Aplysia californica Odontofor Kaslar Için Minimal İnvaziv Lezyon Tekniği

Özet

Burada, bu kasların beslenme davranışı sırasındaki rollerini anlamak için deniz yumuşakçaaplikası kalinonik kalinonik besleyici cihaza kasların minimal invaziv cerrahi lezyoniçin bir protokol sıyoruz.

Özet

Aplysia californica öğrenme ve davranış nöral kontrolü incelemek için bir model sistemidir. Bu hayvanın yarı açık bir dolaşım sistemi vardır, bu da önemli bir hasara yol açmadan iç yapılarına erişebilmeyi mümkün kılar. Birçok manipülasyon lar hem in vivo hem de in vitro olarak kolayca yapılabilir, bu da davranış ve nöral devreanalizi için son derece kolay bir model haline getirilebilir. Besleme tutucuiçindeki kasların işlevlerini daha iyi anlamak için, hayvanın ana vücut boşluğunu açmadan veya beslenme organının dış katmanlarına (yani bukkal kütleye) zarar vermeden onları lezyonlamak için bir teknik geliştirdik. Bu teknikte, kavrayıcı kısmen everted, kas doğrudan erişim sağlayan. Bu prosedür hayvanların hızlı ve güvenilir bir şekilde iyileşmesini sağlar. Bu mümkün I7 kasları ve sub-radular liflerle lezyon için, bize her iki kas önemli ölçüde in vivo açılış katkıda göstermek için izin yaptı.

Giriş

Aplysia californica beslenme sistemi öğrenme ve bellek anlamak için bir model sistemi olarak kullanım uzun bir geçmişi vardır¹, motive davranışları^2,3, ve davranış arasındaki etkileşim, biyomekanik ve besleme sırasında nöral kontrol⁴. Bu büyük, tanımlanabilir nöronlar nispeten az sayıda, son derece erişilebilir nöral devre vardır. Hayvanın yarı açık bir dolaşım sistemi vardır, bu da önemli hasara yol açmadan iç yapılarına erişebilmeyi mümkün kılar. Aynı zamanda in vivo ve in vitro birçok manipülasyonlar için sağlam, davranış ve nöral devre analizi için son derece çekilebilir bir model yapma.

Beslenme davranışlarına yol açan nöral desenleri anlamak için, beslenme organını oluşturan yumuşak yapının altında yatan mekaniği tanımlamak önemlidir, bukkal kütle⁴. Bukkal kitle oluşturan dış kasları karakterize etmek için yapılan çalışmalar yapılmış olsa da^5,6, kavrayıcı yüzeyini kontrol bukkal kitle içinde altta yatan yapının iç kasları, odontofor, olmuştur in vivo deney için büyük ölçüde erişilemez. Bu kasların bazı fonksiyonları üzerinde in vitro çalışmalar yapılmış olmasına rağmen^7,8, Bu kaslara doğrudan erişim eksikliği zor bozulmamış rollerini incelemek için yaptı, hayvanlar gibi davranan.

Elektrot implantasyonu veya Aplyscan veya benzeri yumuşakça türlerinde lezyonlar içinen teknikleri vücut duvarı 9,^10,11,12açılmasını gerektirir. Vücut duvarının açılması epitel yaralanmasına neden olur ve kesi hemolenf inmesini önlemek için güvenli bir şekilde kapatılmalıdır. Aplysia'nın iç kaslarına ulaşmaya çalışırken (radular yüzeyin altında yatan kaslar veya odontofor içinde): ana vücut boşluğundan girerek, daha da ciddi zorluklar ortaya çıkar. iç yapılara erişmek için bukkal kütlenin kas duvarının bir kısmı (Şekil1A). Bu birikmiş yaralanma ve erişim zorluğu geleneksel yollarla yaklaşımı sorunlu hale getirmiştir, çünkü hayvanlar bu ameliyatlardan iyi kurtulamaz (tam eversiyonları olan hayvanların sadece %17'si herhangi bir beslenme yeteneğini yeniden kazanmıştır, N = 12. Everted olmayan hayvanların yaklaşık% 85 beslenme yeteneğini yeniden kazandı, N = 84).

