JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, makrofaj-soy hücrelerine ilaç dağıtımını hedeflemek amacıyla ilaç yüklü lipozomların ve bunların mikroenjeksiyonunun larva zebra balığına sentezini anlatıyoruz.

Özet

Zebra balığı(Danio rerio)larvaları, konak-patojen etkileşimlerini ve doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel olarak korunmuş doğuştan gelen bağışıklık sistemi nedeniyle inflamatuar hastalıklara olan katkısını araştırmak için popüler bir model haline gelmiştir. Onlar da yaygın olarak nasıl doğuştan bağışıklık hücreleri gelişimsel süreçleri rehberlik yardımcı incelemek için kullanılır. Larva zebra balıklarının optik saydamlığı ndan ve genetik yollabilirliğinden yararlanarak, bu çalışmalar genellikle bozulmamış hayvanlarda floresan olarak işaretlenmiş makrofajları ve nötrofilleri işlevsel olarak karakterize etmek için canlı görüntüleme yaklaşımlarına odaklanmıştır. Çeşitli fonksiyonel heterojenlikleri ve hastalık patogenezinde sürekli genişleyen rolleri nedeniyle makrofajlar büyük ilgi gördü. Genetik manipülasyonlara ek olarak, larva zebra balıklarında makrofaj davranışını manipüle etmek ve incelemek için kimyasal müdahaleler de rutin olarak kullanılmaktadır. Bu ilaçların teslimi genellikle doğrudan daldırma veya mikroenjeksiyon yoluyla serbest ilaç pasif hedefleme ile sınırlıdır. Bu yaklaşımlar makrofaj davranışıherhangi bir değişiklik makrofajlar kendileri üzerinde ilacın doğrudan bir etkisi sonucu olduğu varsayımına dayanır, ve başka bir hücre tipi üzerinde doğrudan bir etkisi bir downstream sonucu değil. Burada, ilaç yüklü floresan lipozomları mikroenjekte ederek özellikle larva zebra balığı makrofajlarına yönelik ilaç hedefleme protokollerimizi sıyoruz. Poloxamer 188 modifiye edilmiş uyuşturucu yüklü mavi floresan lipozomların nötrofiller tarafından değil, makrofajlar tarafından kolayca ele alındığını ortaya koyuyoruz. Ayrıca, bu şekilde teslim edilen ilaçların makrofaj aktivitesini ilacın etki mekanizmasına uygun bir şekilde etkilayabileceğine dair kanıtlar salıyoruz. Bu teknik, ilaçların makrofajlara hedef olmasını sağlamak isteyen ve ilaçların daldırma gibi geleneksel yöntemlerle teslim edilemeyecek kadar toksik olduğu araştırmacılar için değerli olacaktır.

Giriş

Mononükleer fagosit sistemi işgalci patojenlere karşı ilk savunma hattını sağlar. Bu sistem monositler, monosit türetilmiş dendritik hücreler ve makrofajlardan oluşur, bu da aktif olarak yabancı patojenleri fagositata, böylece patojen yayılımını sınırlandırır. Bu fagositik ve mikrobisidal efektör fonksiyonlarına ek olarak, dendritik hücreler ve makrofajlar da adaptif bağışıklıksisteminietkinleştirmek için sitokin üretimi ve antijen sunumu yeteneğine sahiptir1. Bu hücrelerin, makrofajlar çeşitli fonksiyonel heterojenlik ve birden fazla inflamatuar hastalıklara tutulum nedeniyle özellikle dikkat almış, otoimmünite ve bulaşıcı hastalıklarkanser2,3,4,5,6,7. Makrofajların plastisite ve işlevsel doku ortamına ihtiyaçlarına uyum yeteneği doğrudan gözlemlemek ve vivo bu hücreleri sorgulamak için deneysel yaklaşımlar gerektirir.

