrière et d'un côté à l'autre 2x-3x. Aspirez soigneusement et jetez tous les PBS de la plaque.
  4. Répétez l'étape 10.3 pour laver les cellules à nouveau.
  5. Ajouter délicatement 250 l de trypsine-EDTA (Sigma Aldrich, Cat #T4049) au puits et incuber pendant 1,5 min à température ambiante.
    REMARQUE: Assurez-vous que la solution trypsine-EDTA couvre toute la surface du puits en berçant doucement la plaque.
  6. Désincer la réaction en ajoutant 1 ml de milieu de croissance frais pré-chauffé.
  7. Pipette de haut en bas de 5x pour laver les cellules de la surface de la plaque et s'assurer que les cellules sont en suspension.
    REMARQUE: La solution devrait devenir trouble en raison de la présence des cellules.
  8. Placer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et faire tourner les cellules dans une centrifugeuse de table pendant 3 min à 300 x g.
  9. Jeter le supernatant en enlevant doucement 80% à 90% du liquide avec une pipette P1000.
  10. Resuspendre la pastille dans 1 ml de milieu de croissance préréchauffé et triturer doucement la suspension. Assurez-vous que les granulés ou les gros fragments de la pastille ne sont plus visibles, et les cellules sont dans une suspension de cellule unique.
  11. Comptez les cellules à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé tel que décrit ici, ou manuellement à l'aide d'un hémocytomètre tel que décrit en détail dans la vidéo de référence42. Mélanger un aliquot de 10 L des cellules suspendues 1:1 avec le bleu Trypan pour détecter les cellules viables.
  12. Incuber pendant 1 min, et pipette 10 l de la solution sur la glissière de comptage. Insérez la glissière de comptage dans un compteur cellulaire automatisé pour compter les cellules en utilisant les paramètres appropriés. Le rendement devrait être d'environ 1 à 2 millions de cellules provenant d'un puits unique confluent d'une plaque de 6 puits, bien que cela puisse varier en fonction de la taille des cellules et des espèces. Si les cellules ne sont pas dans une seule suspension cellulaire, le nombre de cellules ne sera pas précis.
  13. Ces cultures cellulaires tolèrent généralement une scission de 1:2 [c.-à-d. qu'un puits de cellules confluents peut être divisé en deux nouveaux puits (total)]. Pour ce faire, trituratez doucement les cellules à nouveau, puis prenez la suspension cellulaire en deux moitiés (730 l chacune) et placez-les dans chacun des deux nouveaux puits contenant 750 l de milieu de croissance pré-chauffé dans le sens de la goutte.
    REMARQUE: Après 2 à 3 jours, les puits doivent être confluents et de nouveau prêts à être fendres. À ce stade, il est recommandé de préserver un puits de cellules par le protocole de congélation viably (article 11). D'autres stocks de cellules peuvent être congelés pendant d'autres passages comme souhaitable.
    REMARQUE: Après 6 passages, les cellules ont tendance à entrer dans la sénescence et ne se diviseront plus. C'est une indication que les cellules ne peuvent plus être divisées ou étendues pour augmenter le nombre de cellules. C'est également une indication que les cellules ne seront pas viables pour beaucoup plus longtemps.

11. Congélation de cellules vivantes viables

  1. Préparer les supports de congélation en combinant le DMEM avec 20 % de FBS, 10 % de DMSO, 1 % de P/S et 50 g/mL de gentamycine.
  2. La congélation est effectuée en prenant des cellules granulées selon le processus de passaging. La pastille doit être préparée à partir d'un puits de confluent s'il y a 80 % à 90 % d'une plaque de 6 puits (représentant 1 à 2 millions de cellules), selon les étapes 8,1 à 8,9.
  3. Suspendre la pastille dans 1,5 ml de milieu de congélation.
  4. Placer 750 ll de suspension cellulaire dans chacun e cryovial distinct.
  5. Placez les flacons dans un récipient de congélation cryogénique, ce qui entraîne la congélation lente des cellules pour maintenir la vitalité cellulaire. Placez-les immédiatement dans -80 oC.
  6. Après 24 à 48 h, transférer les cryovials des cellules à LN2 pour le stockage à long terme. Stockées de cette façon, les cellules peuvent être réanimées et seront viables pendant des années.