Bir radular açıcı^olarakkarakterize edilmiştir I7 kas 8, odontofor kendisi içinde derin, daha fazla erişim karmaşık. Radular sapın tabanı (Şekil 1C)ile radular yüzeyin alt kısmı arasında, odontofordaki bir lümen aracılığıyla uzanır ( Şekil1C). I7 kasların üç tarafında kas duvarları, dördüncü duvar radular sap oluşur. Biyomekanik bir çalışmanın amaçları için, bu yapıların herhangi birinde büyük bozulma besleme cihazının normal işlevini tehlikeye olacaktır. Odontofor'u çenelerden dışarı çıkararak ve ameliyatı ince, kıkırdak radular yüzeye bir kesi ile yapmak gibi yeni bir yaklaşım geliştirdik. alt radular lifler olarak adlandırdığımız radular yüzeyin hemen altında nitre (Şekil 1C).

Şekil 1: Anatomik Genel Bakış. (A) Bukkal kütlenin Aplysia içindeki yeri. (B) Odontoforun dış anatomisi. Radula ve radular kese yüzeyi sarıdır; odontofor oluşturan kaslar gerçek renklerine göre kırmızı renkte gösterilir. (C) Odontoforun sagital bölümü, sub-radular liflerin yerini gösteren (kavisli pembe çizgi) ve I7 kas (düz pembe çizgi). I6 kasının kesiti koyu kırmızı renkte gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Aplysia omurgasızlar ve bu nedenle IAUC onayına tabi değildir. Hayvanlara rahatsızlık en aza indirmek için, aşağıda açıklanan cerrahi teknikleri uygulamadan önce tamamen anestezi olduğundan emin olun.

1. Hayvan Seçimi ve Anestezi

1. Yosun sunarak ve ısırık aralıklarının 3 ile 5 s arasında olmadığını onaylayarak aktif bir hayvan seçin.
2. Hayvanı 0,333 molar magnezyum klorür ile anestezi edin (bkz. Tablo 1), başın yakınına 60 mL şırınga üzerine 18 G iğne enjekte ederek böylece en yüksek anestezi konsantrasyonu bukkal kütlenin etrafında olacaktır.
   1. İğne ile hem dış epitel hem de iç doku tabakasını delmeye özen. Enjeksiyonun kabaca gergedanın altında olduğundan, gergedan ve ayak arasında yarı yolda olduğundan emin olun ve iğne oblik olarak, çene yönüne işaret etmelidir.
3. 10 dakika sonra, yavaşça solungaç ve gergedan içine bir iğne takmaya çalışır, bu geri çekilmez doğrulama, yeterli anestezi sağlamak için.
4. Sümüklüböceğin dudaklarının ve çenesinin rahat olduğundan emin olun, böylece odontofor açığa çıkabilir.
   NOT: Şekil 2A'nın dudaklarındaki kırışıklık, cerrahi işlemin zarar vermeden yapIlebilmek için hayvanın dudaklarının ve çenesinin yeterince gevşemediğini gösterir. Şekil 2B'nin pürüzsüz ve rahat dudakları çenelerin tamamen rahatladığını gösterir.

Şekil 2: Anesteziapli Ağızlarda Gerginlik ve Gevşeme. (A) Aplysia dudaklar etrafında kas gerginliği yüksek derecede gösteren. Bu çene gerginliği ile ilişkilidir ve kontraten cerrahi ile devam gösterir. (B) Rahat dudaklar ile Aplysia, çene (açık gri) iç gösteren. Renkler yine hayvanda gözlenenlere karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Bir hayvanın dudakları rahat değilse, magnezyum klorür ek bir 30 mL enjekte ve başka bir 5 dakika bekleyin. Bu dudak gevşemesi ile sonuçlanmaz, onları kurtarmak için izin vermek için iyi bir su akışı ile izole bir konteyner onları iade (adım 4 bakınız) ve farklı bir hayvan ile devam.

2. Radular Yüzeyin Açığa Çıkarılması

1. Sümüklüböceği baş aşağı doğru sallanır, böylece bukkal kütlenin çenelere yerleşmesini bekleyin.
2. Bukkal kütleyi yerinde tutarak bukkal kütleyi çenelere doğru itmek için başparmak ve işaret parmağıyla basınç uygulayın.
3. Çeneleri görünür olacak şekilde döndürün. Aynı zamanda, bukkal kütlenin prow çeneler aracılığıyla görünür böylece bukkal kütle üzerindeki basıncı korumak. (Şekil 3).

