SerbestÇe Hareket Eden Farelerde Çift Alan Yüksek Yoğunluklu Kayıt için Kurtarılabilir Opto-Silikon Prob ve Tetrode ile Hibrid Microdrive Sistemi

Özet

Bu protokol, serbestçe hareket eden farelerde iki beyin bölgesinde dokuz bağımsız olarak ayarlanabilir tetrode ve bir ayarlanabilir opto-silikon probu implantasyonu sağlayan bir hibrid microdrive dizisinin yapımını açıklar. Ayrıca güvenli bir şekilde kurtarma ve birden fazla amaç için opto-silikon probu yeniden kullanmak için bir yöntemdir gösterilmiştir.

Özet

Çok bölgesel nöral kayıtlar, birden fazla beyin bölgesi arasındaki ince zaman ölçeğietkileşimlerini anlamak için önemli bilgiler sağlayabilir. Ancak, geleneksel mikrosürücü tasarımları genellikle tek veya birden fazla bölgeden kaydetmek için tek bir elektrot türünün kullanılmasına izin vererek tek birimli veya derinlikprofil kayıtlarının verimini sınırlar. Ayrıca genellikle yol ve / veya hücre tipi belirli aktivite hedef optogenetik araçları ile elektrot kayıtları birleştirmek için yeteneği sınırlar. Burada sunulan serbestçe hareket eden fareler için bir hibrid microdrive dizi verim ve üretim ve microdrive dizi yeniden bir açıklama optimize etmektir. Mevcut tasarım dokuz tetrodes ve serbestçe hareket eden fareler de aynı anda iki farklı beyin alanlarına implante bir opto-silikon prob kullanır. Tetrodes ve opto-silikon prob bağımsız birim ve salınım faaliyetlerinin verimi maksimize etmek için beyinde dorsoventral eksen boyunca ayarlanabilir. Bu mikrosürücü dizisi aynı zamanda uzun menzilli nöral devrelerin bölgesel veya hücre tipine özgü tepkilerini ve işlevlerini araştırmak için optogenetik manipülasyona aracılık eden ışık için bir kurulum da içerir. Buna ek olarak, opto-silikon prob güvenli bir şekilde kurtarılabilir ve her deneyden sonra yeniden kullanılabilir. Microdrive dizisi 3D baskılı parçalardan oluştuğundan, mikro sürücülerin tasarımı çeşitli ayarları barındıracak şekilde kolayca değiştirilebilir. İlk açıklanan mikrosürücü dizisinin tasarımı ve optogenetik deneyler için bir silikon prob optik fiber eklemek için nasıl, tetrode demeti ve bir fare beynine dizi implantasyonu imalatı izledi. Optogenetik stimülasyonla birlikte yerel alan potansiyellerinin ve birim spikingin kaydedilmesi, serbestçe hareket eden farelerde mikrosürücü dizi sisteminin fizibilitesini de göstermektedir.

Giriş

Farklı beyin bölgelerinin birbirleriyle nasıl dinamik olarak etkileşime girebildiğini araştırarak, nöronal aktivitenin öğrenme ve hafıza gibi bilişsel süreci nasıl desteklediğini anlamak çok önemlidir. Bilişsel görevlerin altında yatan nöral aktivitedinamiklerini açıklamak için, büyük ölçekli hücre dışı elektrofizyoloji mikrosürücü^dizileri1 ,^2,3yardımı ile serbestçe hareket eden hayvanlarda yapılmıştır^{, 4 .} Son yirmi yılda, mikrosürücü dizi çeşitli fareler için birden fazla beyin bölgelerine elektrotlar implant geliştirilmiştir^5,6,7,8 ve fareler^{9, 10.000 , 11.11.20 , 12}. Bununla birlikte, mevcut mikrosürücü tasarımları genellikle birden fazla prob türünün kullanımına izin vermez, araştırmacıları belirli yararları ve sınırlamaları olan tek bir elektrot türünü seçmeye zorlar. Örneğin, tetrode dizileri dorsal hipokampus CA1^gibiyoğun nüfuslu beyin bölgeleri için iyi çalışır^{1 ,13}, silikon problar anatomik bağlantıları incelemek için daha iyi bir geometrik profil vermek ise^{14 , 15. yıl.}

Tetrodes ve silikon problar genellikle in vivo kronik kayıt için kullanılır, ve her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır. Tetrodes maliyet etkinliği ve mekanik sertlik ek olarak, tek elektrotlar^16,17daha iyi tek birim izolasyon önemli avantajları olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca microdrives^8,18,19,20ile kombine edildiğinde tek birim faaliyetlerinin daha yüksek verim sağlar. Nöral devrelerin işlevini anlamak için aynı anda kaydedilen nöronların sayısını artırmak esastır^21. Örneğin, zamana bağlı²² veya 23 hücreyi ödüllendirmek gibi işlevsel olarak heterojen hücre türlerinin küçük popülasyonlarını araştırmak için çok sayıda hücre gerekir. Başak dizilerinin kod çözme kalitesini artırmak için çok daha yüksek hücre numaraları gereklidir^13,24,25.