Larva zebra balığı, in vivo8'dekimakrofajların işlevini ve plastisitesini incelemek için ideal bir model organizmadır. Larva zebra balığının optik saydamlığı, özellikle makrofaj işaretleme transgenik muhabir çizgileri ile birleştiğinde makrofajların davranışını doğrudan gözlemlemek için bir pencere sağlar. Larva zebra balığının canlı görüntülemepotansiyelinden ve deneysel traktörden yararlanılabilmek, insan hastalığı9,10 ,11,12,13,14,15ile doğrudan ilgisi olan makrofaj fonksiyonuna dair birçok önemli içgörüye yol açmıştır. Bu çalışmaların çoğu da zebra balığı uyuşturucu aktivitesinin yüksek koruma yararlanmış (bir bütün hayvan ilacı keşif platformu olarak kullanımını destekleyen bir özellik16,17,18), farmakolojik makrofaj fonksiyonu işlemek için kimyasal müdahaleler kullanarak. Bugüne kadar, bu farmakolojik tedaviler çoğunlukla daldırma yoluyla teslim edilmiştir, hangi ilacın suda çözünür olmasını gerektirir, ya da serbest ilaç doğrudan mikroenjeksiyon(Şekil 1A). Bu pasif teslimat stratejilerinin sınırlamaları, makrofaj fonksiyonu üzerindeki herhangi bir etkinin değerlendirilmesini engelleyebilecek hedef dışı etkileri ve genel toksisiteyi içerir. Ayrıca, makrofajlar üzerindeki ilaç etkilerini araştırırken ilaçların makrofajlar üzerinde mi yoksa daha dolaylı mekanizmalar aracılığıyla mı hareket ettiğini niçin etkilediği bilinmemektedir. Makrofaj fonksiyonunu araştırmak için benzer kimyasal müdahale çalışmaları yaparken, özellikle makrofajlara yönelik ilaçları hedeflemek için ucuz ve basit bir teslimat yöntemi geliştirme ihtiyacı olduğunu fark ettik.

Lipozomlar mikroskobik, biyouyumlu, proteinleri, nükleotitleri ve ilaç kargosulate olabilir lipid çift katmanlı veziküllervardır 19. Lipozomların unilamellar veya multilamellar lipid çift katmanlı yapısı suda çözünen ilaçların dahil edilebildiği sulu bir iç lümen oluştururken, hidrofobik ilaçlar lipid membranlarına entegre edilebilir. Buna ek olarak, lipozomların fizikokimyasal özellikleri, boyut, yük ve yüzey modifikasyonları da dahil olmak üzere belirli hücrelere kendi hedefleme terzi için manipüle edilebilir20,21. Lipozomların bu özellikleri onları ilaç teslim etmek ve mevcut tedavi rejimleri20hassasiyetini artırmak için cazip bir araç yaptık. Lipozomlar doğal olarak makrofajlar tarafından fagositozlu olduğundan (özellikle ablasyon deneyleri için makrofajlara clodronat tesliminde rutin kullanımları tarafından kullanılan bir özellik22), makrofajlara özgü ilaç dağıtımı için cazip bir seçenek olarak sunarlar (Şekil 1B).

Bu protokol, hidrofilik polimer poloxamer 188 ile kaplanmış mavi floresan lipozomlar içine ilaçların formülasyonu açıklar, bu lipozom yüzeyinde koruyucu bir tabaka oluşturur ve ilaç tutma geliştirmek için gösterilmiştir ve üstün biyouyumlulukvar 23. Poloxamer, önceki araştırmalarımızda polietilen glikol modifiye lipozomlarla karşılaştırıldığında, poloksamer modifiye lipozomların, intravenöz infüzyonu takiben tavşanlarda sıçan pençelerinin ve benzeri farmakokinetiklerin deri altı enjeksiyonu sonrasında daha iyi biyouyumluluk gösterdiğini gösterdiği gibi lipozomların yüzey kaplaması için seçilmiştir23. Protokoller ayrıca larva zebra balığına mikroenjeksiyon ve canlı görüntüleme ile makrofaj hedefleme yeteneklerini ve lipozom yıkımı ve sitoplazmik ilaç teslimatı için gerekli hücre içi kompartmanlara lokalizasyonlarını değerlendirmek için tanımlanmıştır. Bir kanıtı-of-kavram olarak daha önce akut gut iltihabı bir larva zebrabalığı modelinde aktivasyon bastırmak için makrofajlar için iki ilaç hedef için bu tekniği kullandık24. Bu ilaç dağıtım tekniği, ilgi çekici ilaçların makrofaj hedefleme sağlamak isteyen zebra balığı araştırmacıları için mevcut kimyasal "araç" genişletir.