Şekil 3: Buccal Kütlesinin Çenelerin İçine Karşı Desteklenmesi. Parmaklar, çenenin iç kenarına doğru itilen bukkal kütleyi, prow'un ucu görülene kadar destekler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Odontoforun yarık içine künt forseps uçlarını yavaşça çalıştırın ve radular yüzeyi çenelerden geçirmek için kullanın. Çeneler yeterince rahat değilse, bu işleme yardımcı olmak için yarık kenarını nazikçe kavramak için forceps kullanın.
   DİkKAT: Bu basınç hayvana daha fazla zarar verebilir.
5. Yüzey açığa çıktıktan sonra, çeneleri radular yüzeyin ön kısmından temiz leyin. Bu da odontoforun geri çekilme olasılığını azaltıyor (Şekil4). Odontofor duvarlarının en fazla yarısından fazlasının maruz kaldığından emin olun.

Şekil 4: Odontoforun Kısmi Eversiyon. Radular yüzey tamamen maruz kalmaktadır, ancak odontoforun kenarları ortaya çıkarılmaz, bu da sadece kısmi bir eversiyon durmaktadır. Daha fazla eversion büyük olasılıkla hayvan hasara neden olacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: Odontoforun tam bir eversion hangi hayvanların kurtarmak için çok yavaş olan büyük kas hasarına neden olacaktır.

3. Cerrahi Kesiler

1. Radular yüzey tamamen maruz kaldığında, ameliyat için bir diseksiyon kapsamı altında sümüklüböcek düzenlemek.
   1. Alternatif olarak, özellikle öğrenirken, cerrahi için çene ve radular yüzey stabilize etmek için geniş bir lastik bant ve üçüncü bir el kullanın. Bu, ancak, prosedüre zaman ve artan doku hasarı ekler, hangi uzun vadede daha az ideal hale getirir.
2. Rakun yüzeyini yarık tarafın araştırmacıya dönük olması için yerleştirin.
3. Yavaşça radular yüzeyi kavramak, radular baz yakın, böylece yatay bir kıvrım anatomik kırışık dik oluşur. Anatomik kırışıklık boyunca bir kesi yaparak, bu kat ile kesmek için ince makas kullanın (Şekil 5).

Şekil 5: Radular Yüzeyine Kesinin yeri. (A) Radular yüzey, bir kesi ile. (B) Radular yüzey, bilateral I7 kas iplikçiklerinin nereye bağlı olduğunu gösteren daireler; noktalı çizgiler radular yüzeyin altında azalan kasların yerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Bukkal kütlenin iç erişim sağlamak için 3-5 cm bu ilk kesi uzatın.
5. Işığı, doğrudan bu kesiden geçecek şekilde ayarlayın.
6. Kesinin kenarlarını ayırın, böylece odontoforun lümeninin arkası ve I7 kasının ince dikey iplikçikleri görülebilir. (Şekil 6)

Şekil 6: Radular Yüzey Kesisi ile I7'nin konumu. Kesiye bakıldığında, I7'nin her iki iplikçikleri I4'ün iç yüzeyleri arasında görülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. Kesiden ulaşın, I7'nin her iki ipini de kavrayın ve kasın pratik olduğu kadar kesilebildiği kesiğe doğru çekin (Şekil 7).

Şekil 7: I7 Kas İpliğini Kesiden Çekme. I7 kas son derece elastik ve kaldırılması için kesi yoluyla yukarı çekilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: Uygulama ile, genellikle daha fazla görme daha hissediyorum i7 bulmak için etkilidir.