Tetrodes, ancak, mekansal olarak dağıtılmış hücreleri kayıt bir dezavantaj var, korteks veya talamus gibi. Tetrodes aksine, silikon problar mekansal dağıtım ve yerel alan potansiyelleri etkileşim sağlayabilir (LPS) ve yerel bir yapı içinde spiking faaliyetleri^14,26. Çok saplı silikon problar kayıt sitelerinin sayısını daha da artırır ve tek veya komşu yapılar arasında kayıt sağlar^27. Ancak, bu tür diziler tetrodes göre elektrot sitelerinin konumlandırma daha az esnektir. Buna ek olarak, karmaşık başak sıralama algoritmaları tetrodes^28,29,30tarafından elde edilen verileri yansıtmak için komşu kanalların eylem potansiyelleri hakkında bilgi ayıklamak için yüksek yoğunluklu problar gereklidir. Bu nedenle, tek birimlerin genel verim genellikle tetrodes daha azdır. Ayrıca, silikon problar kırılganlık ları ve yüksek maliyeti nedeniyle dezavantajlıdır. Bu nedenle, tetrodes vs silikon probların seçimi kayıt amacına bağlıdır, hangi kayıt sitelerinde tek birim veya mekansal profilleme yüksek verim elde edilmesi öncelikli olup olmadığı bir sorudur.

Nöral aktivite kayıt ek olarak, optogenetik manipülasyon belirli hücre tipleri ve / veya yolların nöral devrefonksiyonları 13^,31katkıda nasıl incelemek için nörolojidaha güçlü araçlardan biri haline gelmiştir^{, 32,33}. Ancak, optogenetik deneyler uyarım ışık kaynaklarına fiber konektör eklemek için mikrosürücü dizi tasarımı ek dikkate gerektirir^34,35,36. Genellikle, fiber optik bağlantı beyinde sonda mekanik bir kayma yol açabilir nispeten büyük bir kuvvet gerektirir. Bu nedenle, geleneksel microdrive dizileri için implante edilebilir bir optik fiber birleştirmek için önemsiz bir görev değildir.

Yukarıdaki nedenlerden dolayı, araştırmacıların elektrot türünü optimize etmesi veya kaydın amacına bağlı olarak optik fiber yerleştirmeleri gerekmektedir. Örneğin tetrodes hipokampus daha yüksek birim verim elde etmek için kullanılır^1,13, silikon problar kortikal alanların laminar derinlik profilini araştırmak için kullanılır, medial entorinal korteks gibi (MEC)³⁷. Şu anda, tetrodes ve silikon probların eşzamanlı implantasyonu için mikrosürücüler sıçanlar için bildirilmişti^5,11. Ancak, mikrosürücülerin ağırlığı, fare başında sınırlı alan ve farklı problar istihdam etmek için mikrosürücünün tasarımı için mekansal gereksinimler nedeniyle farelere birden fazla tetrode ve silikon prob yerleştirmek son derece zordur. Bir mikrosürücü olmadan silikon problar implant mümkün olmasına rağmen, Bu prosedür prob ayarı için izin vermez ve silikon-prob kurtarma başarı oranını düşürür^12,38. Ayrıca, optogenetik deneyler microdrive dizi tasarımı ek hususlar gerektirir. Bu protokol, serbestçe hareket eden farelerde kronik kayıt için bir mikrosürücü dizisinin nasıl inşa edilip yerleştirilebildiğini göstermektedir, bu da dokuz bağımsız olarak ayarlanabilir tetrode ve bir ayarlanabilir opto-silikon probun implantasyonuna olanak sağlar. Bu mikrosürücü dizisi aynı zamanda optogenetik deneyleri ve silikon sondanın kurtarılmasını da kolaylaştırır.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler Texas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Mikrosürücü dizi parçalarının hazırlıkları

