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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Kombination aus Antikörperkennzeichnung, optischer Lichtreinigung und fortschrittlicher Lichtmikroskopie ermöglicht die dreidimensionale Analyse kompletter Strukturen oder Organe. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, um die Immunkennzeichnung dicker Nierenscheiben, die optische Reinigung mit Ethyl-Cinnamat und die konfokale Bildgebung zu kombinieren, die die Visualisierung und Quantifizierung dreidimensionaler Nierenstrukturen ermöglicht.

Zusammenfassung

Optische Clearing-Techniken machen Gewebe transparent, indem der Brechungsindex in einer Probe für die nachfolgende dreidimensionale (3-D) Bildgebung ausgeglichen wird. Sie haben in allen Forschungsbereichen große Aufmerksamkeit auf das Potenzial zur Analyse mikroskopischer mehrzelliger Strukturen erhalten, die sich über makroskopische Entfernungen erstrecken. Angesichts der Tatsache, dass sich Nierentubuli, Vaskulatur, Nerven und Glomeruli in viele Richtungen ausdehnen, die bisher nur teilweise durch traditionelle zweidimensionale Techniken erfasst wurden, eröffnete die Geweberäumung auch viele neue Bereiche der Nierenforschung. Die Liste der optischen Clearing-Methoden wächst schnell, aber es bleibt schwierig für Anfänger in diesem Bereich, die beste Methode für eine bestimmte Forschungsfrage zu wählen. Hier ist eine einfache Methode, die Antikörper-Etikettierung von dicken Maus Nierenscheiben kombiniert; optische Clearing mit billigem, ungiftigem und gebrauchsfertigem chemischen Ethyl-Cinnamat; und konfokale Bildgebung. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Nieren durchsetzt und einen Antigen-Retrieval-Schritt verwendet, um die Antikörperbindung zu erhöhen, ohne spezielle Geräte zu benötigen. Seine Anwendung wird in der Bildgebung verschiedener multizellulärer Strukturen innerhalb der Niere vorgestellt, und wie man schlechte Antikörper-Penetration in Gewebe zu beheben wird behandelt. Wir diskutieren auch die potenziellen Schwierigkeiten der Bildgebung endogene Fluorophore und den Erwerb sehr großer Proben und wie sie überwunden werden können. Dieses einfache Protokoll bietet ein einfach einzurichtendes und umfassendes Werkzeug, um Gewebe in drei Dimensionen zu untersuchen.

Einleitung

Das wachsende Interesse an der Untersuchung ganzer Organe oder großer mehrzelliger Strukturen hat zur Entwicklung optischer Clearingmethoden geführt, die die Abbildung von transparentem Gewebe in drei Dimensionen beinhalten. Bis vor kurzem waren die besten Methoden zur Schätzung der Zellzahl, -länge oder des Volumens ganzer Strukturen die Stereologie oder die erschöpfende serielle Schnitte, die auf der systemischen Probenahme von Gewebe für die nachfolgende Analyse in zwei Dimensionen basiert1, 2 , 3. Diese Methoden sind jedoch zeitaufwändig und benötigen ein hohes Maß an Ausbildung und Fachwissen4. Optische Clearing-Methoden überwinden diese Probleme, indem sie den Brechungsindex in einer Probe ausdematrieren, um Gewebe transluzent für die 3D-Bildgebung5,6,7zu machen.

Es wurden mehrere optische Clearing-Methoden entwickelt, die in zwei Hauptkategorien unterteilt sind: lösemittelbasierte und wässrige Methoden. Wässrige Methoden können weiter unterteilt werden in einfaches Eintauchen8,9, Hyperhydration10,11und Hydrogel einbetten12,13. Lösemittelbasierte Methoden dehydrieren das Gewebe, entfernen Lipide und normalisieren den Brechungsindex auf einen Wert um 1,55. Einschränkungen der meisten lösungsmittelbasierten Methoden sind das Abschrecken der endogenen Fluoreszenz von häufig verwendeten Reporterproteinen wie GFP, Lösungsmitteltoxizität, die Fähigkeit, Klebstoffe aufzulösen, die in einigen Bildkammern oder Objektivlinsen verwendet werden, und die Schrumpfung von Gewebe während der Austrocknung14,15,16,17,18,19,20,21. Lösemittelbasierte Methoden sind jedoch einfach, zeitsparend und können in einer Reihe von verschiedenen Gewebetypen funktionieren.