Protokol

1. İlaç yüklü Marina Mavi etiketli Lipozomların hazırlanması

NOT: Mavi floresan boya, Marina Blue ve ilaç taşıyan lipozomlar poloxamer 188 post ekleme ile ince bir film hidrasyon yöntemi kullanılarak hazırlanır. Aksi belirtilmedikçe tüm işlemler oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Kontrol lipozomları sadece Marina mavisi ve PBS taşır. Buradaki örnekte, lipozomların mitokondri hedefleyen antioksidan ilaç25 ile yüklenmesi, temsili sonuçlarda kullanılan bir kavram kanıtı olarak açıklanmaktadır.

  1. Lipozomları hazırlamak için, fosfolipidlerin 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 16.4 mg (22.2 μmol) çözünür ( 4.bkz.3 mg (11.1 μmol) kolesterol (bkz. Malzemeler Tablosu)ve 2.8 mg (3.7 μmol) 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-fosfokolin (bkz. kloroformun 3 mL'sinde:metanol (3:1 v/v) 25 mL yuvarlak alt şişede.
  2. Yukarıdaki karışıma, Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine 31 nmol ekleyin (Malzemeler Tablosubakınız) ve 300 nmol bir mROS inhibe ilaç (Malzemeler Tablosubakınız) ve sonicate kısaca tamamen çözülmek için. Kontrol lipozomlar için, sadece Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine ekleyin.
    NOT: ışığa duyarlı Marina Blue floresan boyanın fotobeyazmasını önlemek için, mümkünse tüm prosedürleri ışıktan koruyun. Yüklenecek ilaç ışığa duyarlı ise bu da önemlidir.
  3. Vakum basıncı altında 75 rpm 'de (15 dk sonra 0 mbar 20 dk) döndürülerek 45 °C'ye ayarlanmış sıcaklık kontrollü su banyosu üzerinde çözücüü yavaşça döner buharlaştırıcının üzerine çıkarın (Bkz. Malzeme Tablosu). Bu organik çözücü tam kaldırılmasını kolaylaştırmak için N2 altında 45 dakika kurutulur şişe cam duvarları içinde kuru ince lipid film oluşturur.
  4. İnce filmin oluşumunu takiben vakum basıncını 15 dk için 40 mbar'a ayarlayın, ardından kalıntı çözücünün çıkarılmasını sağlamak için 30 dk azot gazı ile temizle.
  5. İnce filmi 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) kullanarak nemlendirin ve veziküloluşturmak için 60 °C'lik su banyosunda döner buharlaştırıcı kullanarak şişeyi ajite etmeden önce parafilm ile kapatın.
  6. Sulu süspansiyonu 7 devre donma ve çözülme için sıvı N2'de 3 dakika dondurarak ve ardından 45 °C'lik su banyosuna 7 dakika süreyle daldırmaya tabi tutarak.
  7. Büyük unilamellar veziküller elde etmek için 2-6 çevrim için bir mini ekstrüzyon (Malzeme Tablosunabakınız) ve 1,0 μm paletli polikarbonat membranlar (Malzeme Tablosunabakınız) kullanarak bir membrandan littrude lipozomlar.
    NOT: Makrofajlara karşı daha uygun hedefleme elde etmek için, lipozomların çapı yaklaşık 1 μm26,27,28olana kadar ekstrüzyon döngülerini manipüle edin.
  8. 186.000 x g ve inkübaz 1 mL 1% poloxamer 188 (Malzeme Tablosubakınız) çözeltisi (10 mg / mL PBS) 45 °C ve 750 rpm 30 dakika için 2 mL mikrosantrik fuge ek (Tablo Malzemelerbak) ile bir termmikser kullanarak ultracentrifugation tarafından bir pelet içine taze lipozomlar yoğunlaştırmak.
  9. Ultracentrifuge karışımı 186.000 x g için 1 saat 4 °C'de ve herhangi bir bağlı olmayan polimer veya ilaç kaldırmak için supernatant çıkarın. Lipozom peletlerini ışıktan korunan 4 °C'de saklayın.

