Mirare i farmaci ai macrofagi di pesce zebra larvale iniettando liposomi caricati con droga

Riepilogo

Qui, descriviamo la sintesi dei liposomi caricati dai farmaci e la loro microiniezione nel pesce zebra larvale allo scopo di indirizzare la somministrazione di farmaci alle cellule di macrofago-lignaggio.

Abstract

Le larve di pesce zebra (Danio rerio) si sono sviluppate in un modello popolare per studiare le interazioni ospite-patogeno e il contributo delle cellule immunitarie innate alle malattie infiammatorie a causa del loro sistema immunitario innato contenuto funzionalmente conservato. Essi sono anche ampiamente utilizzati per esaminare come le cellule immunitarie innate aiutano a guidare i processi di sviluppo. Sfruttando la trasparenza ottica e la trattabilità genetica del pesce zebra larvale, questi studi spesso si concentrano su approcci di imaging dal vivo per caratterizzare funzionalmente macrofagi e neutrofili marcati fluorescenti all'interno di animali intatti. A causa della loro eterogeneità funzionale diversificata e dei ruoli in continua espansione nella patogenesi della malattia, i macrofagi hanno ricevuto un'attenzione significativa. Oltre alle manipolazioni genetiche, gli interventi chimici sono ora regolarmente utilizzati per manipolare ed esaminare il comportamento dei macrofafi nel pesce zebra larvale. La consegna di questi farmaci è in genere limitata al targeting passivo di droga libera attraverso l'immersione diretta o microiniezione. Questi approcci si basano sul presupposto che qualsiasi modifica al comportamento dei macrofagi sia il risultato di un effetto diretto del farmaco sui macrofagi stessi, e non una conseguenza a valle di un effetto diretto su un altro tipo di cellula. Qui, presentiamo i nostri protocolli per indirizzare i farmaci specificamente ai macrofagi di pesci zebra larve mediante microiniezione di liposomi fluorescenti caricati da farmaci. Vi riveliamo che i liposomi fluorescenti blu carichi di pallacaneggio 188 modificati sono prontamente assorbiti dai macrofagi e non dai neutrofili. Forniamo anche la prova che i farmaci consegnati in questo modo possono avere un impatto sull'attività dei macrofazini in modo coerente con il meccanismo d'azione del farmaco. Questa tecnica sarà di valore per i ricercatori che vogliono garantire il targeting dei farmaci ai macrofagi e quando i farmaci sono troppo tossici per essere consegnati con metodi tradizionali come l'immersione.

Introduzione

Il sistema di fagociti mononucleari fornisce una prima linea di difesa contro gli agenti patogeni invasori. Questo sistema è costituito da monociti, cellule dendritiche derivate da monciti e macrofagi, che attivamente fagocitozelare patogeni estranei, limitando così la diffusione di patogeni. Oltre a queste funzioni fagocitiche e microbicide, le cellule dendritiche e i macrofagi sono anche in grado di produzione di citochine e di presentazione dell'antigene per attivare il sistema immunitario adattivo¹. Di queste cellule, i macrofagi hanno ricevuto particolare attenzione a causa della loro eterogeneità funzionale diversificata e del coinvolgimento in molteplici malattie infiammatorie, dall'autoimmunità e malattie infettive al cancro^2,3,4,5,6,7. La plasticità dei macrofagi e la loro capacità di adattarsi funzionalmente alle esigenze del loro ambiente tissutale richiedono approcci sperimentali per osservare e interrogare direttamente queste cellule in vivo.