1. Mikrosürücü dizi parçalarını diş modeli reizini kullanarak 3D yazıcı kullanarak yazdırın (Şekil1A,B). Yazdırılan parçalardaki küçük delikleri açık ve uygulanabilir tutmak için tek tek 3B yazdırılan katmanların kalınlığının 50 μm'den az olduğundan emin olun.
   NOT: Mikrosürücü dizisi beş bölümden oluşur (Şekil1C):(1) tetrodes için dokuz mikrosürücü vidası ve bir silikon prob için bir vida içeren mikrosürücü dizisinin ana gövdesi (Şekil1Ca-d). Alttaki opto-silikon probu için tetrode demeti ve deliğin koordinasyonu hedef beyin bölgesinin koordinatlarına bağlıdır (Şekil 1Cd); (2) bir silikon prob veya optrode takmak için bir mekik (Şekil 1Ce); (3) silikon prob konektörü tutmak için bir prob elektrik konektörü montaj (Şekil 1Cf); (4) bir optik fiber konektör takılı / fişi zaman implante opto-silikon probu istenmeyen hareketlerini önlemek için vücudun orta kısmına kelepçeler bir fiber ferrule tutucu (Şekil1Cg); ve (5) kararlı kayıt için mikrosürücü dizisine fiziksel ve elektrik kalkanı sağlayan bir kalkan konisi (Şekil 1Ch). Mikrosürücü dizisinin toplam ağırlığı 5,9 g olup, kalkan konisi de dahil olmak üzere (Tablo1). Baskılı parçalarda delikler tıkanmışsa, delikleri matkap uçları kullanarak delin: iç delikler için #76 ve tetrode-mikrodrive vidalar için dış delikler için #68, tetrode mikrosürücü vidalı destekçi deliği için #71 ve alttaki kılavuz direkleri için delikler için #77 vücut.
2. Kılavuz gönderilerinin microdrive dizi gövdesine yerleştirilmesi.
   1. 26-Ga paslanmaz çelik tel iki 16 mm uzunlukları kesin. Döner öğütücü kullanarak tel uçlarını hafifçe keskinleştirin.
   2. Telleri gövdenin alt deliklerine yerleştirin(Şekil 2A). Kılavuz mesajları güvenli vücudun alt kısmında siyanoakrilat tutkal küçük bir miktar uygulayın.