2. Lipozom Boyutu ve Zeta Potansiyelinin Karakterizasyonu

  1. Ultra saf su (1:100) ile seyreltilmiş lipozom formülasyonu ve dinamik bir ışık saçılma analizörü kullanarak lipozomların parçacık boyutunu, polidispersity indeksini (PDI) ve zeta potansiyelini ölçün (bkz.
    NOT: PDI nanopartikül popülasyonunun boyut dağılımının bir ölçüsüdür. PDI değerleri < 0,05 daha düzgün bir dağılım gösterirken 1'e yakın değerler daha büyük boyut dağılımını gösterir. Zeta potansiyeli genel yüzey yüküdür.

3. Lipozomlarda Tuzak Verimliliği ve İlaç Yüklemesinin Hesaplanması

NOT: Lipozomlarda ilacın tuzak verimliliğini belirlemek için, supernatant ve lipozom peletinde bulunan ilaç içeriği ölçülür.

  1. PBS 1 mL lipozom pelet resuspend.
  2. Supernatant çıkarın, ultrasaf su ile 10 x seyreltin ve yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ile analiz.
  3. Lipozomlardaki ilaç konsantrasyonunun belirlenmesi için, %10 triton-X100 çözeltisinin %10'una 100 μL lipozom süspansiyon ekleyin (lipid zarını yok etmek, hapsedilen ilacı serbest bırakmak ve HPLC kolonunda lipid birikmesini önlemek için) ve 3 dakika girdap analizden önce.
  4. Bir kuaterner pompa, termostat otomatik numuneleyici ve 3 μm 250 x 4,6 mm kolondan oluşan bir HPLC sistemine 20 μL numune enjekte edin. Mobil fazı (10 mM PBS pH 2.5, asetonitril ve metanol (30:40:30, v/v/v)) akış hızını 0,9 mL/dk'ya ayarlayın ve 230 mM'de bir diyot dizi dedektörü kullanarak spektral profiller elde edin.
  5. Tuzak verimliliğini (EE) ve ilaç yüklemesini (DL) aşağıdaki denklemleri kullanarak hesaplayın:
    EE (%) = [Me / Mt] x 100
    DL (%) = [Me / Mlip] x 100
    Nerede Me ilaç kapsüllü kitle, Mt formülasyon sırasında kullanılan ilacın toplam kütlesi ve Mlip lipidlerin toplam kütlesi (kolesterol dahil) ve kapsüllenmiş ilaç.