Il pesce zebra larvale è un organismo modello ideale con cui studiare la funzione e la plasticità dei macrofagi in vivo⁸. La trasparenza ottica del pesce zebra larvale fornisce una finestra per osservare direttamente il comportamento dei macrofagi, soprattutto se accoppiati con linee di reporter transgenici marcati macrofagi. Sfruttare il potenziale di imaging dal vivo e la trattatibilità sperimentale del pesce zebra larvale ha portato a molte intuizioni significative sulla funzione del macrofago che hanno una rilevanza diretta per la malattia umana^{9,10,11,12,13,14,15}. Molti di questi studi hanno anche approfittato dell'alta conservazione dell'attività farmacologica nel pesce zebra (un attributo che sostiene il loro uso come piattaforma di scoperta di farmaci animali^16,17,18), utilizzando interventi chimici per manipolare farmacologicamente la funzione macrofago. Ad oggi, questi trattamenti farmacologici sono stati per lo più erogati sia attraverso l'immersione, che richiede che il farmaco sia solubile in acqua, o per microiniezione diretta di droga libera (Figura 1A). Le limitazioni di queste strategie di consegna passiva includono effetti off-target e tossicità generale che possono impedire di valutare qualsiasi impatto sulla funzione del macrofago. Inoltre, quando si studiano gli effetti sui farmaci sui macrofagi non è noto se i farmaci agiscono sui macrofagi stessi o attraverso meccanismi più indiretti. Quando si eseguono studi di intervento chimico simili per studiare la funzione del macrofago, abbiamo riconosciuto che c'era una necessità insoddisfatta di sviluppare un metodo di somministrazione economico e diretto per indirizzare i farmaci specificamente ai macrofagi.

I liposomi sono vesciche microscopiche, biocompatibili, lipidi che possono incapsulare proteine, nucleotidi e merci di droga¹⁹. La struttura di unilamellar o bistrato lipidico multilamellar dei liposomi forma un lumen interno acquoso dove i farmaci solubili in acqua possono essere incorporati mentre i farmaci idrofobici possono essere integrati nelle membrane lipidiche. Inoltre, le proprietà fisico dei liposomi, comprese le modifiche di dimensioni, cariche e superfici, possono essere manipolate per adattare il loro targeting a celle specifiche^20,21. Queste caratteristiche dei liposomi li hanno resi un veicolo attraente per fornire farmaci e migliorare la precisione degli attuali regimi di trattamento²⁰. Poiché i liposomi sono naturalmente fagocitoscitosamente dai macrofagi (una caratteristica sfruttata dal loro uso di routine nel fornire clodrinonato specificamente ai macrofagi per esperimenti di ablazione²²), presentano come un'opzione attraente per la somministrazione di farmaci specifici per i macrofagi (Figura 1B).

Questo protocollo descrive la formulazione di farmaci in liposomi fluorescenti blu rivestiti con il poloxamer polimerico idrofilo 188, che forma uno strato protettivo sulla superficie liposomica e ha dimostrato di migliorare la ritenzione dei farmaci e avere una biocompatibilità superiore²³. Poloxamer è stato scelto per il rivestimento superficiale dei liposomi come la nostra ricerca precedente aveva dimostrato che, rispetto ai liposomi modificati in polietilene glicole, i liposomi modificati poloxamer hanno mostrato una migliore biocompatibilità dopo l'iniezione sottocutanea di zampe di ratto e simili farmacocinetici nei conigli che hanno seguito l'infusione endovenosa²³. I protocolli sono descritti anche per la loro microiniezione nel pesce zebra larvale e nell'imaging vivo per valutare la loro capacità di targeting dei macrofagi e la localizzazione in compartimenti intracellulari necessari per la degradazione liposomica e la somministrazione di farmaci citoplasmici. Come prova di concetto abbiamo usato questa tecnica per indirizzare due farmaci ai macrofagi per sopprimere la loro attivazione in un modello di pesce zebra larvale di infiammazione gotta acuta²⁴. Questa tecnica di somministrazione di farmaci espande il "toolkit" chimico disponibile per i ricercatori di pesci zebra che vogliono garantire il targeting dei macrofagi dei loro farmaci di interesse.

Protocollo

1. Preparazione di Liposomes Marina con carico di droga

NOTA: I liposomi che portano il colorante fluorescente blu, Marina Blue e la droga vengono preparati utilizzando un metodo di idratazione del film sottile con post-inserimento del poloxamer 188. Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente se non diversamente specificato. I liposomi di controllo portano solo Marina blu e PBS. L'esempio qui descrive il caricamento di liposomi con un farmaco antiossidante²⁵ di puntamento ai mitocondri che viene utilizzato nei risultati rappresentativi come un proof-of-concept.