2. Opto-silikon probu hazırlama

1. Mikro sürücü vidasını silikon sonda için hazırlayın.
   NOT: Silikon prob için mikrosürücü vidası özel bir vida (300 μm pitch), bir destek tüpü destekleyen ve L şeklinde bir tüp (Şekil2B)oluşur.
   1. Kalıbı mikrosürücü kafası için hazırlayın (Şekil2C). Kalıbı oluşturmak için, mikrosürücünün 3D baskılı plastik deseni hazırlayın (Şekil2Ca). Sonra, desen etrafında bantlar koyarak bir temporal duvar yaptıktan sonra sıvı silikon jel dökün. Hafifçe sallayarak hava kabarcıkları çıkarın, tedavi olana kadar bekleyin, sonra desen silikon jel kalıp kaldırmak (Şekil2Cb).
   2. Döner öğütücü kullanarak 18 mm ve 9,5 mm uzunluğunda 23 G paslanmaz tel kesin. Diş akrilik yapışmasını artırmak için bir döner öğütücü ile tellerin üst 2-3 mm pürüzlü.
   3. Bir özel vida alın ve diş akrilik ile sürtünmeazaltmak için silikon yağı küçük miktarda uygulayın. Telleri ve özel vidayı kalıba ayarlayın.
   4. Teller ve vidalar etrafında hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için bir şırınga kullanarak kalıp içine diş akrilik dökün. Hava kabarcığı kirlenmesi mikrosürücüyü kırılgan hale getirecektir. Diş akrilik tamamen tedavi olana kadar bekleyin, sonra kalıp mikrosürücü vidaları çıkarmak. 6 mm'lik uzun tel ucunu, persleri kullanarak 60° açıya bükün.
   5. Vidayı döndürmek için mikrosürücü vidalarının (örn. çatlaklar, hava kabarcıkları ve sürtünme) kalitesini kontrol edin. Yüksek sürtünme varsa, onlar microdrive vida ile çiftler özelleştirilmiş bir sürücü ucu ile bir elektrikli vida lı sürücü kullanarak pürüzsüz hale gelene kadar vida döndürün.
   6. Mikrosürücü vidasını microdrive dizi gövdesine tutarak vidayı ters çevirip hareket etmediğini kontrol edin. Vidanın iplikleri, vida nın gövde deliğine takılması otomatik olarak oluşturulur.
2. Mekiği hazırlayın (Şekil 3Aa).
   1. Keskin makas kullanarak iki 5 mm uzunlukta polyetheretherketone (PEEK) borusu kesin. Tüpleri mekiğin her iki tarafına hizalayın. Tutkal tüpler ve mekik epoksi kullanarak.
   2. Kılavuz gönderilere az miktarda silikon yağı uygulayın. Microdrive dizi gövdesinin kılavuz direklerine ekleyerek mekiğin kalitesini kontrol edin. Mekiğin aşırı sürtünme olmadan sorunsuz hareket edin.
3. Bir optorode(Şekil 3Ab)hazırlayın. Optogenetik deney gerekli değilse bu adım atlanabilir.
   1. Bir yakut kesici kullanarak optik fiberi 21 mm uzunluğa kadar ayırın. Ucu düz ve parlak yapmak için lif ucu grind.
   2. Optik fiberi silikon sondanın ön tarafına yavaşça yerleştirin. Elyaf ucu elektrot sitelerinin üst kısmından 200-300 m yukarıda konumlandırılır. Elyafı şeffaf bantla geçici olarak tutun.
   3. Optik fiberi az miktarda epoksi kullanarak silikon sondanın tabanına yapıştırın. Epoksi tamamen iyileşene kadar en az 5 saat bekleyin.
      NOT: Optik fiberin elektrot sitelerine aynı tarafa takılması tavsiye edilir. Fiberin arka tarafa takılması ışığın kayıt alanlarını düzgün bir şekilde aydınlatmasını engelleyebilir.
4. Mekiği silikon sondasına takın (Şekil 3Ac): silikon sondanın tabanının arkasına az miktarda epoksi uygulayın. Mekiğin alt kısmını silikon sondanın tabanına takın ve epoksinin ilk kürü sırasında mekik ile silikon sonda tabanı arasında bir boşluk oluşmasını önlemek için 2-3 dakika pozisyonda yavaşça tutun. Epoksi tamamen iyileşene kadar en az 5 saat bekleyin.
5. Mekik tüplerini mikroskop altında ana gövdenin kılavuz direklerine dikkatlice yerleştirin (Şekil3B). Bu işlem sırasında, ince cımbız ile mekiğin oluğunu tutun.
6. Vidayı çevirerek mikrosürücü vidasını vida deliğine takın. L şeklindeki telin ucunu mekik kafasının oluğuna yerleştirerek silikon probu ve mikrosürücü vidasını devreye sokun (Şekil3C).
7. Prob elektrik bağlayıcısı tutucuyu mikrosürücü dizi gövdesine takın (Şekil3D).
   1. İki #0 vidayı 3,5 mm iplik uzunluğuna kadar kesin. Çapakkaldırmak için ipuçları grind.
   2. Sonda bağlayıcısı tutucuyu gövdeye yerleştirin. Silikon probu elektrik konektörünü tutucuya yerleştirin.
   3. Epoksi kullanarak tutucudaki silikon prob konektörünü sabitleyin ve silikon probun geri kazanım prosedürüne izin vermek için mikrosürücü dizi gövdesine yapıştırmamaya özen. Prob bağlayıcısı tutucuyu tutmak için vidaları takın.
8. Ferrule tutucuyu opto-silikon prob ve mikrosürücü dizi gövdesine takın (Şekil3D).
   1. 6 mm iplik uzunluğuna kadar iki #0 vida kesin. Çapakkaldırmak için ipuçları grind.
   2. Ağırlığı ve alanı azaltmak için 2,5-3,0 mm dış çapı ile küçük hex somunyapmak için iki #0 makine vida lı somundışında grind.
   3. Vidaları tutucunun A bileşenine takın. Vida başlarını epoksi kullanarak yapıştırın.
   4. Vücutla sürtünmeyi azaltmak için A ve B bileşenine az miktarda silikon gres uygulayın. Bileşen A'yı vücuda takın, sonra ters cımbız kullanarak zamansal olarak tutun.
   5. B bileşenini A bileşeninin vidalarına yerleştirin. Vidalar içine özelleştirilmiş somun iplik. Vücutta ferrule tutucu güvenli fındık sıkın pliers kullanın.
   6. Fiber ferrule'yi lif ferrule tutucunun (Bileşen B) oluğuna takın. Lif feritin tutucudan 4-5 mm dışarı çıktığından emin olun.
   7. Ferrule ve tutucu oluk arasında az miktarda epoksi uygulayın. Epoksi tamamen iyileşene kadar bekleyin ve ferrule hareket etmez kontrol edin. Mikrosürücü vidasını çevirmeden önce somunları gevşeterek mekiği ve ferrule tutucuyu kontrol edin.
   8. Sondanın çalışma mesafesini kontrol edin. Mekik tüpleri hala kılavuz direkler ile ilişkili iken ferrule-holder üst konumda olduğunda sonda ucu tamamen vücuda geri çekilir emin olun. Maksimum çalışma mesafesi silikon sondasının uzunluğu ve hedef beyin bölgesi ile belirlenir.
   9. Microdrive-vida gevşek ise, destek için daha fazla iplik eklemek için vida etrafında diş akrilik küçük miktarda uygulayın. Tedavi edildiğinde, sıkılık ve stabiliteyi kontrol etmek için vidayı döndürün.