4. Lipozomların Hazırlanması ve Enjeksiyonu

  1. Konik mikroenjeksiyon iğnesi (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D. x 10 cm uzunluğunda) bir mikropipet çekmece cihazına (Malzeme Tablosunabakınız) aşağıdaki jenerik çekmece ayarlarına (ısı 680, 75, hız 40, zaman 55 ve basınç 530) yerleştirerek borosilikat mikroenjeksiyon iğnelerini hazırlayın.
  2. Modelleme kil üzerine bir Petri kabına iğneyerleştirin ve çekilen uç kabın altına dokunmadan bir şekilde düzenlemek. Kullanıma hazır olana kadar toz kontaminasyonunu önlemek için Petri kabının kapağını kapalı tutun.
  3. Seyreltmek taze hazırlanmış lipozom formülasyonları 1:1 steril PBS (pH 7.4) ve kısaca girdap (2-3 s) karıştırmak için.
    NOT: Larvalar mikroenjeksiyon alanına kadar lipozomları ışıktan koruyun.
  4. Yetişkin zebra balığı üreme çiftleri önceki gece kurmak ve daha önce Rosen ve ark.29tarafından açıklandığı gibi embriyoları toplamak .
  5. Embriyoları e3 orta (5 mM NaCl, 0,33 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4)içeren bir Petri kabına (çanak başına yaklaşık 60 embriyo ile 100 mm x 20 mm tarzı) aktarın ve mantar büyümesini engellemek için %0,1 metilen mavisi ile desteklenir. Tüm ölü veya döllenmemiş embriyoları çıkarın ve gece boyunca 28.5 °C'de kuluçkaya yatırın.
  6. Canlı görüntülemeyi kolaylaştırmak için, embriyolar pigment oluşumunu (melanizasyon) önlemek için 24 saat gelişime ulaştığında E3 ortamına %0.003 N-Phenylthiourea (PTU) ekleyin.
  7. El ile ince uç forceps kullanarak yaklaşık 30 saat sonrası döllenme (hpf) dechorionate.
    NOT: Embriyoları dekozyon etmek için enzimatik tedavi kullanmayın, çünkü bu epitelyal hasara ve lokal inflamasyona neden olabilir ve böylece immünolojik çalışmaları etkileyebilen
  8. Embriyolar 28.5 °C'de döllenmeden (dpf) 2 gün sonrasına kadar gelişsin.
  9. Tüm yüzeyi kaplayan ince bir film oluşturmak için küçük bir 35 mm kültür yemeğinin kapağına yeterli %3 metil selüloz (E3 ortam) dökerek bir enjeksiyon plakası hazırlayın.
    NOT: E3 ortamda %3 metil selüloz hazırlanırken, metil selülozun orbital shaker üzerinde hafif ajitasyon la çözülmesi birkaç gün sürer.
  10. Trikain 200 μg/mL ile desteklenen E3 ortamlarında kuluçkaya yatarak larvaları uyuşturur.
  11. Plastik transfer pipeti kullanarak yaklaşık 20-25 larvadan oluşan bir havuz toplayın ve embriyoların ağırlık açısından pipetin ucunda yoğunlaşmasını bekleyin. En az sıvı ile larva aktarmak için özen, 35 mm kültür çanak kapağının ortasına yerleştirin.