1. Per preparare i liposomi, sciogliere 16,4 mg (22,2 smol) dei fosfolipidi 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (vedi Tabella dei materiali),4.4.3 mg (11,1 mol) di colesterolo (vedi Tabella dei Materiali)e 2,8 mg (3,7 -mol) 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (vedi Tabella dei materiali, in 3 mL di cloroformio:metanolo (3:1 v/v) in un flacone rotondo-inferiore da 25 mL.
2. Alla miscela di cui sopra, aggiungere 31 nmol di Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (vedi Tabella dei materiali)e 300 nmol di un farmaco inibitore mROS (vedi Tabella dei materiali)e sonicare brevemente per sciogliersi completamente. Per i liposomi di controllo, aggiungere solo Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine.
   NOTA: Per evitare il fotosbiancamento del colorante fluorescente Marina Blue sensibile alla luce, proteggere tutte le procedure dalla luce, ove possibile. Questo è anche importante se il farmaco da caricare è sensibile alla luce.
3. Rimuovere lentamente il solvente su un evaporatore rotante (vedi Tabella dei materiali)su un bagno d'acqua a temperatura controllata impostato a 45 gradi centigradi ruotando a 75 giri sotto pressione sotto vuoto (200 mbar per 15 min quindi 0 mbar per 20 min). Questo forma una pellicola lipidica sottile secca all'interno delle pareti di vetro del pallone che viene ulteriormente essiccato per 45 minuti sotto N₂ per facilitare la completa rimozione del solvente organico.
4. Dopo la formazione della pellicola sottile, impostare la pressione del vuoto a 40 mbar per 15 min, quindi spurdare con gas di azoto per 30 min per garantire la rimozione del solvente residuo.
5. Idratare la pellicola sottile utilizzando 1 mL di salina tampone fosforo (PBS, pH 7.4) e sigillare con parafilm prima di agitare il flacone utilizzando un evaporatore rotante su un bagno d'acqua di 60 gradi per 20 min al fine di formare vesciche.
6. Sottoporre la sospensione idratata a 7 cicli di congelamento e scongelamento congelando nel liquido N₂ per 3 min seguito da immersione in un bagno d'acqua a 45 gradi centigradi per 7 min.
7. Estrusive i liposomi attraverso una membrana utilizzando un mini-estrusore (vedi Tabella dei materiali)e 1,0 m di membrane in policarbonato incise da pista (vedi Tabella dei materiali)per 2-6 cicli al fine di ottenere grandi vescicle di unilamellar.
   NOTA: Al fine di ottenere un targeting più favorevole verso i macrofagi, manipolare i cicli di estrusione fino a quando il diametro dei liposomi è di circa 1 m^26,27,28.
8. Condensare i liposomi freschi in un pellet con ultracentrifugazione a 186.000 x g e incubare con 1 mL di 1% poloxamer 188 (vedi Tabella dei materiali) soluzione (vedi Tabella dei materiali)soluzione (10 mg/mL in PBS) a 45 gradi centigradi e 750 rpm per 30 min utilizzando un termomixer con un attacco a 2 mL microcentrico
9. Ultracentrifuga la miscela a 186.000 x g per 1 h a 4 gradi centigradi e rimuovere il supernatante al fine di rimuovere qualsiasi polimero non legato o farmaco. Conservare i liposomi pellet a 4 gradi centigradi, protetti dalla luce.