3. Tetrode hazırlama

NOT: Bu yordam daha önce yayınlanmış makaleler⁸,^19,20,39benzer .

1. Tetrode için mikrosürücü vidaları hazırlayın. Bir tetrode için mikrosürücü özel olarak işlenmiş vida ve 23 G boru (Şekil2B)oluşur. Bu yordam bölüm 2.1 benzer.
2. Içinde 5,5 mil tel olan 30 G paslanmaz çelik boru bir paket olun. Bu durumda toplam dokuz adet 30 G boru (sekiz kayıt tetrodu ve bir referans elektrot) kullanıldı.
3. 30 G desteyi sürücü gövdesinin altından geçirin ve ana gövdeye 20 G ince duvarlı boruyla sabitleyin. Ucunu eşit yapmak ve floş yapmak için bir döner öğütücü ile paketin alt kırpın. 30 G tüpün üst kısmını döner öğütücüyle kırpın, böylece 30 G tüp ana gövdeden yaklaşık 0,5 mm dışarı çıkar.
4. 30 G boru içine 5,5 mil poliimid yalıtım tüpleri yükleyin. Tetrode telleri hazırlayın ve 32 kanallı bir elektrik arayüz kartına (EIB) yükleyin. Son hassas kesimden önce empedans test edenle elektrik bağlantısını kontrol edin.
5. Alt elektrot ucu empedansı altın kaplama çözeltisi ile 250-350 kΩ'ye kadar dır. Superglue ile tüm tetrodes düzeltin.
6. Sızdırmazlık ve yağlama için poliimid tüp ve tetrode ile mineral yağ arasındaki aşırı boşluğu doldurun. Yer kablosunu AyB'ye yönlendirin.
   NOT: Gerekirse optik fiber tetrode teller ilerler¹²ile entegre edilebilir.

4. Kalkan konisinin takılması

1. Baskılı koninin iç üzerine gümüş iletken kalkan boyası boyayın. Mikrosürücü dizisini koninin içine yerleştirin (Şekil3E).
2. İki #0 vidayı 3,5 mm iplik uzunluğuna kadar kesin. Mikrosürücü dizisini yerinde tutmak için vidaları koninin dışından sabitle.
3. Elektrikli elektrik zemin ile kalkan koni bağlamak için vida başının etrafında gümüş boya uygulayın. Zemin teli ve koni arasındaki elektrik bağlantısını kontrol edin. Güvenli bir şekilde vücut eklemek için microdrive dizi gövdesi ve koruma konisi arasında epoksi küçük bir miktar uygulayın.
   NOT: Kalkan konisini hazırlamanın bir diğer yolu da alüminyum bant⁴⁰ (Şekil3F)kullanmaktır. İlk olarak, alüminyum folyoyu kağıda yapıştırdıktan sonra kalkan koni için desen kağıdını hazırlayın (Şekil3Fa). Sonra, kağıt rulo ve siyanoakrilat tutkal küçük bir miktar kullanarak microdrive gövdeye takın (Şekil3Fb). Bu koninin ağırlığı 0,72 g'dır ve mikrosürücü dizisinin toplam ağırlığı4,7 g'a düşürülür (Tablo 1).

5. İmplant cerrahisi

NOT: Bu yordam, çift alan implantasyonu için daha önce yayınlanmış^18,39,41 makalelerinden değiştirilmiştir. Ameliyat sonrası daha hızlı iyileşme için mikrosürücü implantı için hayvanın ağırlığının 25 g'ın üzerinde olduğundan emin olun.