  12. Mikrokapiller yükleyici kullanarak larvaları aşağıdaki şekillerde düzenleyin: mikroenjeksiyon iğnesine bakan dorsal yüzeyi ile enjeksiyon plakasının üst kısmındaki anterior, arka beyin ventrikülüne enjekte etmek için(Şekil 2A-D); veya sinüs venöze enjekte etmek için mikroenjeksiyon iğnesine bakan ventral yüzeyi ile enjeksiyon plakasının soluna doğru (sağdan enjekte ederken) ön (Şekil 2I).
    NOT: Bu şekilde enjekte edildiğinde, sırasıyla hindbrain ventrikül sakini(Şekil 2E) ve kaudal hematopoetik doku (KT)-resident(Şekil 2J) makrofajlar hedeflenebilir. Larva zebra balığının CHT bölgesi memeli fetal karaciğerine benzer hematopoetik bir bölgedir. Bu böylece immünolojik çalışmaları etkileyen yerel inflamasyona neden olabilir olarak düzenlerken embriyolara zarar vermemeye ekstra dikkat edin.
  13. Taze hazırlanmış lipozomları alın (adım 4.3'ten itibaren) ve mikrokapiller yükleyici kullanarak bir enjeksiyon iğnesini yaklaşık 5 μL'lik bir mikrokesyatik enjeksiyon karışımıyla doldurun (bkz. Malzemeler Tablosu).
    NOT: Makrofajların fagolysozomal komponentlerine lipozomların lokalizasyonu değerlendirilirken(Şekil 2H),bu enjeksiyon karışımını kırmızı floresan fagozomun 200 g/mL'lik kısmı ile tamamlayın (Bkz. Malzemeler Tablosu)ve 100 nM çok kırmızı floresan belirteç lizozomlar (Malzeme Tablosubakınız) fagozomları işaretlemek için30,31 ve lizozomlar32, sırasıyla.
  14. İğneyi bir mikromanipülatöre monte edin (bkz. Malzeme Tablosu)manyetik bir standa ve bir basınç enjektöre bağlı (bkz. Malzemeler Tablosu). Stereomikroskop altında yerleştirin ve enjektörü yaklaşık 50 ms'lik bir darbe süresine ve yaklaşık 40 psi enjeksiyon basıncına ayarlayın.
  15. Mikroenjeksiyon iğnesinin ucunu temiz ince uç forceps ile kesin ve yaklaşık 5 μm çapında bir açıklık oluşturun.
  16. Bir hemositometrenin ızgara hatları üzerinde konumlandırılmış bir mineral yağ damlasına bir bolus enjekte edilerek enjekte edilecek hacmi kalibre edin. Nabız süresini ve/veya enjeksiyon basıncını en küçük ızgara hatlarının 2,5'ini kaplayana kadar ayarlayın (bu yaklaşık 1 nL'lik bir hacme karşılık gelir).
  17. Lipozom enjeksiyon karışımının 1 nL'sini her larvanın arka beyin ventrikülüne dikkatlice enjekte edin.
    NOT: Arka beyin ventriküliçine enjekte ederken, kanamalara yol açan altta yatan vaskülatür bozabilir gibi çok uzak ventrally (arka beyin ötesinde) nüfuz değil dikkat edin. Sinüs venöz içine enjekte ederken, iğne ucu sadece perikard içinde ve sarısı nüfuz değil emin olmak için dikkatli olmalıdır.
  18. Enjeksiyondan sonra, enjekte edilen larvaları e3 media'yı enjeksiyon plakasına ekleyerek ve larvaları plastik bir transfer pipeti kullanarak metil selülozdan hafifçe çıkararak hemen E3 ortama aktarın.
  19. Canlı konfokal görüntüleme ile analiz edilinceye kadar larvaları 28.5 °C'de (ışıktan korunmuş) inkübün.