4. Ameliyat Sonrası Bakım

1. Lezyonlar yapıldıktan sonra, ön dokunaçları kavrayın ve sümüklüböceği orijinal konfigürasyonuna döndürmek için radular yüzeye bastırın.
2. Ameliyat sonrası hayvanları iyi su akışı olan korunan bir ortama yerleştirin. Artan oksijenlenme iyileşmeyi hızlandırıyor. Hayvanların ameliyattan sonraki gün tetikte ve duyarlı olduğundan emin olun. Bu durumda değilse, onlar kurtarmak değil varsayılabilir.
   NOT: Hayvanlar genellikle ameliyattan sonraki birinci veya ikinci gün beslenmeye başlarlar. Isıtmakta zorlanan hayvanlara bile yosun ikram edilmelidir, çünkü bir hayvanın iyileşmesinin yeme girişimleri yle iyileştiği anekdotgözlemimizdir.

5. Sub-radular Fiber Lezyon için

1. 1.1'den 3.5'e kadar olan adımları izleyin
2. Küçük bir düz neşter bıçağının ucunu (#11 veya benzeri) keskin kenarı yukarı doğru açılı kesiden geçirin. Hafifçe radular yüzeyinin alt tarafından ince kas lifleri kazımak. (Şekil 8).

Şekil 8: Subradular Liflerle lezyon. Neşter bıçağının kenarı, radular yüzeyin alt tarafına kesiden yukarı doğru doğru açılır, böylece alt radular lifleri hafifçe kazıyabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Adım 4.1'e dön.

Sonuçlar

Önceki çalışma, I7 kas kavrayıcı⁸açılmasına katkıda bulunduğunu ileri sürmüştü. Kendi anatomik çalışmalarımız, alt radüler liflerin de kavrayıcı nın açılmasına katkıda bulunabileceğini ileri sürmüştür. Bu hipotezleri test etmek için, hayvanlar hem önce ve bir cerrahi işlem aldıktan sonra ısırıklar oluşturmak için indüklendi. Şam hayvanları radular yüzeydeki kesi de dahil olmak üzere tüm cerrahi adımlara maruz kaldı, ancak iç kaslar çıkarılmadı. I7 lezyonuna maruz kalan hayvanların her iki I7 kası da alındı. Sub-radular lif lezyonuna maruz kalan hayvanlar, kesinin hemen altından çıkarılan sub-radular liflerin ~%25'ine sahipti. Şam lezyonları ısırma nın doruğunda açılış Genişliği üzerinde anlamlı bir etkiye sahip değildi, oysa hem I7 hemde sub-radular lifler lezyonları ısırık genişliğini önemli ölçüde azalttı (Şekil 9).

Şekil 9: Pik ısırma Sırasında Açıklık Genişliğindeki Lezyonların Sonuçları. Gösterilen veriler, her bir hayvanın kendi kontrolü olarak hizmet verdiği 3 grubun her birinde (sahte, I7 lezyon veya SRF lezyonu) 5 hayvan için cerrahi işlem öncesi ve sonrası radulanın ortalama normalleştirilmiş açılış genişliği arasındaki farklardır. Ortalamalar daha önce 5 ısırık, cerrahi işlemden sonra ise ortalama normale doğru olan farkı belirlemek için 5 ısırık alınmıştır. Açılış genişliği radula merkezinden en yüksek protrasyonda radular kenarına olan uzaklıktı ve radular tabanın iç yüzeyinden radular yüzeyin yarık kenarlarına kadar olan uzaklık normalleştirildi. Farklar, standart sapma artı veya eksi araç olarak gösterilir. Fark verilerinin normal olarak dağıtıldığı belirlendikten sonra, lezyonun hiçbir etkisi nin olmaması olasılığı belirlendi (yani, null hipotezi cerrahi prosedürlerin etkilerinin ortalama sıfır olacağı test edildi) eşleştirilmiş bir her bağımsız gruba t-testi yapın. Veriler sahte lezyonun önemli bir etkisi olmadığını, I7 kaslarının bir lezyonunun veya sub-radular liflerin lezyonunun radüler açıklık üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir (p < I7 lezyon grubu için 0.031, tek bir yıldız işareti ile gösterilir , veya p < 0.002 SRF lezyon grubu için, bir çift yıldız ile gösterilir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Vücut Ağırlığı	Magnezyum Klorür Dozu
<200 g	1/2 vücut ağırlığı
200-350 g	1/3 vücut ağırlığı
350-450 g	1/4 vücut ağırlığı

Tablo 1: Vücut ağırlığı ile Magnezyum Klorür dozajı.

Tartışmalar

Protokol deki en kritik adımlar, hayvanın tamamen anestezi altında olduğundan ve bukkal kütlenin eversiyon unun altta yatan kaslara erişmek için yeterli olduğundan emin olmak için gereken ihtiyaçtır. Bu adımları mükemmelleştirmek için bazı pratik gerektirebilir, ancak bir kez onlar hakim, ameliyatları verim yapılan tüm deneylerin% 85'ten daha fazla olması muhtemeldir. Protokolü düzgün bir şekilde değiştirmenin ve sorun gidermenin en önemli yolu, iç kasların konumlarının araştırmacıya tamamen açık olması için bukkal kütlenin diseksiyonu yaparak zaman geçirmektir. Radular yüzeyden önerilen kesi kaçınılmaz olarak altta yatan alt radular liflerde bazı hasarlara neden olduğundan, bu liflerin belirli bölgelerinden kaçınmak için kesi kesin yerini değiştirmek için uygun olabilir.

Cerrahi tekniğin bir sınırlaması, protraksiyon gücü gibi beslenme yanıtları üzerinde spesifik olmayan etkileri olabilir. Bu sınırlamayı aşmanın bir yolu hayvanların kendi kontrolleri olarak hizmet etmesidir. Buna ek olarak, belirli kas (yani, I7 veya SRFs) kaldırılması dışında tüm cerrahi protokoltabi bir sahte lezyon grubu olması önemlidir. Bu önerileri izleyerek, bir araştırmacı hayvanlar arasındaki değişkenlik etkilerini azaltacak ve cerrahi non-spesifik etkileri içsel bir ölçüye sahip olacaktır.

Önceki çalışma da lezyon veya kayıt sinirler13,¹⁴veya kaslar^15,16,17vücut duvarı ile yaklaşımlar kullandı. Laboratuvarımızda, anekdotsal olarak vücut duvarı kesilerinin genellikle önemli bir hemolenf kaybı ve dolayısıyla vücut hacminin eşlik ettiğini gözlemledik. Hayvanlar genellikle bu kurtarmak için birkaç gün gerektirir, ve vücut duvar lezyonu dikkatle dikilmiş değilse, hayvanlar kurtarmak olmayabilir. Buna ek olarak, hayvanların post-mortem muayene kesi etrafında önemli yara izi ve güçlü bir bağışıklık yanıtı ortaya koymaktadır (anekdot gözlemler). Buna karşılık, hayvanlar burada açıklanan protokolden sonra (96 hayvandaki gözlemlere dayanarak) hemolenf kaybı veya vücut hacminde bir değişiklik göstermezler.

Tekniğin gelecekteki uygulamaları Aplysia besleme cihazları içinde diğer kaslar için genişletebilir, ve diğer hayvanlariçin. Biz I7 kas ve sub-radular liflerin kaldırılması üzerinde duruldu. Bu aynı genel cerrahi teknikler de odontophore diğer kasların çoğuna erişim sağlar. Bunlardan bazıları, I5 kas iç kısmı gibi, en iyi radular yüzeyden erişilir. Diğerleri, I4 iç broşürler gibi, daha iyi odontophore dış epitel yoluyla ulaşılabilir olabilir. Biz kısmen everted odontofor radular yarık altında bir kesi daha sonra odontophore içinde başka bir kas lezyon için kullanılabilir eklenecek bir keskinleştirilmiş kanca için erişim izin ön çalışmalar yaptık, kas I8⁸. Burada açıklanan cerrahi protokol ana vücut boşluğunu açmadığından dikiş gerektirmez.

Tanımladığımız protokol, diğer yumuşakçaların beslenme cihazları gibi manipüle edilmesi zor olan yumuşak doku yapıları üzerinde çalışan diğer araştırmacıların genel ilgisini çekebilir. Daha genel olarak, bu protokol diller, gövdeler veya dokunaçlar¹⁸gibi yumuşak yapıların analizi için diğer yeni cerrahi yaklaşımlar önerebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt forceps	Fine Science Tools	11210-10	2 pair
Scalpel blade (#11)	Fine Science Tools	10011-00
Spring scissors	Fine Science Tools	15024-10
Webcam	Logitech	c920	for recording data