1. Hazırlık
   1. Bir zemin vida hazırlamak için, bir kafatası vida için gümüş tel takın ve gümüş boya uygulayın. Daha sonra, gümüş boya kullanarak telin karşı tarafına altın bir iğne takın.
   2. Microdrive dizisini stereotaktik bir aygıtta tutmak için sürücü tutma adaptörlerini hazırlayın. Epoksi kullanarak paslanmaz bir kolu bir erkek konektör takın. Konektörün ve paslanmaz tutamacın hizalanmasının düz olduğundan emin olun.
   3. Kayıt tan sonra histolojik doğrulamanın gerekli olması durumunda, silikon probu^38'intetrodelerine veya arka tarafına Di-I uygulayın.
   4. Silikon probu istenilen derinlikte aşağı indirin. Ferrule tutucunun somunlarını çerçeveler kullanarak gevşetin, silikon probun mikrosürücü vidasını çevirerek silikon probu (opto-silikon probu) düşürün, sonra ferrule tutucuyu sabitlemek için somunları sabitlayın. Hipokampal alan CA1'e tetrode ve MEC'de silikon sonda yerleştirirken, tetrode kanül ile silikon sondanın ucu arasındaki mesafe 3-4 mm'dir.
2. Stereotaksik bir cihazda anestezili fareyi (%0,8-%1,5 izofluran) ayarlayın. Farenin anestezik durumu ayak-çimdik refleks yokluğu ile doğrulanır. Kurumasını önlemek için gözlere açık merhem uygulayın. Güçlü cerrahi ışığa maruz kalmaktan korumak için gözleri bir folyo parçası ile kaplayın.
3. Kürk tıraş sonra iyot ve izopropanol ile farenin kafa derisi dezenfekte. Standart cerrahi makas kullanarak kafa derisinde 1,5-2,0 cm'lik bir kesi yapın ve lidokain uyguladıktan sonra pamuklu bezler kullanarak kafatası üzerindeki dokuyu çıkarın.
4. Fare kafasını stereotaksik araçla hizala. Bregma ve lambda arasındaki yükseklik farkının 100 μm'den az olduğundan emin olun. Bir atlas kullanarak kraniyotomi yerini belirleyin ve sterilize bir kalem ile bu yerleri işaretleyin.
5. Kafatası vidalarını (0,8 mm çap, 0,200 mm iplik perdesi) kafatasıüzerinde 1,5 dönüş (0,3 mm) döndürerek, 0,5 mm matkap ucu kullanarak kafatasında 8-11 delik açtıktan sonra cerrahi cımbız ve tornavida kullanarak sabitleyin.
   NOT: Frontal kafatasında 2-4 delik, parietal kafatasının her iki tarafında 2-3 delik ve interparietal kafatasında 1-2 delik önerilmektedir.
6. Zemin vidasını interparietal kemikte bir delik açtıktan sonra bir dönüş (0,2 mm) döndürerek deliğe takın. Bu deliğin kemikten beyin kasasına girmediğinden emin olun; aksi takdirde, serebellar sinyalleri kayıt kontamine olacaktır. Empedans, empedans ölçer kullanarak zemin vidası ile kafatası vidaları arasında 1 kHz'de 20 kΩ'den daha az olup olmadığını kontrol edin.
   NOT: Daha büyük empedans kayıt sırasında hareket yapıtlarının tanıtılmasına neden olur.
7. İşaretli yerlerde kraniyotomi yapın. Dura farelerde bozulmadan bırakılabilir.
8. Zemin vidasının erkek pimini ve mikrosürücü dizisinin yer konektörünü bağlayın. Zemin vida ve koruma arasında ölçerek empedans metre kullanarak bağlantı kontrol edin.
9. Mikrosürücü dizisini bağdaştırıcıya ayarlayın, stereotaksik aygıta ayarlayın ve silikon probu istenilen derinliğe kadar yavaşça indirin. Silikon sonda sıyrık beyne takıldığında tetrode demetlerinin beyin yüzeyinin üzerine, ancak yine de mikrosürücü dizisinin içine yerleştirildiğinden emin olun (Şekil4A).
10. Silikon probun alanını ve tetrode demeti (Şekil4B)için silikon yağı dikkatlice uygulayın. 20 G iğnenin ucuna silikon yağıküçük bir miktar koyun ve iğne yi kullanarak probların etrafına yağ uygulayın. Silikon gres, diş akrilik elektrotlar / problar üzerine veya altında akmayacak şekilde prob çevresindeki alanı tamamen kaplayana kadar tekrarlayın. Gres elektrot siteleri dokunmak izin vermemeye dikkat edin, aksi takdirde önemli ölçüde kayıt sitelerinin empedans artacaktır.
11. Kafatasında demirleme vidaları için microdrive dizi düzeltmek için diş akrilik uygulayın.
    NOT: Bu akrilik kür sırasında üretilen aşırı ısı önlemek için üç katmanda diş akrilik uygulanması tavsiye edilir.
12. Adaptörü mikrosürücü dizisinden dikkatle çıkarın. Dehidratasyonu önlemek için 1 mL PBS deri altı enjekte edin. Analjezik tedavi olarak 5 mg/kg meloksikam deri altı enjekte edin.
13. Silikon probu konektörünü, elektrik bağlantılarının içine herhangi bir kir girmesini önlemek için bir bant parçası ile kapatın. Plastik bir parafin filmi kullanarak mikrosürücü dizisini kapatın ve yerine bantlayın.
14. Uygun analjezik tedaviyi 3 gün boyunca uygulayın (örn. günde bir kez 2 mg/kg meloksikam deri altı enjeksiyonları). Tetrode ayarı başlamadan önce kurtarma için 3-5 gün bekleyin. Kurtarma döneminden sonra implante edilen fare Şekil 4C'degösterilmiştir.