5. Lipozomların Makrofaj Hedeflemesini Doğrulamak İçin Konfokal Görüntüleme ve Görüntü Analizi

  1. Bir su banyosunu 50 °C'ye ısıtın.
  2. % 0.003 PTU ve 200 μg/mL Tricaine ile desteklenen E3 ortam içeren yeni bir Perti çanağa aktararak lipozom enjekte edilen larvaları anestezik.
  3. E3 ortamlarında %1'lik düşük erime noktası agarose'u eriterek ve %0.003 PTU ile desteklenen canlı görüntüleme montaj ortamını mikrodalgafırında hazırlayın. Su banyosuna yerleştirin ve çözelti 50 °C'ye soğuduktan sonra 200 μg/mL Tricaine ekleyin.
  4. Agarose erken polimerizasyonönlemek için 50 ° C su banyosunda montaj ortamı tutun.
  5. Arka beynin sırt yüzeyini su daldırma merceği(Şekil 2E)ile donatılmış bir konfokal mikroskobun üzerinde görmek için larvaları aşağıdaki gibi yerleştirin: 35 mm'lik bir kültür kabını montaj ortamıyla (yaklaşık 5 mm derinliğe kadar) doldurun ve polimerize edin. Sarısı kese karşılamak için yeterli büyüklükte agarose küçük bir siper kazmak.
  6. Erimiş montaj ortamı ile plastik transfer pipet doldurun, küçük bir miktar kovmak ve anestezi larvaları toplamak için kullanabilirsiniz. Hemen kültür çanak içine larva transfer ve bir mikrocapiller yükleyici kullanarak, kazılan delikleriçine, ventral tarafı aşağı sarısı keseleri yönlendirmek. Agarose polimerize olana kadar periyodik olarak bu pozisyonda saklayın. 200 μg/mL Tricaine ile desteklenen E3 ortamlı bindirme.
    NOT: Larva transferi ve konumlandırılması nda epitelyal hasara ve immünolojik çalışmaları etkileyebilen lokal inflamasyona neden olmamak için dikkatli olmaya özen gösterilmiştir. Larvaların konumlandırması için cht bölgesini canlı olarak görebiz (Şekil 2J), yukarıda açıklandığı gibi monte edin, ancak larvaları kazılmış deliğin içine yanal yerleştirin.
  7. Ters bir konfokal mikroskop üzerinde görüntüleme yaparken, larvagömmek, agarose yatak olmadan, doğrudan bir cam alt çanak altına. Onları dorsal yüzey aşağı (veya yanal) ve polimerizasyon aşağıdaki düzenleyin, montaj ortamı eşit bir tabaka ile tüm çanak yüzeyini kaplayın. Polimerize edildikten sonra, 200 μg/mL Tricaine ile takviye edilmiş ince bir E3 ortam tabakası ekleyin.
  8. Arka beyin ventrikülünü konfokal mikroskopta yaşamak için aşağıdaki ayarları kullanın: 512 x 512 piksel; 40 x 3 μm Z-yığınları (arka beynin dorsal-en yüzeyinden uzanan); 20x hedef; 2.5x yakınlaştırma.
    NOT: Numuneler arasındaki sinyal yoğunluklarını karşılaştırırken (örneğin, makrofajları [Tg(mpeg1:EGFP)33] veya nötrofil [Tg(lyz:EGFP)34] işaretleyen muhabir çizgileri içinde enjekte edilen Marina Blue etiketli lipozomların alımını görüntülerken, lazer ayarlarının aynı tutulması esastır (örn. iğne deliği çapı, lazer gerilim, ofset ve kazanç) herhangi bir fark sağlamak için değiştirilmiş görüntü edinme ayarları bir artifakı değildir.
  9. Marina Blue etiketli lipozomların makrofaj veya nötrofil alımını ölçmek için 3D görüntü analizi yazılımı kullanın. Bir Z-yığını içinde lipozom içeren hücre sayısını ölçmek için(Şekil 2F),tek tek Z bölümleri arasında ilerleyin ve Marina Blue etiketli lipozomlar içeren tek tek hücrelerin sayısını sayın. Hücrelerdeki lipozomların floresan yoğunluğunu ölçmek için(Şekil 2G),hücre içi Marina Blue'nun toplam veya ortalama floresan yoğunluğunu ölçmek için her hücrenin etrafında (X, Y ve Z boyutlarında) bir ilgi alanı çizin.

Sonuçlar

Floresan lipozomların hazırlanmasında açıklanan ince film hidrasyon yaklaşımı basit ve uygun maliyetli bir yöntemdir. Bu çalışmada kullanılan protokol ile lipozomların unilamellar23,24olması beklenmektedir. Üretilen lipozomların büyüklüğü, zeta potansiyeli, ilaç yüklemesi ve tuzak etkinliği Tablo 1'deözetlenmiştir. Lipozomların partikül boyutu (ilaç yüklemesinden önce ve sonra) benzerdir(Tablo 1). ...

Tartışmalar

Burada, larva zebra balıklarında özellikle makrofajları hedef almak için ilaç yüklü lipozomlar formüle etmek için ayrıntılı bir protokol sağladık. Bu yöntem, özellikle makrofajlara doğrudan hedeflenen ilaç teslimini sağlayarak bazı hastalık modellerinde makrofajların rolünü incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, ilaçların genel toksisitesi daldırma gibi daha geleneksel yollar tarafından teslim edildiğinde kullanımını sınırlar zaman kullanılabilir. Burada açıklanan protokol larva z...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var olduğunu beyan.