Wässrige Methoden basieren auf dem Eintauchen des Gewebes in wässrige Lösungen, die Brechungsindizes im Bereich von 1,38-1,528,11,12,22,23,24 haben . Diese Methoden wurden entwickelt, um die emission von endogenen fluoreszierenden Reportern zu erhalten und dehydrationsinduzierte Schrumpfung zu verhindern, aber die Einschränkungen der meisten wässrigen Clearingmethoden umfassen eine längere Dauer des Protokolls, Gewebeausdehnung und Proteinmodifikation (d.h. partielle Denaturierung von Proteinen durch Harnstoff in hyperhydrierenden Protokollen wie ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS adressierte Gewebeexpansion durch die Kombination von Harnstoff mit Sorbitol, das durch Dehydrierung die Harnstoff-induzierte Gewebeexpansion ausbalanciert und die Gewebe-Ultrastruktur, wie durch Elektronenmikroskopie ausgewertet10. Die Schrumpfung oder Ausdehnung von Gewebe wirkt sich auf die absoluten Größen von Strukturen, Abstände zwischen Objekten oder die Zelldichte pro Volumen aus. So kann die Messung von Größenänderungen bei der Reinigung des Gewebes helfen, die erhaltenen Ergebnisse7,26zu interpretieren.

Im Allgemeinen besteht ein Protokoll für optisches Clearing aus mehreren Schritten, einschließlich Vorbehandlung, Permeabilisierung, Immunkennzeichnung (falls erforderlich), Brechungsindex-Matching und Bildgebung mit fortgeschrittener Lichtmikroskopie (z. B. Zweiphotonen, konfokale oder Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie). Die meisten Clearing-Ansätze wurden entwickelt, um neuronales Gewebe zu visualisieren, und neue Studien haben ihre Anwendung in anderen Organen validiert5. Dieses umfassende Tool wurde zuvor gezeigt, um eine zuverlässige und effiziente Analyse von Nierenstrukturen zu ermöglichen, einschließlich Glomeruli27,28, Immuninfiltrate28, Vaskulatur28und Tubule Segmente 29, und es ist ein idealer Ansatz, um das Verständnis der glomerulären Funktion und Tubule Umbau in Gesundheit und Krankheit zu verbessern.

Zusammengefasst ist hier eine lösungsmittelbasierte Methode, die Immunfärbung von Nierentubuli kombiniert; optische Clearing mit billigen, ungiftigen und gebrauchsfertigen chemischen Ethyl-Cinnamate (ECi); und konfokale Mikroskopie-Bildgebung, die eine vollständige Tubule-Visualisierung und Quantifizierung ermöglicht. Diese Methode ist einfach, kombiniert Antigen-Retrieval von Nierenscheiben mit Färbung von kommerziellen Antikörpern, und erfordert keine spezielle Ausrüstung, die es für die meisten Laboratorien zugänglich macht.

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Protokoll

HINWEIS: Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, USA, und den zuständigen lokalen Behörden in Aachen, Deutschland, genehmigt.

1. Retrograde Abdominalaortische Perfusion und Fixierung von Mausnieren

  1. Bereiten Sie Lösungen am selben Tag oder Abend vor und lagern Sie in einem Kühlschrank über Nacht. Warme Lösungen auf Raumtemperatur (RT) vor der Verwendung.
  2. Machen Sie eine frische Charge von 3% Paraformaldehyd (PFA) in 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Pro Maus werden ca. 50-100 ml PFA benötigt.
    1. Um 1 L von 3% PFA zu machen: Wiegen Sie 30 g PFA und fügen Sie 800 ml destilliertes Wasser in die Dunstabzugshaube. Auf 50-60 °C umrühren und erhitzen. Nicht über 70 °C erhitzen.
      VORSICHT: PFA ist giftig. Bereiten Sie PFA in der Dunstabzugshaube vor.
    2. Fügen Sie langsam mehrere Tropfen 2N NaOH hinzu. Warten Sie ein paar Minuten, bis PFA in die Lösung geht, oder fügen Sie ein paar tropfenweitere hinzu. Einige kleine Brocken lösen sich nicht auf.
    3. Entfernen Sie die Lösung von der Hitze. Fügen Sie 50 ml von 20x PBS hinzu. Chill auf Eis zu RT.
    4. Stellen Sie den pH-Wert auf 7.3-7.4 mit HCl ein. Destilliertes Wasser auf 1 L hinzufügen.
    5. Entfernen Sie alle ungelösten Partikel, indem Sie 1x PBS und 3% PFA mit 0,22 m Filter filtern.
  3. Fügen Sie 1.000 Einheiten Heparin zu 1 L von 1x PBS hinzu. 1x PBS mit Heparin und 3% PFA in 1x PBS in separate 50 ml Kunststoffspritzen geben.
    HINWEIS: Falls vorhanden, können druckgesteuerte Pumpen mit 80-100 mmHg oder hydrostatischem Druck (Tropfmethode, die Höhe der Perfusionslösungen: 160-200 cm über dem Tier) zur Nierenperfusion verwendet werden.
  4. Schließen Sie die PBS, PFA und eine abgestumpfte 21 G Schmetterlingsnadel an einen Drei-Wege-Hahn an. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im gesamten System befinden.
  5. Beschriften Sie ein 15 ml kegelförmiges Rohr und geben Sie 10 ml PFA hinein.
  6. Tief anästhesieren eine männliche oder weibliche C57BL/6 Maus 12-24 Wochen alt mit 120 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 16 mg/kg Körpergewicht Xylazin. Das Tier muss vor der Operation auf völlige Reaktionsfähigkeit überprüft werden, indem die Reflexe eingeklemmt werden (z. B. Zehen-Pinch-Reflex).
  7. Sobald das Tier eine chirurgische Anästhesieebene erreicht hat, legen Sie es auf den Rücken unter das Sezieren des Mikroskops. Öffnen Sie den Bauch mit einem Mittellinien-Bauchschnitt mit einer Operationsschere und belichten Sie die Bauchaorta.
  8. Klemmen Sie die Bauchaorta direkt über der Verzweigung zur Iliasarterie mit einem gekrümmten Hämostat. Dann klemmen Sie die Bauchaorta direkt unter den Nierenarterien mit einem Mikroserrefin. Machen Sie einen kleinen Schnitt (1 mm) auf der Bauchaorta zwischen den beiden Klemmen mit Vannas Schere. Setzen Sie die Schmetterlingsnadel langsam in den Einschnitt ein und achten Sie darauf, die Bauchaorta nicht zu reißen.
  9. Ligate die rechte Nierenarterie mit einer 5-0 Seidennaht und entfernen Sie die rechte Niere für andere Analysen, wenn nur eine Niere für Perfusion und Fixierung benötigt wird.
  10. Entfernen Sie die Mikroserrefin, transsektieren Sie die Portalvene mit der Vannasschere und durchdringen Sie sofort mit 50 ml PBS, die Heparin enthalten, und wechseln Sie sie dann mit 50 ml 3% PFA.
    HINWEIS: Hoher Perfusionsdruck durch Abdominalaorta ist erforderlich, um Renaltubuli für eine bessere Antikörperdiffusion durch Gewebe zu öffnen. Perfusion durch Herz kann nicht Nierentubuli öffnen.
  11. Sammeln Sie die durchnässte Niere sorgfältig und vermeiden Sie das Durchkreuzen oder Drücken des Gewebes.
  12. Entfernen Sie die Kapsel und schneiden Sie die Niere in 1 mm dicke koronale Scheiben. Verwenden Sie eine Slicermatrix (Materialtabelle), um die Schnittdicke zu standardisieren.
    HINWEIS: Alternativ sollten Sie ein Vibratome verwenden.
  13. Die Nierenscheiben mit dem vorbereiteten PFA in das beschriftete 15 ml konische Rohr eintauchen.
  14. 10 ml PFA in ein anderes beschriftetes 15 ml konisches Rohr geben. Spülen Sie den Drei-Wege-Hahn und die Schmetterlingsnadel mit PBS, bevor Sie zur nächsten Maus wechseln.
  15. Führen Sie die Post-Fixierung über Nacht bei RT vor Licht geschützt durch.

2. Gewebevorbereitung und Immunostainierung

  1. Nach der Nachfixierung die Nierenscheibe zweimal mit 1x Waschpuffer(Materialtabelle) für 1 h auf einer horizontalen Wippe bei RT waschen.
  2. Führen Sie Antigen-Retrieval durch. 300 ml 1x Antigen-Entlarmungslösung(T-materialfähig) in einem 500 ml Becher auf 92-98 °C erhitzen. Die Scheibe in einbettbarer Einbettkassette unter Rühren für 1 h bei 92-98 °C einschließen. Entfernen Sie das Becherglas von der Hitze und lassen Sie es zu RT abkühlen.
    HINWEIS: Einige Anbieter testen ihre Antikörper für die Anwendung der Immunhistochemie und werden eine vorgeschlagene Antigen-Abrufmethode in das Datenblatt aufnehmen. Daher können einige Epitope einen grundlegenderen Puffer erfordern (z. B. pH 9).
  3. Die Scheibe in 10 ml 1x Waschpuffer mit 0,1% Triton X-100 geben und über Nacht bei RT schaukeln. 2x mit 10 ml frischem 1x Waschpuffer für 1 h am nächsten Tag waschen.
  4. Verdünnen Sie den primären Antikörper in 500 l normales Antikörperverdünnungsmittel (Materialtabelle). Beginnen Sie mit einer Konzentration von 1:50-1:100. Die Nierenscheibe in verdünntem Primärantikörper für 4 d bei 37 °C vorsichtig schaukeln.
    HINWEIS: Da jeder Antikörper einzigartige Eigenschaften hat, müssen die Temperatur während der Antikörperinkubation und Verdünnungen von Antikörpern für einzelne Sonden optimiert werden. Für sekundäre Antikörper-only-Kontrollen, inkubieren Nierengewebe in Verdünnerohne ohne primären Antikörper. Anstelle von kommerziellem Antikörperverdünnungsmittel können 1x PBS mit 0,1% Triton X-100 und 0,01% Natriumazid verwendet werden.
  5. Waschen Sie die Nierenscheibe in 10 ml 1x Waschpuffer über Nacht bei RT mit einem Wechsel des Waschpuffers nach 8 h.
  6. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper (z. B. 1:100 für Alexa Fluorkonjugierte Sekundärantikörper) in 500 l normaler Antikörperverdünnung. Die Nierenscheiben in verdünnten Sekundärantikörpern 4 Tage lang bei 37 °C inkubieren. Von diesem Schritt an, schützen Sie die Nierenscheiben vor Licht.
  7. Waschen Sie die Nierenscheiben in 10 ml 1x Waschpuffer über Nacht bei RT mit einem Wechsel des Waschpuffers nach 8 h.

3. Gewebe-Clearing

  1. Nierenscheibe auf 5 ml hochwertiges 100% Ethanol (Materialtabelle) für 2 h bei RT mit sanftem Schaukeln (mit einer Änderung auf frisches Ethanol nach 1 h) übertragen. Dieser Schritt ist für Gewebedehydrierung.
    HINWEIS: Hochgradig Ethanol ist erforderlich, um im nächsten Schritt eine hohe Gewebetransluzenz zu erreichen. Methanol oder Tetrahydrofuran sind alternative Dehydrierungsreagenzien mit hohem Delipidationspotenzial.
  2. Nierenscheibe in 2 ml ECi (Materialtabelle) mit sanftem Schaukeln bei RT (mit einer Änderung auf frischen ECi nach 2 h) über Nacht eintauchen.
    HINWEIS: Der Gefrier-/Schmelzpunkt von ECi beträgt 6-8 °C. Bewahren Sie daher Proben nicht im Kühlschrank auf. Führen Sie das Eintauchen in eine richtig belüftete Dunstabzugshaube und vermeiden Sie direkten Kontakt mit Kleidung und Haut (ECi ist eine ungiftige, von der Food and Drug Administration zugelassene Verbindung, hat aber einen starken Geruch). Verwenden Sie normale Eppendorf-Rohre oder Glasgefäße (keine Polystyrolgefäße).
  3. Die Gewebetransluzenz kann nach dem ECi-Eintauchen und wenn die Nierenscheiben für die Bildgebung bereit sind, erreicht werden.

4. KonfokaleImaging- und Bildanalyse

HINWEIS: Für die Bildgebung können andere Mikroskopietechniken eingesetzt werden, solange die Refractive Index Matching-Lösung mit der Objektivlinse kompatibel ist. Dieses Protokoll verwendet ein invertiertes konfokales Mikroskop.

  1. Fügen Sie 600-1.000 l ECi in die Glasbodenschale(Materialtabelle ).
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von regulären Zellkultur-Gerichte, weil ECi ist ein organisches Lösungsmittel, das die Kunststoff-Gerichte auflösen wird. Ebenso kann ECi Kunststoffteile/Isolierringe auf Objektive angreifen. Eine Übersicht über kompatible Bildgebungsgeschirre30 und selbstgefertigte 3D-Druckkammern finden Sie in den entsprechenden Berichten28.
  2. Die transluzente Nierenscheibe in die Schale geben. Legen Sie einen runden Deckelaufstrich auf die Nierenscheibe, um leichten Druck auf den Glasboden auszuüben. Versiegeln Sie die Schale mit Paraffinfolie (Tabelleder Materialien), um Leckagen von ECi zu vermeiden.
    HINWEIS: Ganze Organe oder mehrere Millimeter dicke Gewebescheiben können einen Rand (Dentalzement oder Silikonelastomer; siehe Tabelle derMaterialien) um das Gewebe erfordern, um einen ECi-Pool für die Probe zu bilden.
  3. Legen Sie die Schale auf die Mikroskop-Bildplattform.
  4. Nehmen Sie mehrere Z-Stacks und führen Sie Nähte durch. Beginnen Sie mit einer Z-Schritt-Größe von 5 m.
    HINWEIS: Erwägen Sie die Verwendung von Zielen mit langer Arbeitsdistanz (>5 mm) und hoher numerischer Blende (>0,9) für die Abbildung sehr dicker Gewebescheiben oder Organe. Nach der Bildgebung das Gewebe wieder in Ethanol übertragen und im Waschpuffer oder PBS mit 0,02% Natriumazid lagern.
  5. Analysieren Sie das Bild mit 3D-Rendering mit Software (Tabelle der Materialien).

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Ergebnisse

Nieren sind komplexe Organe, die aus 43 verschiedenen Zelltypen31bestehen. Die meisten dieser Zellen bilden große mehrzellige Strukturen wie Glomeruli und Tubuli, und ihre Funktion ist in hohem Maße von Wechselwirkungen miteinander abhängig. Klassische 2-D-Histologische Techniken erfassen diese großen Strukturen teilweise und können fokale Veränderungen innerhalb intakter Strukturen vermissen31. So hilft die 3-D-Analyse mit optischen Clearing-Techniken zu verstehen, w...

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Diskussion

Optische Clearing-Techniken haben große Aufmerksamkeit für die 3-D-Visualisierung und Quantifizierung der Mikroanatomie in verschiedenen Organen erhalten. Hier wurde die lösungsmittelbasierte Clearing-Methode (ECi) mit der Immunolabelierung zur 3-D-Bildgebung ganzer Tubuli in Nierenscheiben kombiniert. Diese Methode ist einfach, kostengünstig und schnell. Andere Forschungsfragen können jedoch am besten mit anderen Clearingprotokollen beantwortet werden5. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

T. S. wird durch Stipendien der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG (332853055), der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) und der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen (RWTH Returner Program) unterstützt. Unterstützt wird V. G. P. durch Forschungsstipendien der Deutschen Gesellschaft fur Nephrologie, der Alexander von Humboldt-Stiftung und des National Health and Medical Research Council of Australia. D. H. E wird von der Fondation LeDucq unterstützt. Gefördert wird R. K. durch Stipendien der DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), des Landes Nordrhein-Westfalen (MIWF-NRW) und des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung der RWTH Aachen (O3-11).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm filterFisher Scientific09-761-112
15 mL conical tubeFisher Scientific339650
21 G butterfly needleBraunVenofix
3-way stopcockFisher ScientificK420163-4503
3D analyis softwareBitplane AGIMARIS
3D analyis softwareCellprofilerfree open-source software
5-0 silk sutureFine Science Tools18020-50
50 mL plastic syringesFisher Scientific14-817-57
Anti-BrdU monoclonal antibodyRoche11296736001
Antibody diluentDakoS0809
CD31-647BioLegend102516
Citrate-based antigen retrieval solutionVector LaboratoriesH-3300
Curved hemostatFisher Scientific13-812-14
Dako Wash BufferAgilentS3006
Dissecting microscopeMoticDSK-500
Embedding cassettesCarl RothE478.1
EthanolMerck100983
Ethyl cinnamateSigma-Aldrich112372
Flexible film/Parafilm MSigma-AldrichP7793
Goat anti-AQP2Santa Cruz Biotechnologysc-9882
Guinea pig anti-NKCC2N/AN/ADOI: 10.1681/ASN.2012040404
HClCarl RothP074.1
HeparinSagent Pharmaceuticals401-02
HemostatAgnthos312-471-140
Horizontal rockerLabnetS2035-E
Imaging dishIbidi81218
KetamineMWI Animal Health501090
Micro serrefineFine Science Tools18052-03
NaOHFisher ScientificS318-500
Operating scissorsMerit97-272
ParaformaldehydeThermo Fischer ScientificO4042-500
Rabbit anti-phoshoThr53-NCCPhosphoSolutionsp1311-53
Silicone elastomerWorld Precision Instruments Kwik-SilKWIK-SIL
Sodium azideSigma-AldrichS2002
Tissue slicerZivic InstrumentsHSRA001-1
Triton X-100Acros OrganicsAC215682500
Vannas scissorsFine Science Tools15000-00
VibratomeLancerSeries 1000
XylazineMWI Animal HealthAnaSed Inj SA (Xylazine)

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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