2. Caratterizzazione delle dimensioni del liposomo e del potenziale di zeta

1. Diluire la formulazione liposomica con acqua ultrapura (1:100) e misurare la dimensione delle particelle, l'indice di polidispersità (PDI) e il potenziale zeta dei liposomi utilizzando un analizzatore di dispersione della luce dinamico (vedi Tabella dei materiali), in triplice copia a 25 gradi centigradi.
   NOTA: Il PDI è una misura della distribuzione delle dimensioni della popolazione di nanoparticelle. I valori PDI < 0.05 indicano una distribuzione più uniforme, mentre i valori più vicini a 1 indicano una distribuzione di dimensioni maggiori. Il potenziale zeta è la carica complessiva della superficie.

3. Calcolo dell'efficienza dell'ingresso e del caricamento dei farmaci nei liposomi

NOTA: Per determinare l'efficienza di intrappolamento del farmaco nei liposomi, viene misurato il contenuto di farmaci contenuto nel pellet supernatale e liposomano.

1. Risospendere il pellet lipososo in 1 mL di PBS.
2. Rimuovere il supernatante, diluire 10 x con acqua ultrapura e analizzare con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
3. Per determinare la concentrazione di droga all'interno dei liposomi, aggiungere 100 l una di sospensione lipososoa a 900 L di 10% soluzione triton-X100 (per distruggere la membrana lipidica, rilasciando il farmaco intrappolato e prevenendo l'accumulo di lipidi all'interno della colonna HPLC) e vortice per 3 minoni prima dell'analisi.
4. Iniettare 20 l di campione in un sistema HPLC costituito da una pompa quaternaria, un termostato autocampionatore e una colonna di 3 m 250 x 4,6 mm. Impostare la fase mobile (10 mPB PBS pH 2.5, acetonitrile e metanolo (30:40:30, v/v/v)) sulla velocità di flusso di 0,9 mL/min e ottenere profili spettrali utilizzando un rilevatore di matrice di diodo impostato su 230 mM.
5. Calcolare l'efficienza di intrappolamento (EE) e il carico di droga (DL) utilizzando le seguenti equazioni:
   EE (%) - [Me / Mt] x 100
   DL (%) : [Me / Mlip] x 100
   Dove Me è la massa di farmaco incapsulato, Mt è la massa totale del farmaco utilizzato durante la formulazione e Mlip è la massa totale dei lipidi (compreso il colesterolo) e farmaco incapsulato.