12. Dégeler les cellules congelées

  1. Préparer une plaque de 6 puits contenant 2 ml de milieu de croissance préréchauffé dans chaque puits qui sera utilisé (1 puits par flacon de cellules décongelées). Maintenir la plaque dans l'incubateur de CO2 de 37 oC et de 5 % jusqu'à ce que nécessaire.
  2. Prenez une fiole de cellules de LN2 et placez-la dans un bain d'eau chaude (37 oC) pour décongeler rapidement les cellules. Cela devrait prendre 2 à 3 min.
    REMARQUE: Ne laissez pas les flacons décongeler plus de 3 à 5 min, car le DMSO dans le support de congélation est toxique pour les cellules une fois décongelées.
  3. Dès que la solution dans le flacon est décongelée, pipette doucement de haut en bas pour homogénéiser la solution et placez immédiatement la solution entière (750 l) dans un puits d'une plaque de 6 puits (pré-préparé à l'étape 12.1).
  4. Basculer doucement la plaque d'un côté à l'autre et de l'avant vers l'arrière 2 à 3 fois pour aider les cellules à se répartir sur la surface du puits en une seule couche.
  5. Placez les cellules dans l'incubateur à 37 oC et 5 % d'incubateur de CO2 pendant 24 à 48 h.
  6. Surveiller et passer les cellules telles que décrites ci-dessus.

Résultats

Adn
Pour les analyses standard de faible poids moléculaire (LMW), l'ADN a été extrait de trois espèces de chauves-souris néotropicales. Des échantillons de tissus ont été prélevés sur le terrain en République dominicaine et au Costa Rica, selon les protocoles décrits dans cet article. À la suite d'une dissection, de petits morceaux (0,5 cm à la section la plus fine) de tissus mélangés (cerveau, foie et intestin) ont été placés dans une solution de st...

Discussion

Le protocole discuté dans ce manuscrit décrit les meilleures pratiques d'échantillonnage pour diverses analyses moléculaires à haut débit des chauves-souris. Toutes les études réussies -omics exigent des tissus de haute qualité, mais l'échantillonnage des tissus chauves-souris, ainsi que d'autres organismes non modèles, se produit souvent dans des conditions de terrain qui ne peuvent pas être fixées aux mêmes normes que celles d'un laboratoire contrôlé. L'échantillonnage se produit souvent dans des endro...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions Le Centro de Ecologàa y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sànchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vsquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo et Fanny Fernandez Melo pour la fabrication de tissus collecte au Pérou possible. Nous remercions également tous les membres de Grupo Jaragua et Yolanda Leon d'avoir rendu possible la collecte de tissus en République dominicaine, ainsi qu'à Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita et à tous les membres de la station de recherche biologique de La Selva au Costa Rica, pour avoir l'échantillonnage possible. Nous remercions Ella Lattenkamp et Lutz Wiegrebe pour l'accès et la collecte d'échantillons de poinçons d'aile de Phyllostomus décolorer les chauves-souris pour la génération de culture cellulaire. Les chauves-souris de couleur de Phyllostomus proviennent d'une colonie reproductrice dans le département de biologie II de l'Université Ludwig-Maximilians à Munich. L'autorisation de garder et d'élever les chauves-souris a été délivrée par le bureau vétérinaire du district de Munich. LMD, SJR, KTJD et LRY ont été financés par NSF-DEB 1442142. LMD a été financé par NSF-DEB 1838273. LRY a été financé par le NSF-PRFB 1812035. Le VCS et la DP ont été financés par un prix Max Planck Research Group et une subvention de recherche du Human Frontiers Science Program (HFSP) (RGP0058/2016). SJR, JHTP et KTJD ont été financés par le Conseil européen de la recherche (erC Starting Grant 310482 [EVOGENO]) attribué à SJR, ECT a été financé par la subvention du Conseil européen de la recherche (ERC-2012-StG311000).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Eppendorf Safelock tubesFischer Scientific105096911.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubesSarstedt62,554,00215 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovialsThomas Scientific1154P75cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3 mm biopsy punchMedlineMIL3332wing biopsy punch for cell culture
6 well plateGreiner83,392Culture vessle
Allprotect Tissue ReagentQiagen76405for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamberBio-Rad145-0011Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
Collagenase IVStemcell Technologies7909For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650-5X5MLPrevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle MediumThermo Fisher12491-015culture media
Dulbecco's PBSInvitrogen14190169Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS)Fischer Scientific10270106Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate saltSigma AldrichG1264-250MGAntibiotic for culture media
Nalgene Mr. FrostyThermo Scientific5100-0050Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate
PARAFILMSigmaP7793Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100xInvitrogen15140130Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4Thermo Fisher10010023salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water
RNAlaterThermo FisherAM7021RNA stabilizing solution
RNAse awayGenetech83931-250mLbreaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gelFisher Scientific7631-86-9dessicant agent
TC20 Automated Cell CounterBio-Rad1450102Automated cell counter
Trypan blueBio-Rad145-0013Cell stain used to assess cell viability
Trypsin-EDTASigma AldrichT4049For dissociation of cells during splitting

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