6. Silikon probukurtarma (Şekil 4D)

1. Ketamin (75 mg/kg) ve deksmetandonmidin (1 mg/kg) anestezikleri intraperitoneal olarak enjekte edin ve ayak ucurrefleksinin yokluğu doğrulanmadı. Bir başlık kullanarak kalp üzerinden% 4 paraformaldehit doğrudan perfüzyon tarafından anestezili fare düzeltin. Kemirgenler için cerrahi yöntemler daha önce^{açıklanan 42}.
2. Bir plier kullanarak ferrule tutucunun somunlarını gevşetin. Daha sonra, silikon probu tamamen microdrive dizi gövdesinin içine doğru geri çekmek için ayar vidası çevirerek dikkatle vücudun üst kısmında hareket ettirin. Sondayı en üst konumda tutmak için somunları sabitle.
3. Fare beynini yandan kafatasını kırarak alttan çıkar. Mikrosürücü dizisi artık hayvandan ayrıldı.
4. Silikon probu yönlendiren L şeklindeki mikro sürücü vidasını tamamen çıkarın. Gevşetin ve ferrule tutucunun somunlarını pliers kullanarak çıkar. Ferrule tutucunun A bileşenini çıkar.
5. Prob konektör yuvasını sökün ve sürücü gövdesinden ayırın. Prob konektör yuvasının mikrosürücü dizi gövdesinden çıkıp çıkamayabileceğini kontrol edin.
6. Mekiğin üst kısmını cımbızla tutun, ardından silikon sonda tertibatını mikrosürücü dizisinden dikkatlice dışarı doğru kaydırın.
7. Prob ucunu kontakt lens temizleyicisiyle (önce enzimle, sonra %3 hidrojen peroksitle) en az 1 gün boyunca temizleyin. Mikroskop altında isopropanol pedleri kullanarak elektrot ucunu dikkatlice silin. Sondayı statik olmayan bir depolama kutusunda tutun.
   NOT: Mekik ve prob konektörü yuvası silikon probuna bağlı kalır ve bir sonraki implantasyonda yeniden kullanılabilir.
   NOT: Bazı silikon problar hidrojen peroksit ile tolere edilemez. Bu durumda, sadece proteolitik enzim içeren kontakt lens çözeltisini kullanın.
8. Bir sonraki ameliyat için microdrive dizi vücut yeniden kullanmak için, ince uçlu matkaplar ve nippers bir arada kullanarak diş akrilik kaldırın. Sonra, aseton içine kaldırılan diş akrilik batırarak kafatası vidaları kurtarmak. Asetonun mikrosürücü dizisinin plastik kısımlarını eriteceğini unutmayın.
9. Bir neşter kullanarak mikrosürücü gövdesi ve koruma konisi arasındaki epoksi çıkarın.
   NOT: Mikrosürücü kırılmamışsa, bir sonraki ameliyat için ek parça basılması gerekmez.

Sonuçlar

Microdrive dizisi 5 gün içinde inşa edildi. Mikrosürücü hazırlama zaman çizelgesi Tablo2'de açıklanmıştır. Bu mikrosürücü kullanılarak, dokuz tetrodes ve bir silikon sonda hipokampal CA1 ve farenin MEC içine implante edildi [21 hafta eski/ 29 g vücut ağırlığı erkek pOxr1-Cre (C57BL/6 arka plan)], sırasıyla. Bu transgenik fare MEC tabaka III piramidal nöronlarda Cre ifade eder. Fareye elektrot implantından 10 hafta önce MEC'ye 200 nL AAV5-DIO-ChR2-YFP (titre: 7.7 x 10¹²

Tartışmalar

Protokol, bağımsız ayarlanabilir tetrodelar ve serbestçe davranan farelerde silikon sonda kullanarak iki beyin alanından nöral aktivitelerin kaydedilmesine olanak tanıyan melez bir mikrosürücü dizisinin nasıl inşa edilip yerleştirilecek olduğunu gösteriyor. Ayrıca optogenetik deneyler ve deneylerden sonra silikon sonda kurtarma gösterir. Ayarlanabilir silikon probu³³ veya opto-silikon probu³⁶ implantasyonu daha önce farelerde gösterilmiş olsa da, bu prot...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#00-90 screw	J.I. Morris	#00-90-1/8	EIB screws
#0-80 nut	Small Parts	B00DGB7CT2	brass nut for holding fiber ferrule holder
#0-80 screw	Small Parts	B000FMZ57G	brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone
22 Ga polyetheretherketone tubes	Small Parts	SLPT-22-24	for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter
23 Ga stainless tubing	Small Parts	HTX-23R	for tetrode
23 Ga stainless wire	Small Parts	HTX-23R-24-10	for L-shape/support wire
26 Ga stainless wire	Small Parts	GWX-0200	for guide-posts
30 Ga stainless wire	Small Parts	HTX-30R	for tetrode
3-D CAD software package	Dassault Systèmes	SolidWorks 2003
3D printer	FormLab	Form2
5.5mil polyimide insulating tubes	HPC Medical	72113900001-012
aluminum foil tape	Tyco	Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape	for the alternative shielding cone
conductive paste	YSHIELD	HSF54	for shielding cone
customized screws for silicon-probe microdrive	AMT	UNM1.25-HalfMoon	half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch
customized screws for tetrode microdrive	AMT	Yamamoto_0000-160_9mm	slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design
dental acrylic	Stoelting	51459
dental model resin	FormLab	RS-F2-DMBE-02
Dremel rotary tool	Dremel	model 800	a grinder
drill bit	Fine Science Tool	19007-05
electric interface board	Neuralynx	EIB-36-Narrow
epoxy	Devcon	GLU-735.90	5 minutes epoxy
eye ointment	Dechra	Puralube Ophthalmic Ointment	to prevent mice eyes from drying during surgery
fiber polishing sheet	Thorlabs	LFG5P	for polishing the optical fiber
fine tweezers	Protech International	15-368	for loading/recovering the silicon probe
gold pins	Neuralynx	EIB Pins Small
ground wire	A-M Systems	781500	0.010 inch bare silver wire
headstage preamp	Neuralynx	HS-36
impedance meter	BAK electronics	Model IMP-2	1 kHz testing frequency
mineral oil	ZONA	36-105	for lubricating screws and wires
optical fiber	Doric	MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT
Recording system	Neuralynx	Digital Lynx 4SX
ruby fiber scribe	Thorlabs	S90R	for cleaving the optical fiber
silicon grease	Fine Science Tool	29051-45
silicon probe	Neuronexus	A1x32-Edge-5mm-20-177	Fig. 3, 4A, 4B, 5
silicon probe	Neuronexus	A1x32-6mm-50-177	Fig. 4C
silicon probe washing solution	Alcon	AL10078844	contact lens cleaner
silicone lubber	Smooth-On	Dragon Skin 10 FAST	for preparation of microdrive mold
silver paint	GC electronic	22-023	silver print II coating, used for ground wires
skull screw	Otto Frei	2647-10AC	0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch
standard surgical scissors	ROBOZ	RS-5880
stereotaxic apparatus	Kopf	Model 942
super glue	Loctite	LOC230992	for applying to guide-posts
surgical tweezers	ROBOZ	RS-5135
Tetrode Twister	Jun Yamamoto	TT-01
tetrode wires	Sandvik	PX000004