4. Preparazione e iniezione di liposomi

1. Preparare gli aghi di microiniezione borosilicato inserendo un capillare di vetro borosilicato sottile (1 mm O.D. x 0,78 mm I.D. x 10 cm di lunghezza) in un dispositivo di emissione di micropipette (vedi Tabella dei materiali) con le seguenti impostazioni generiche di trazione (calore 680, pull 75, velocità 40, tempo 55 e pressione 530) per produrre un microiniezione contanto.
2. Mettere gli aghi in un piatto Petri sull'argilla di modellazione e disporre in modo che l'estremità tirata non tocchi il fondo del piatto. Tenere il coperchio del piatto Petri chiuso per evitare la contaminazione da polvere fino a quando non è pronto per l'uso.
3. Diluire le formulazioni lipososo appena preparate 1:1 in PBS sterile (pH 7.4) e per creare brevemente vortice (2-3 s) da mescolare.
   NOTA: Proteggere i liposomi dalla luce fino a quando le larve sono pronte per la microiniezione.
4. Istituire coppie adulte di allevamento di pesci zebra la sera prima e raccogliere gli embrioni come descritto in precedenza da Rosen et al.²⁹.
5. Trasferire gli embrioni in un piatto Petri (100 mm x 20 mm in stile con circa 60 embrioni per piatto) contenente mezzo E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄) integrato con 0,1% di blu di metilene per inibire la crescita fungina. Rimuovere tutti gli embrioni morti o non fecondati e incubare durante la notte a 28,5 gradi centigradi.
6. Per facilitare l'imaging dal vivo, aggiungere 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) ai media E3 quando gli embrioni raggiungono i 24 h di sviluppo per prevenire la formazione di pigmenti (melanizzazione).
7. Dechorionate manualmente gli embrioni a circa 30 h dopo la fecondazione (hpf) utilizzando pinze di punta fine.
   NOTA: Non utilizzare il trattamento enzimatico per dechorinate embrioni in quanto ciò può causare danni epiteliali e infiammazione locale influenzando così gli studi immunologici
8. Lasciare che gli embrioni si sviluppino a 28,5 gradi centigradi fino a 2 giorni dopo la fecondazione (dpf).
9. Preparare una piastra di iniezione versando abbastanza 3% cellulosa metilica (in e3 media) nel coperchio di un piccolo piatto di coltura 35 mm per formare una pellicola sottile che copre l'intera superficie.
   NOTA: Quando si prepara la cellulosa metilico 3% nei media E3, ci vogliono diversi giorni perché la cellulosa metile si dissolva con agitazione delicata su uno shaker orbitale.
10. Anasthetizzare le larve incubando nei media E3 integrato con 200 g/mL di Tricaine.
11. Raccogliere una pozza di circa 20-25 larve utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica e consentire agli embrioni di concentrarsi sulla punta della pipetta per gravità. Avendo cura di trasferire le larve con un liquido minimo, metterle al centro del coperchio del piatto di coltura 35 mm.
12. Utilizzando un caricatore a microcapillare, disporre le larve nei seguenti modi: anteriore verso la parte superiore della piastra di iniezione con la superficie dorsale rivolta verso l'ago di microiniezione, per iniettare nel ventricolo del cervello posteriore (Figura 2A-D); o, anteriore verso sinistra della piastra di iniezione (quando si inietta da destra) con la superficie ventrale rivolta verso l'ago di microiniezione per iniettare nel veleno del seno (Figura 2I).
    NOTA: Se iniettato in questo modo, possono essere presi di mira anche i macrofagi del ventricolo posteriore (Figura 2E) e dei tessuti ematopoietici caudali (CHT)-residente(Figura 2J). La regione CHT del pesce zebra larvale è un sito ematopoietico analogo al fegato fetale dei mammiferi. Prestare particolare attenzione a non danneggiare gli embrioni durante l'organizzazione in quanto ciò può causare infiammazione locale influenzando così gli studi immunologici.
13. Prendere i liposomi appena preparati (dal punto 4.3) e il retro riempire un ago di iniezione con circa 5 anni l della miscela di iniezione liposoma utilizzando un caricatore microcapillare (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: Quando si valuta la localizzazione dei liposomi nei compartimenti phagolysosomi dei macrofagi (Figura 2H), integrare questa miscela di iniezione con 200 g/mL di un marcatore fluorescente rosso di fagosoma (vedi Tabella dei materiali) e 100 nM di un marcatore fluorescente di gran lunga rosso di lisosomi (vedi Tabella dei materiali)per contrassegnare rispettivamente i fagosomi^30,31 e i lisosomi^{32 .}
14. Montare l'ago in un micromanipolatore (vedi Tabella dei materiali) collegato a un supporto magnetico e a un iniettore di pressione (vedere Tabella dei materiali). Posizionare sotto uno stereoscopio e impostare l'iniettore su una durata dell'impulso di circa 50 ms e una pressione di iniezione di circa 40 psi.
15. Tagliare la punta dell'ago di microiniezione con pinze di punta fine pulita per generare un'apertura di circa 5 m di diametro.
16. Calibrare il volume da iniettare iniettando un bolus in una goccia di olio minerale posizionato sopra le linee della griglia di un emocitometro. Regolare la durata dell'impulso e/o la pressione di iniezione fino a quando il diametro del bolus copre 2,5 delle linee della griglia più piccole (corrisponde ad un volume di circa 1 nL).
17. Iniettare con attenzione 1 nL della miscela di iniezione di liposoma nel ventricolo cervello posteriore di ogni larva.
    NOTA: Quando si inietta nel ventricolo del cervello posteriore, fare attenzione a non penetrare troppo ventlarally (oltre il cervello posteriore) in quanto ciò può interrompere la vascolatura sottostante che porta a emorragie. Quando si inietta nel veleno del seno, occorre prestare attenzione per garantire che la punta dell'ago sia appena all'interno del pericardio e non penetrare nel tuorlo.
18. Dopo l'iniezione, trasferire immediatamente le larve iniettate nel supporto E3 aggiungendo un supporto E3 alla piastra di iniezione e agitando delicatamente le larve dalla cellulosa metile utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica.
19. Incubare le larve a 28,5 gradi centigradi (protetti dalla luce) fino all'analisi mediante imaging confocale vivo.

5. Imaging confocale e analisi delle immagini per confermare il targeting macrofago dei liposomi

1. Riscaldare un bagno d'acqua a 50 gradi centigradi.
2. Anestetizza le larve iniettate di liposomi mediante il trasferimento in un nuovo piatto Perti contenente supporti E3 integrati con 0,003% PTU e 200 Tricaine.
3. Preparare il supporto di montaggio dell'imaging dal vivo sciogliendo l'agarose in un supporto di fusione basso dell'1% nei supporti E3, integrato con lo 0,003% di PTU, in un forno a microonde. Mettere nel bagno d'acqua e una volta che la soluzione si è raffreddata a 50 gradi centigradi, aggiungere 200 g/mL di Tricaine.
4. Mantenere il supporto di montaggio nel bagno d'acqua di 50 gradi centigradi per evitare una prematura polimerizzazione dell'agarose.
5. Per rappresentare la superficie dorsale del cervello posteriore su un microscopio confocale dotato di una lente ad immersione dell'acqua (Figura 2E), incorporare le larve come segue: Riempire un piatto di coltura di 35 mm con il mezzo di montaggio (a una profondità di circa 5 mm) e lasciarlo polimerizzare. Scavare una piccola trincea nell'agarose che è di dimensioni sufficienti per ospitare il sacco del tuorlo.
6. Riempire una pipetta di trasferimento di plastica con un supporto di montaggio fuso, espellere una piccola quantità e usarla per raccogliere le larve aestiste. Trasferire immediatamente le larve nel piatto di coltura e orientare le sacche del tuorlo, lato ventrale verso il basso, nei fori scavati, utilizzando una palaforno microcapillare. Periodicamente mantenerli in questa posizione fino a quando l'agarose polimerizza. Sovrapposizione con supporti E3 integrati con 200 sg/mL Tricaine.
   NOTA: Durante il trasferimento e il posizionamento delle larve, fare attenzione a non causare danni epiteliali e infiammazioni locali che possono influenzare gli studi immunologici. Per il posizionamento delle larve per vivere l'immagine della regione CHT (Figura 2J), montare come descritto sopra, ma posizionare le larve all'interno del foro scavato lateralmente.
7. Quando si fa l'imaging in un microscopio confocale invertito, incorporare le larve, senza il letto di agarose, direttamente sul fondo di un piatto di fondo di vetro. Disporli superficie dorsale verso il basso (o lateralmente) e dopo la polimerizzazione, coprire l'intera superficie piatto con uno strato uniforme di supporto di montaggio. Una volta polimerizzato, aggiungere un sottile strato di supporti E3 integrati con 200 g/mL di Tricaine.
8. Per animare dal vivo il ventricolo del cervello posteriore su un microscopio confocale, utilizzare le seguenti impostazioni: 512 x 512 pixel; 40 x 3 s-stacks (estendendosi dalla superficie più dorsale del cervello posteriore); Obiettivo 20x; 2,5 volte lo zoom.
   NOTA: Quando si confrontano le intensità del segnale tra i campioni (ad esempio durante l'imaging dell'assorbimento di liposomi con etichetta blu Marina iniettati all'interno delle linee dei reporter che marcano i macrofagi [Tg (mpeg1:EGFP)³³] o i neutrofili [Tg(lyz:EGFP)³⁴]), è essenziale che le impostazioni laser siano mantenute le stesse (ad es., diametro del foro stenopeico, tensione laser, offset e guadagno) per contribuire a garantire eventuali differenze non sono un artefatto di impostazioni di acquisizione dell'immagine alterate.
9. Utilizzare il software di analisi delle immagini 3D per quantificare l'assorbimento del macrofago o dei neutrofili dei liposomi con etichetta marina Blue. Per quantificare il numero di cellule contenenti liposomi (Figura 2F) all'interno di una pila z, scorrere le singole sezioni di z e contare il numero di singole celle contenenti liposomi con etichetta Marina Blue. Per quantificare l'intensità di fluorescenza dei liposomi all'interno delle cellule (Figura 2G), disegnare una regione di interesse intorno a ciascuna cella (nelle dimensioni X, Y e z) per quantificare l'intensità di fluorescenza totale o media di Marina Blue intracellulare.

Risultati

L'approccio di idratazione delle pellicole sottili descritto qui per la preparazione di liposomi fluorescenti che racchiudono farmaci è un metodo semplice ed economico. Con il protocollo utilizzato in questo studio, i liposomi dovrebbero essere unilamellar^23,24. Le dimensioni, il potenziale di zeta, il carico di droga e l'efficienza di intrappolamento dei liposomi prodotti sono riassunti nella Tabella 1. Le dimensioni delle particelle dei liposo...

Discussione

Qui, abbiamo fornito un protocollo dettagliato per formulare liposomi caricati da farmaci per indirizzare specificamente i macrofagi nel pesce zebra larvale. Questo metodo può essere utilizzato per sezionare il ruolo dei macrofagi in alcuni modelli di malattia garantendo la somministrazione diretta mirata di farmaci specificamente ai macrofagi. Inoltre, può essere utilizzato quando la tossicità generale dei farmaci limita il loro uso quando viene consegnato da percorsi più convenzionali, come l'immersione. Il protoco...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes	GE Healthcare Life Sciences	110610
25 mL round-bottom flask	Sigma-Aldrich	Z278262
35 mm culture dish	Thermo Scientific	150460
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector	Agilent Technologies	G4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump	Agilent Technologies	G1311B
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat	Agilent Technologies	G1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needles	Warner Instruments	203-776-0664
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Dumont No.5 fine tip forceps	Fine Science Tools	11251-10
Eppendorf Microloader pipette tip	Eppendorf	5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels	Eppendorf	4053-6038
eyelash manipulator	Ted Pella Inc.	113
hemocytometer	Hawksley	BS.748
HEPES	BDH Chemicals	441474J
HPLC system	Agilent Technologies	1260 series HPLC system
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1KG
low melting point agarose	Invitrogen	16520-100
LysoTracker Deep Red	Invitrogen	L12492	1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep Red	Thermo Scientific	L12492
magnetic stand	Narishige	GJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)	Invitrogen	M12652	Keep at -20 °C and protect from light.
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0387-500G
methylene blue	Alfa Aesar	42771
MgSO4	Sigma-Aldrich	230391-500G
micromanipulator	Narishige	M-152
mineral oil	Sigma-Aldrich	M-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO	Sigma-Aldrich	SML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator	Thermo Scientific	M36008
MitoTEMPO	Sigma-Aldrich	SML0737	Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629-10G	Take care when handling, toxic.
NaCl	BDH Chemicals	27810.295
PBS (pH 7.4)	Gibco	10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm)	Corning Inc.	430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column	Phenomenex	00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate	Thermo Scientific	P35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate	Invitrogen	P35361	Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipette	Medi'Ray	RL200C
poloxamer 188	BASF Corporation
pressure injector	Applied Scientific Instruments	MPPI-2
rotary evaporator	Büchi, Flawil, Switzerland	Büchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscope	Olympus	Olympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ Ultracentrifuge	Thermo Scientific	75000090
stereomicroscope	Leica	MZ12
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040-25G	Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Ultrasonic bath	Thermo Scientific	FB-11205
Volocity Image Analysis Software	PerkinElmer	version 6.3
water bath
Zetasizer Nano	Malvern Instruments Ltd	Zetasizer Nano ZS ZEN 3600