Teşekkürler

Bu çalışma, C.J.H. (Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi ve Marsden Fonu, Yeni Zelanda Kraliyet Cemiyeti) ve Z.W.'ye (Auckland Üniversitesi'nden Fakülte Araştırma Geliştirme Fonu) verilen hibeler ile desteklenmiştir. Yazarlar zebra balığı tesisi uzman yönetimi için Alhad Mahagaonkar teşekkür, Biyomedikal Görüntüleme Araştırma Birimi, Tıp Bilimleri Fakültesi, Auckland Üniversitesi konfokal görüntüleme ve Graham Lieschke ile yardım için Tg hediye için (mpeg1:EGFP) muhabir hattı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids, Inc.850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)Avanti Polar Lipids, Inc.850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranesGE Healthcare Life Sciences110610
25 mL round-bottom flaskSigma-AldrichZ278262
35 mm culture dishThermo Scientific150460
AcetonitrileSigma-Aldrich34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array DetectorAgilent TechnologiesG4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary PumpAgilent TechnologiesG1311B
Agilent 1290 Infinity Series ThermostatAgilent TechnologiesG1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needlesWarner Instruments203-776-0664
CaCl2Sigma-AldrichC4901-100G
cholesterolSigma-AldrichC8667
Dumont No.5 fine tip forcepsFine Science Tools11251-10
Eppendorf Microloader pipette tipEppendorf5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vesselsEppendorf4053-6038
eyelash manipulatorTed Pella Inc.113
hemocytometerHawksleyBS.748
HEPESBDH Chemicals441474J
HPLC systemAgilent Technologies1260 series HPLC system
KClSigma-AldrichP9541-1KG
low melting point agaroseInvitrogen16520-100
LysoTracker Deep RedInvitrogenL124921 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep RedThermo ScientificL12492
magnetic standNarishigeGJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)InvitrogenM12652Keep at -20 °C and protect from light.
MethanolSigma-Aldrich34860
methyl celluloseSigma-AldrichM0387-500G
methylene blueAlfa Aesar42771
MgSO4Sigma-Aldrich230391-500G
micromanipulatorNarishigeM-152
mineral oilSigma-AldrichM-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPOSigma-AldrichSML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide IndicatorThermo ScientificM36008
MitoTEMPOSigma-AldrichSML0737Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629-10GTake care when handling, toxic.
NaClBDH Chemicals27810.295
PBS (pH 7.4)Gibco10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm)Corning Inc.430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm columnPhenomenex00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles ConjugateThermo ScientificP35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles ConjugateInvitrogenP35361Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipetteMedi'RayRL200C
poloxamer 188BASF Corporation
pressure injectorApplied Scientific InstrumentsMPPI-2
rotary evaporatorBüchi, Flawil, SwitzerlandBüchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscopeOlympusOlympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ UltracentrifugeThermo Scientific75000090
stereomicroscopeLeicaMZ12
TricaineSigma-AldrichA5040-25GMake 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100Sigma-AldrichX100-100ML
Ultrasonic bathThermo ScientificFB-11205
Volocity Image Analysis SoftwarePerkinElmerversion 6.3
water bath
Zetasizer NanoMalvern Instruments LtdZetasizer Nano ZS ZEN 3600

Referanslar

  1. Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
  2. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  3. Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
  4. Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
  5. Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
  6. Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).
  8. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
  9. Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
  10. Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
  11. Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  12. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  13. Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
  14. Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  15. Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
  16. Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
  17. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
  18. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  19. Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
  20. Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
  21. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  22. Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
  23. Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
  24. Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
  25. Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
  26. Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
  27. Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
  28. Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
  29. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  30. Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
  31. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
  32. Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
  33. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
  34. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  35. Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
  36. Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
  37. Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
  38. Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
  39. Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
  40. Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
  41. Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
  42. Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
  43. Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
  44. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 156zebra balmakrofajlarlipozomlarila da t mdo u tan ba kl kcanl g r nt leme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır