JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Antikor etiketleme, optik temizleme ve gelişmiş ışık mikroskobu kombinasyonu, tam yapıların veya organların üç boyutlu analizini sağlar. Burada açıklanan, kalın böbrek dilimleri immünolabeling birleştirmek için basit bir yöntemdir, etil cinnamate ile optik Temizleme, ve üç boyutlu böbrek yapıların görselleştirme ve kantifikasyon sağlayan konfoköz görüntüleme.

Özet

Optik temizleme teknikleri, sonraki üç boyutlu (3-b) görüntüleme için bir örnek boyunca refraktif indeks dengelenmiş doku şeffaf hale. Makroskopik mesafelere uzanan mikroskobik çok hücreli yapıları analiz etme potansiyeli için tüm araştırma alanlarında büyük önem aldılar. Böbrek tübülleri, damar, sinirler ve glomerüller, sadece kısmen geleneksel iki boyutlu teknikler tarafından şimdiye kadar yakalanan birçok yönde, uzatmak göz önüne alındığında, doku Temizleme de böbrek araştırma birçok yeni alanlar açtı. Optik temizleme yöntemlerinin listesi hızla büyüyor, ancak bu alandaki yeni başlayanlar için belirli bir araştırma sorusu için en iyi yöntemi seçmek zor kalır. Burada sağlanan kalın fare böbrek dilimleri antikor etiketleme birleştiren basit bir yöntemdir; ucuz, toksik olmayan ve kullanıma hazır kimyasal etil cinnamate ile optik temizleme; ve Konfokal görüntüleme. Bu protokol, böbrekler perfkullanmak ve özel ekipman gerektirmeden antikor bağlama artırmak için bir antijen alma adımı kullanın açıklamaktadır. Onun uygulama böbrek içinde görüntüleme farklı çok hücreli yapıları sunulmaktadır, ve nasıl doku içine zayıf antikor penetrasyon sorunlarını gidermek için ele alınmıştır. Ayrıca endojen fluorophores görüntüleme ve çok büyük numuneler edinme ve onları aşmak için potansiyel zorlukları tartışıyoruz. Bu basit protokol, üç boyutta doku çalışması için kolay kurulum ve kapsamlı bir araç sağlar.

Giriş

Tüm organlar veya büyük çok hücreli yapıların incelenmesi artan ilgi üç boyutta şeffaf doku görüntüleme içeren optik temizleme yöntemlerinin gelişmesine yol açmıştır. Yakın zamana kadar, tüm yapıların hücre numarasını, uzunluğunu veya hacmini tahmin etmek için en iyi yöntemler stereoloji veya kapsamlı seri bölümlendirme olmuştur, bu iki boyutta sonraki analiz için doku sistemik örnekleme dayanmaktadır1, 2 , 3. ancak, bu yöntemler zaman alıcı ve eğitim ve uzmanlık yüksek düzeyde gerekir4. Optik temizleme yöntemleri, 3-b görüntüleme5,6,7için doku yarı saydam yapmak için bir örnek boyunca refraktif indeks dengelenerek bu sorunların üstesinden.

İki ana kategoriye düşen çeşitli optik temizleme yöntemleri geliştirilmiştir: solvent bazlı ve sulu bazlı Yöntemler. Sulu-tabanlı yöntemler daha basit daldırma8,9, hiperhidrasyon10,11ve hidrojel gömme12,13bölünebilir. Solvent bazlı Yöntemler dokusu susuz bırakmak, lipidleri kaldırmak ve 1,55 civarında bir değere refraktif indeksleri normalleştirmek. Çoğu solvent bazlı yöntemin sınırlamaları, GFP, solvent toksisitesi, bazı görüntüleme odalarında veya objektif lenslerde kullanılan yapıştırmaları çözünme kapasitesine sahip yaygın olarak kullanılan muhabir proteinlerinin endojen floresans ve dehidrasyon14,15,16,17,18,19,20,21. Ancak, solvent tabanlı Yöntemler, basit, zaman verimli ve farklı doku türleri bir dizi çalışabilir.

Sulu tabanlı Yöntemler, 1,38-1.52 aralığında refraktif endeksleri olan sulu çözümlerde dokusunun daldırma güveniyor8,11,12,22,23,24 . Bu yöntemler endojen floresan muhabiri protein emisyonunu korumak ve dehidrasyon kaynaklı daralma önlemek için geliştirilmiştir, ancak en sulu bazlı Temizleme yöntemlerinin sınırlamaları protokolün daha uzun bir süre içerir, doku genişleme, ve protein modifikasyon (örneğin SCALea2 gibi hiperhidrasyon protokollerinde üretan proteinleri kısmi denatürasyon)7,11,23,25. SCALe, üre kaynaklı doku genişlemesinin dehidrasyon ile dengelenmesi ve elektron mikroskobu10ile değerlendirildiği gibi doku ultrastrasyonu korunmuş olan Ürea ile Sorbitol ile birleştirerek doku genişlemesini ele aldı. Doku daralma veya genişleme yapıların mutlak boyutlarını, nesneler arasındaki mesafeleri veya hacim başına hücre yoğunluğunu etkiler; Böylece, doku temizlendiğinde boyut değişikliklerinin ölçülmesi elde edilen sonuçların yorumlanmasından7,26' ya yardımcı olabilir.

Genel olarak, optik temizleme için bir protokol, ön tedavi, geçirgen, immünolabeling (gerekirse), refraktif indeksleme ve gelişmiş ışık mikroskobu ile görüntüleme (örn. iki foton, konfoköz veya Floresan mikroskopisi). Temizleme yaklaşımlarının çoğu nöronal dokusu görselleştirmek için geliştirilmiştir, ve gelişmekte olan çalışmalar diğer organlarda uygulama doğruluyor5. Bu kapsamlı araç daha önce glomerül27,28, bağışıklık infiltratlar28, damarsal28ve tübül segmentleri dahil olmak üzere böbrek yapıları, güvenilir ve verimli analiz izin göstermiştir 29, ve glomerüler fonksiyon ve sağlık ve hastalık tübül remodeling daha iyi anlayış için ideal bir yaklaşımdır.

Burada özetlenen burada böbrek tübüllerin immünostonluk birleştiren bir solvent tabanlı yöntemdir; ucuz, toksik olmayan ve kullanıma hazır kimyasal etil sinamat (ECI) ile optik temizleme; ve tam tübül görselleştirme ve quantification sağlayan Konfokal mikroskobik görüntüleme. Bu yöntem basittir, antijen-alma böbrek dilimleri ticari antikorların boyama ile birleştirir ve en laboratuvarları için erişilebilir kılan özel ekipman gerektirmez.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Not: Burada açıklanan tüm deneysel prosedürler, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi, Portland, Oregon, ABD ve Almanya 'nın Aachen kentinde ilgili yerel makamların kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır.

1. retrograd abdominal aort perfüzyon ve fare böbrekleri Fikrasyonu

  1. Çözümleri aynı gün veya akşam önce hazırlayın ve bir gecede bir buzdolabında saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığına (RT) sıcak çözümler.
  2. 1x fosfat-tamponlu tuz (PBS) içinde% 3 paraformaldehit (PFA) taze bir toplu olun. Yaklaşık 50-100 mL PFA fare başına gereklidir.
    1. % 3 PFA 1 L yapmak için: PFA 30 g tartım ve duman kaputu damıtılmış su 800 mL ekleyin. 50-60 °C ' ye kadar karıştırın ve ısıtın. 70 °C ' nin üstünde ısınmayın.
      DIKKAT: PFA zehirli. PFA 'yı duman kaputunda hazırlayın.
    2. Yavaşça 2N NaOH birkaç damla ekleyin. PFA çözüme gider veya birkaç damla daha eklemek kadar birkaç dakika bekleyin. Bazı küçük parçalar çözülür olmaz.
    3. Solüsyonu ısıdan çıkarın. 50 mL 20X PBS ekleyin. RT buz üzerinde Chill.
    4. HCl ile f 7.3-7.4 ayarlayın. 1 L 'ye damıtılmış su ekleyin.
    5. 0,22 μm filtreli 1x PBS ve% 3 PFA filtreleme yaparak çözülmemiş parçacıkları çıkarın.
  3. 1 L 1x PBS için heparin 1.000 birimleri ekleyin. 1x PBS 'de heparin ve% 3 PFA içeren 1x PBS 'yi ayrı 50 mL Plastik şırıngalar halinde aktarın.
    Not: Varsa, basınç kontrollü pompa 80-100 mmHg veya hidrostatik basınç (damla yöntemi, perfüzyon çözümleri yüksekliği: 160-200 cm hayvan) böbrek perfüzyon için kullanılabilir ayarlayın.
  4. PBS, PFA ve körelmiş 21 G kelebek iğne üç yönlü stopcock bağlayın. Tüm sistemde hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
  5. 15 mL konik tüpü etiketleyin ve 10 mL PFA 'yı içine yerleştirin.
  6. Derin anestezi bir erkek veya kadın C57BL/6 fare 12-24 kullanarak yaş 120 mg/kg vücut ağırlığı ketamin ve 16 mg/kg vücut ağırlığı xylazine. Hayvan cerrahiye geçmeden önce refleksleri pinching tarafından yanıt tam yokluğunda kontrol edilmelidir (örneğin, ayak tutam refleks).
  7. Hayvan anestezi bir cerrahi düzlem ulaştı sonra, onun arkasına diseksiyon mikroskop altında yerleştirin. Cerrahi bir makas kullanarak orta hat abdominal kesi ile karın açmak ve abdominal aorta maruz.
  8. Karın aortunu, eğri bir hemostat ile iliak arter için dallanma hemen yukarıda kelepçe. Sonra bir mikro serrafine ile böbrek arterlerin hemen altında abdominal aort kelepçe. Vannas makas ile iki kelepçeler arasında abdominal aort üzerinde küçük bir kesi (1 mm) olun. Kelebeği iğnesini yavaşça kesi içine takın ve abdominal aort açık olarak yırtmamaya dikkat edin.
  9. Bir 5-0 ipek sütür ile sağ böbrek arter ligate ve perfüzyon ve fiksasyon için sadece bir böbrek gerekirse diğer analiz için sağ böbrek çıkarın.
  10. Mikro serrafine çıkarın, Vannas makas ile portal ven Transect ve hemen heparin içeren PBS 50 ml ile serpmek, sonra geçiş ve% 3 PFA 50 ml ile serpmek.
    Not: Abdominal aort ile yüksek perfüzyon basıncı, doku yoluyla daha iyi antikor difüzyon için böbrek tübülleri açmak için gereklidir. Kalp yoluyla perfüzyon böbrek tübülleri açmayabilir.
  11. Özenle perfüze böbrek toplayın ve delme veya doku sıkılması kaçının.
  12. Kapsülü çıkarın ve böbreği 1 mm kalınlığında koronal dilimlere keser. Dilim kalınlığını standartlaştırmak etmek için bir dilimleyici matrisini (malzeme tablosu) kullanın.
    Not: Alternatif olarak, bir vibratome kullanmayı düşünebilirsiniz.
  13. Yazılı 15 mL konik tüpte hazırlanan PFA ile böbrek dilimlerini batırın.
  14. 10 mL PFA 'yı başka bir etiketli 15 mL Konik Tüpe dağıtın. Sonraki fare geçmeden önce PBS ile üç yönlü stopkoku ve kelebek iğne Flush.
  15. RT 'de gün ışığına karşı korunan bir gece sonrası sabitleme gerçekleştirin.

2. doku hazırlama ve Immünostasyon

  1. Post-fiks sonra, iki kez 1x yıkama tampon (malzeme tablosu) ile 1 saat RT yatay rocker üzerinde böbrek dilimi yıkayın.
  2. Antigen alma gerçekleştirin. 500 mL 'lik, 92-98 °C ' ye kadar 300 mL 1x antijeni maskeleme çözeltisi (TAble malzeme) ısı. 92-98 °C ' de 1 h için karıştırma ile ısıtılan tampona geçirgen kaset katıştırma dilimi içine alın. Isı kabı çıkarın ve RT serin bırakın.
    Not: Bazı satıcılar bağışıklık Histokimya uygulaması için antikorlarını test eder ve veri sayfasında önerilen bir antijen alma yöntemini içerir. Bu nedenle, bazı epitopları daha temel bir tampon gerektirebilir (örn., pH 9).
  3. Dilimi, 0,1% Triton X-100 ve kaya olarak bir gecede RT 'de 10 mL 1x yıkama tamponu içine aktarın. dilimlerini 2x ile 10 mL taze 1x yıkama tamponunu ertesi gün 1 saat yıkayın.
  4. Normal antikor seyreltici (malzeme tablosu) 500 μL 'de primer antikor seyreltilebilir. 1:50-1:100 bir konsantrasyon ile başlayın. 37 °C ' de 4 d için seyreltilmiş primer antikor içinde böbrek dilimini yavaşça kaya.
    Not: Her antikor benzersiz özelliklere sahip olduğundan, antikor inkübasyon sırasında sıcaklık ve antikor dilüsyonları bireysel prob için optimize edilmesi gerekir. İkincil antikor sadece kontroller için, primer antikor olmadan seyreltilme böbrek dokusu inkübe. Ticari antikor seyreltme yerine, 0,1% Triton X-100 ve% 0,01 sodyum azid ile 1x PBS kullanılabilir.
  5. 8 saat sonra bir yıkama tampon değişikliği ile RT 'de gece 10 mL 1x yıkama tamponunun içinde böbrek dilimi yıkayın.
  6. İkincil antikorları seyreltir (örn. 1:100, Alexa Fluor-konjuli ikincil antikorlar için), 500 μL 'de normal antikor seyreltici. 37 °C ' de 4 gün boyunca seyreltilmiş sekonder antikor içinde böbrek dilimlerini kulbe etme. Bu adımda, böbrek dilimleri ışığında koruyun.
  7. 8 saat sonra bir yıkama tampon değişikliği ile RT 'de gece 10 mL 1x yıkama tamponunun içinde böbrek dilimleri yıkayın.

3. doku Temizleme

  1. Yüksek dereceli 100% etanol (malzeme tablosu) 5 ml 'ye transfer böbrek dilimi (1 saat sonra taze etanol bir değişiklik ile) yumuşak sallanan RT 2 h için. Bu adım doku dehidrasyon içindir.
    Not: Yüksek dereceli etanol sonraki adımda yüksek doku saydamlık elde etmek için gereklidir. Metanol veya tetrahidrofuran yüksek delipidation potansiyeli ile alternatif dehidrasyon reaktifler vardır.
  2. Sadece RT (2 saat sonra taze ECi bir değişiklik ile) bir gecede yumuşak sallanan ile ECi 2 mL (malzeme tablosu) böbrek dilim bırakın.
    Not: ECi 'nin donma/erime noktası 6-8 °C ' dir. Bu nedenle, örnekleri buzdolabına saklamayın. Düzgün havalandırılan bir duman kaputu içine daldırma ve giysi ve cilt ile doğrudan temas önlemek (ECi olmayan bir toksik gıda ve Ilaç Idaresi-onaylı bileşik ama güçlü bir koku vardır). Normal Eppendorf tüpler veya cam gemiler kullanın (polistiren gemiler yok).
  3. Doku saydam ecin daldırma sonra elde edilebilir ve böbrek dilimleri görüntüleme için hazır olduğunda.

4. Confocalımaging ve görüntü analizi

Not: Görüntüleme için, refraktif endeks eşleştirme çözeltisi objektif objektif ile uyumlu olduğu sürece diğer mikroskopi teknikleri kullanılabilir. Bu protokol ters bir Konfokal mikroskop kullanır.

  1. Cam alt çanak (malzeme tablosu) içine 600-1000 μL eci ekleyin.
    Not: Normal hücre kültürü yemeklerinden kaçının, çünkü ECi plastik yemekleri çözülecek bir organik çözücüdür. Benzer şekilde, ECi objektif lensler plastik parçalar/yalıtım halkaları saldırı olabilir. Uyumlu görüntüleme yemekleriyle ilgili genel bir bakış için uygun raporlara bakın30 ve kendinden Made 3-D baskılı Odalar28.
  2. Yarı saydam böbrek dilimini çanak içine aktarın. Cam alt doğru ışık basıncı uygulamak için böbrek dilimi üzerinde yuvarlak bir lamel magazini yerleştirin. Ecın sızıntısını önlemek için tabağı parafin filmi (malzeme tablosu) ile mühürleyin.
    Not: Tüm organlar veya birkaç milimetre kalınlığında doku dilimleri bir sınır gerektirebilir (diş çimento veya silikon elastomer; malzeme tablosunugörmek) numune Için bir eci-havuz yapmak için doku etrafında.
  3. Çanak mikroskop görüntüleme platformu üzerine yerleştirin.
  4. Birkaç z-yığınları alın ve dikiş gerçekleştirin. Z-Step boyutu 5 μm ile başlayın.
    Not: Çok kalın doku dilimleri veya organlarının görüntülenmesi için uzun çalışma mesafesi (> 5 mm) ve yüksek sayısal diyafram (> 0.9) hedeflerini kullanmayı düşünün. Görüntüleme sonrası, doku etanol geri aktarmak ve yıkama tampon veya PBS 0,02% sodyum azid ile saklayın.
  5. Yazılım (malzeme tablosu) ile 3-b Rendering kullanarak görüntüyü analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Böbrek 43 farklı hücre tipleri31oluşan karmaşık organlar vardır. Bu hücrelerin çoğu glomerül ve tübüller gibi büyük çok hücreli yapıları oluşturur ve fonksiyonları birbirleri ile etkileşimlere son derece bağımlıdır. Klasik 2-D histolojik teknikler, bu büyük yapıları kısmen yakalar ve bozulmamış yapıların içinde odak değişikliklerini kaçırabilir31. Bu nedenle, optik temizleme tekniklerini kullanan 3-b analizi, sağlık ve hastalıklard...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Optik temizleme teknikleri, 3-b görselleştirme ve çeşitli organlarda mikroanatomisinin ölçülmesi için geniş önem almıştır. Burada, solvent bazlı Temizleme Yöntemi (ECI) böbrek dilimleri içinde tüm tübüllerin 3-b görüntüleme için immünolabeling ile birleştirilir. Bu yöntem, basit, ucuz ve hızlı. Ancak, diğer araştırma soruları en iyi diğer temizleme protokolleri ile cevap olabilir5. Aynı zamanda solvent tabanlı yöntemlerin değişken derecelerde doku-küçülme ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

T. S. DFG Alman Araştırma Vakfı (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) ve RWTH Aachen Tıp Fakültesi (RWTH Returner programı) gelen hibe tarafından desteklenmektedir. V. G. P. Deutsche Gesellschaft kürk Nefrologie, Alexander von Humboldt Vakfı ve Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıp Araştırma Konseyi araştırma Burslar tarafından desteklenmektedir. D. H. E, Fondation LeDucq tarafından desteklenmektedir. R. K. DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) devleti ve RWTH Aachen Üniversitesi 'nde klinik araştırmalar için disiplinlerarası Merkezi (O3-11) ' den hibe tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm filterFisher Scientific09-761-112
15 mL conical tubeFisher Scientific339650
21 G butterfly needleBraunVenofix
3-way stopcockFisher ScientificK420163-4503
3D analyis softwareBitplane AGIMARIS
3D analyis softwareCellprofilerfree open-source software
5-0 silk sutureFine Science Tools18020-50
50 mL plastic syringesFisher Scientific14-817-57
Anti-BrdU monoclonal antibodyRoche11296736001
Antibody diluentDakoS0809
CD31-647BioLegend102516
Citrate-based antigen retrieval solutionVector LaboratoriesH-3300
Curved hemostatFisher Scientific13-812-14
Dako Wash BufferAgilentS3006
Dissecting microscopeMoticDSK-500
Embedding cassettesCarl RothE478.1
EthanolMerck100983
Ethyl cinnamateSigma-Aldrich112372
Flexible film/Parafilm MSigma-AldrichP7793
Goat anti-AQP2Santa Cruz Biotechnologysc-9882
Guinea pig anti-NKCC2N/AN/ADOI: 10.1681/ASN.2012040404
HClCarl RothP074.1
HeparinSagent Pharmaceuticals401-02
HemostatAgnthos312-471-140
Horizontal rockerLabnetS2035-E
Imaging dishIbidi81218
KetamineMWI Animal Health501090
Micro serrefineFine Science Tools18052-03
NaOHFisher ScientificS318-500
Operating scissorsMerit97-272
ParaformaldehydeThermo Fischer ScientificO4042-500
Rabbit anti-phoshoThr53-NCCPhosphoSolutionsp1311-53
Silicone elastomerWorld Precision Instruments Kwik-SilKWIK-SIL
Sodium azideSigma-AldrichS2002
Tissue slicerZivic InstrumentsHSRA001-1
Triton X-100Acros OrganicsAC215682500
Vannas scissorsFine Science Tools15000-00
VibratomeLancerSeries 1000
XylazineMWI Animal HealthAnaSed Inj SA (Xylazine)

Referanslar

  1. Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
  2. Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
  3. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  4. Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
  5. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  6. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  8. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  9. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  11. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  13. Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  14. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  15. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  16. Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  17. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916(2012).
  18. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  19. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  20. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650(2015).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  22. Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  25. Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
  26. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).
  27. Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
  28. Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
  29. Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
  30. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
  31. Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
  32. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355(2019).
  33. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
  34. Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
  35. Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039(2013).
  36. Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596(2019).
  37. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
  38. Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
  39. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
  40. Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
  41. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
  42. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895(2017).
  43. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  44. Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psay 149optik Temizlemet m montaj imm nolabelingb brektubuledoku Temizlemeboyutlu analiz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır