İnsan Polimorfonükleer Lökositlere Karşı Staphyloccus aureus Sitortoksitesinin Ölçülmesi

Özet

Bu protokol, polimorfonükleer lökositlerin tüm insan kanından arındırılması için bir yöntem ve staphylococcus aureus'un sitotoksisitesini bu önemli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerine karşı ölçen iki ayrı tahlilaçıklamaktadır.

Özet

Staphylococcus aureus, polimorfonükleer lökositlerin (PMN'ler veya nötrofiller) membran bütünlüğünü hedef alan ve bozan çok çeşitli lökocidins salgılayabilme yeteneğine sahiptir. Bu protokol, hem insan PMN'lerinin saflaştırılmasını hem de S. aureus sitotoksisitesinin PMN'lere karşı üç farklı bölümde ölçülmesini açıklar. Bölüm 1, yoğunluk santrifüjü kullanılarak PMN'lerin ve serumun insan kanından izolasyonunu ayrıntılarıyla anlatır. Bölüm 2, S. aureus tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlerin sitotoksisitesini bu saflaştırılmış insan PMN'lerine karşı test eder. Bölüm 3 canlı S. aureus'unfagositotunu takiben insan PMN'lerine karşı sitotoksisiteyi ölçer. Bu işlemler, hücre zarı geçirimsiz bir DNA bağlayıcı florofi olan propidium iyodür ile tedavi edilen PMN'lerin akış sitometri analizini kullanarak S. aureus lökosilikinler tarafından PMN plazma membran bütünlüğünün bozulmasını ölçer. Topluca, bu yöntemler hızla birincil insan PMN'ler karşı S. aureus sitotoksisite test avantajı var ve kolayca konak-patojen etkileşimleri diğer yönlerini incelemek için adapte edilebilir.

Giriş

Staphylococcus aureus insanlarda hastalıkların geniş bir yelpazede neden gram-pozitif bir bakteridir. Bu belirgin patojen enfeksiyonun farklı yönlerine katkıda bulunan çok sayıda virülans faktörleri üretir. Bunlar s. aureus ana doku farklı türde uymak için izin yüzey molekülleri içerir¹, konak bağışıklık yanıtı ile müdahale ekstrasellüler proteinler², ve ana bilgisayar hücrelerinin farklı türde hedef gizli toksinler bir dizi³. Bu raporda, s. aureus tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlerin insan polimorfonükleer lökositlere (PMN'ler veya nötrofiller) karşı ürettiği sitotoksiteyi ölçen bir yöntem tanımlanmıştır.

PMN'ler memelilerde en bol lökosittir. Bu dolaşan bağışıklık hücreleri hızla yerleşik hücreler veya istilacı mikroplara özgü bileşikler tarafından üretilen tehlike sinyalleri yanıt olarak konak doku hakaret sitesine işe alınır. Bu moleküllerden ve ekstravazasyon sırasında aktif yerleşik konak hücreleri ile doğrudan temaslardan ekstrasellüler girişi priming olarak bilinen bir süreç PMN'lerin aktivasyon durumunu artırmak^4,5. Sıkıntılı doku ya da enfeksiyon oluşmasını önlemek için tasarlanmış önemli doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını uygulayan astarlı PMN'ler. Bu bağlama ve içselleştirme, ya da fagositoksis, güçlü antimikrobiyal bileşiklerin bir pil tarafından mikrop imha cumulating hücre içi olayların bir çağlayan tetikleyen işgal mikroorganizmaların^{içerir 5}.

PMN'ler insanları istilacı patojenlerden koruyan önemli bir rol oynar lar ve özellikle S. aureus enfeksiyonunu önlemek için önemlidir^4. Ancak, bu bakteri farklı PMN fonksiyonlarını engelleyen çok çeşitli virülans genleri üretir. Bunlar arasında sinyal moleküllerinin tanınmasını engelleyen, dokubarındırmaya yapışmayı önleyen, antimikrobiyal bileşiklerin üretimini engelleyen ve plazma zarı bütünlüğünü bozan hücre dışı proteinler^{bulunmaktadır 4}. S. aureus, bu virülans genlerinin zamansal ekspresyonunu, belirli çevresel ipuçlarını tanıyan birden fazla iki bileşenli duyu sisteminden gelen kolektif girdi yoluyla yönetir. SaeR / S iki bileşenli sistem enfeksiyon^sırasında S. aureus virülans gen transkripsiyon önemli bir up-regülatör 6^,7,8,9,10,11. Özellikle, bu iki bileşenli sistem özellikle insan PMNs¹²hedef iki bileşenli lökocidins üretimi için kritik olduğu gösterilmiştir.

Bu protokol üç farklı bölüme ayrılmıştır. Birinci bölümde Bøyum¹³ ve Nauseef¹⁴tarafından belirlenen yöntemlerden uyarlanmış bir protokol kullanılarak yoğunluk gradyan santrifüj kullanarak INSAN kanından PMNarsaflaştırma açıklar. İkinci ve üçüncü bölümlerde S. aureus sitotoksisitesini incelemek için iki farklı teknik detay; biri S. aureus tarafından üretilen ekstrasellüler proteinler ile PMN'leri zehirlerken, diğeri fagositoz dan sonra yaşayan bakterilerin PMN'lere zarar verme yeteneğini inceler. Bu işlemler, S. aureus gözenek oluşturan toksinlerin neden olduğu PMN plazma membran bütünlüğünün kaybını ölçmek için propidium iyodür kullanır. Propidium iyodür normalde hücre zarı geçirimsiz ama S. aureus toksinler tarafından bozulmuş plazma membranları çapraz olabilir DNA bağlayıcı florofor. Akış sitometri analizi propidium iyodür-pozitif PMN'lerin hızlı nicelemesi S. aureus suşlarının göreceli sitotoksisitesini ölçmek için izin verir. Metisiline dirençli S. aureus (MRSA) darbeli alan jel elektroforezi tip USA300 ve bu suşta saeR/S izojenik deletion mutantı (USA300ΔsaeR/S)olarak tanımlanan bu işlemlerin S. aureus'un insan PMN'lerine karşı sitotoksisitesini nasıl ölçebileceğini göstermek için model olarak kullanılmıştır.

Protokol

Montana State Üniversitesi İnsan Denekleri Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan protokol uyarınca sağlıklı bağışçılardan heparinize venöz kan toplandı. Tüm bağışçılar bu çalışmaya katılmak için yazılı izin verdi.

1. İnsan polimorfonükleer lökositlerinin saflaştırılması ve insan serumunun izolasyonu

NOT: Tüm reaktifler, ticari olarak kullanılabilen endotoksin algılama kiti kullanılarak endotoksin varlığı rutin olarak kontrol edilmeli ve PMN'lerin istenmeyen astarlanmasını önlemek için <25.0 pg/mL endotoksin içermelidir.

1. %3 dekstran-%0,9 NaCl (w/v), 35 mL %0,9 NaCl (w/v), 20 mL %1,8 NaCl (w/v), 12 mL 1,077 g/mL yoğunluk gradyan çözeltisi ve oda sıcaklığına 20 mL enjeksiyon veya sulama sınıfı su getirin.
2. İnsan serumu izole etmek için, 37 °C'de 37 °C'de 15 mL cam tüpte 4 mL taze çekilmiş insan kanı kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika için 2.000-3.000 × g santrifüj örneği. Üst serum tabakasını taze 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerine yerleştirin.
3. 25 mL taze çekilmiş heparinize (1000 adet/mL) tam insan kanını 25 mL oda sıcaklığında %3 dekstran-0,9% NaCl (1:1 oran) ile iki çoğaltma 50 mL konik santrifüj tüpünde (tüp başına 50 mL toplam hacim) birleştirin. Her 50 mL konik tüpü hafifçe sallayarak karıştırın ve 30 dk oda sıcaklığında bekletin.
4. Oda sıcaklığında kuluçkadan sonra iki ayrı katman görünür. Her dextran-kan karışımının üst tabakasını yeni 50 mL konik tüplere ve santrifüje 450 x g'de 10 dakika oda sıcaklığında düşük veya frensiz olarak aktarın.
5. Dikkatlice hem supernatants aspire ve hücre pelet rahatsız etmeden atın. Her hücre peletini 2 mL oda sıcaklığında %0,9 NaCl'de hafifçe askıya alın, resuspended peletleri tek bir 50 mL konik tüpte birleştirin, sonra kalan %0,9 NaCl'i (35 mL'lik son hacim) ekleyin.
6. El pipeti kullanarak hücre süspansiyonunun altında 1,077 g/mL yoğunluk gradyan çözeltisi 10 mL oda sıcaklığını dikkatlice alt altında türün. Düşük veya hiç frensiz oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 450 x g'de döndürün. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatant'ı hafifçe aspire edin. Supernatant daha önce açıklandığı gibi toplanabilir periferik kan mononükleer hücreleri^{içerecektir 14}.
7. Oda sıcaklığında su 20 mL hücre pelet resuaskıya alarak kırmızı kan hücreleri lyse. 30 s için tüp sallayarak yavaşça karıştırın. Kırmızı kan hücrelerinin lysis bulanıklık belirgin bir azalma eşlik edecek.
8. Hemen oda sıcaklığında 10 dakika için 450 × g de% 1.8 NaCl (oda sıcaklığında [RT]) ve santrifüj örnek 20 mL ekleyin.
   NOT: PMN verimini en üst düzeye çıkarmak ve PMN lysis ve/veya aktivasyonu önlemek için kırmızı kan hücreli lysis'i takiben PMN'lerin tek başına suda bırakıldığı süreyi en aza indirmek önemlidir.
9. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatant'ı dikkatlice aspire edin. Hücre peletini 2 mL'lik RT RPMI 1640 orta ve buz üzerinde yavaşça yeniden askıya alın.
10. Hemositometre kullanarak hücreleri say. 1 x 10⁷ hücre/mL konsantrasyonda buz gibi RPMI ile saflaştırılmış PMN'leri yeniden askıya alın ve buzda tutun.
11. 100 μL saflaştırılmış PMN'yi (1 x 10⁶ hücre) 300 μL buz gibi dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) içeren 1 μL propidium iyodür lekesi içeren iki çoğaltma akış sitometri tüpünde birleştirin. Plazma membran hasarı için pozitif kontrol için, akış sitometri tüplerinden birine 40 μL %0,5 Triton X-100 çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın.
12. Saflaştırılmış hücrelerin ileri saçılım, yan dağılım ve propidium iyodür boyama (535/617 nm de uyarma / emisyon maxima) ölçmek için akış sitometri kullanın(Şekil 1).
    NOT: İleri ve yan dağılım analizi istenmeyen lenfosit ve monosit popülasyonlarını belirleyecektir. Propidium iyodür sadece uzlaşmış plazma zarı ve propidium iyodür pozitif hücrelerin popülasyonları belirgin olan saflaştırılmış PMN'ler ile hücreleri leke olacaktır kullanılmamalıdır. Bu çalışmalarda saflaştırılmış PMN'ler sadece saflaştırılmış hücrelerin >%98'ini, propidium iyodür için ise %5 oranında pozitif çıktıklarında kullanıldı.
13. DPBS ile seyreltilmiş olan 100 μL%20 izole insan serumu ile bu tahlilde kullanılacak tek tek kuyuları kaplayarak PMN sitotoksisite tahlilleri için 96 kuyuluk bir plaka hazırlayın.
    NOT: Doğrudan plastik veya cam üzerine KAPAK PMNs hücrelerin aktivasyonu neden olacaktır. Sadece medya ve% 0.05 Triton X-100 alacaksınız en az bir pozitif kontrol iyi alacak en az bir negatif kontrol iyi dahil emin olun.
14. Plakayı 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, fazla serumu çıkarmak için kaplanmış kuyuları buz gibi DPBS ile iki kez yıkayın. Herhangi bir artık DPBS kaldırmak ve buz üzerinde yer için yavaşça plaka baş aşağı dokunun.
15. Kaplamalı her kuyuya 1 x 10⁷ hücre/mL'de 100 μL saflaştırılmış insan PMN'sini hafifçe ekleyin (1 x 10⁶ PMN/iyi). PMN'lerin en az 5 dakika boyunca plakayı buz üzerinde kuluçkaya yatırarak kuyulara yerleşmelerine izin verin.

2. İnsan polimorfonükleer lökositlere karşı S. aureus ekstrasellüler proteinlerin sitotoksisite töz

1. Kültür S. aureus bir gecede triptik soya suyu (TSB) 37 °C'de bir sallayarak inkübatör kullanarak. Bu çalışmalar için, ayrı 150 mL Erlenmeyer şişelerinde 20 mL TSB, S. aureus suşlarının ABD300 veya USA300ΔsaeR/S'nin donmuş kültürleri ile aşılanmış ve 250 rpm'de sallayarak yaklaşık 14 saat büyümüştür.
2. Subculture S. aureus taze medya ile bir gecede bakteri kültürünün 1:100 seyreltme gerçekleştirerek. Bakteriler erken sabit büyüme aşamasına ulaşana kadar 37 °C'de titreyerek kuluçkaya yatınız.
   NOT: Bu deneyler için, 150 mL Erlenmeyer şişelerinde 20 mL triptik soya suyu 200 μL gecelik kültürlü USA300 veya USA300ΔsaeR/S ile aşılanmış ve 37 °C'de 250 rpm'de 5 saat sallayarak inkülasyon almıştır.
3. Bakteriler erken sabit büyüme aşamasına ulaştığında, 1 mL alt kültürlü S. aureus'u 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe ve 5000 × g'de oda sıcaklığında 5 dakika santrifüje aktarın.
4. Santrifüjden sonra supernatant'ı 3 mL şırıngaya aktarın. Supernatants'ı 0,22 μm'lik bir filtreden geçirerek buz üzerinde yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne geçirin.
5. Kültür S. aureusiçin kullanılan buz gibi medya ile supernatants seri seyreltme gerçekleştirin.
   NOT: Gösterilen deneyler için, USA300 ve USA300ΔsaeR/S'den süpernatantlar buz gibi TSB ile art arda dört adet 1/2 günlük seyreltme yapıldı.
6. 1.15 adımdan itibaren buz üzerinde PMN'ler içeren 96 kuyulu plakanın tek tek kuyularına tek başına süpernatant numuneler veya ortam (negatif ve pozitif kontroller için) ekleyin. Bu deneyler için her kuyuya 10 μL USA300 veya USA300ΔsaeR/S supernatant numuneleri eklenmiştir. Yavaşça kaya plakası kuyularda supernatants dağıtmak ve 37 °C'de kuluçka.
7. İstenilen zamanlarda, kuvözden plakayı çıkarın ve buza yerleştirin. Pozitif kontrol kuyusu için %0,5 Triton X-100'ün 40 μL'sini ekleyin.
8. Plakaya bağlı tüm PMN'leri tamamen çıkarmak için numuneleri her kuyuda hafifçe inip çıkarın, ardından numuneleri 1 μL propidium iyodür içeren 300 μL buz gibi DPBS içeren buz üzerinde sitometri tüpleri akışına aktarın.
9. Akış sitometrisi kullanarak propidium iyodür pozitif PMN'lerin oranını ölçün (Şekil 2A). DNA'ya bağlandığında propidium iyodür 535/617 nm'de uyarma/emisyon ait.

3. S. aureus sitotoksisite fagositoz sonrası insan polimorfonükleer lökositlere karşı

NOT: 600 nm (OD₆₀₀₎optik yoğunluğu ve bakteri konsantrasyonu ile tanımlanan büyüme eğrileri bu test başlamadan önce test edilecek S. aureus suşları için ampirik olarak belirlenmelidir. Bu deneylerin başarısı, od₆₀₀ alt kültürbakterileri kullanarak orta üstel büyüme aşamasında test edilen her S. aureus suşunun eşit konsantrasyonlarda tutarlı bir şekilde hasat ını gerektirir.

1. 2.1.1 ve 2.1.2 adımlarında açıklandığı gibi S. aureus suşları ve alt kültür bakterilerinin bir gecede başlayan kültürleri.
2. Hasat alt kültürlenmiş S. aureus 1 mL kültürlü bakterilerin 1,5 mL mikrosantrifüj tüp ve 5.000 × g oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj aktarArak orta üstel büyüme ulaşmıştır.
   NOT: Büyüme koşullarımız altında, USA300 ve USA300ΔsaeR/S yaklaşık 135 dk kuluçka dan sonra orta üstel büyüme aşamasına ulaşmıştır⁶.
3. Supernatant'ı keserek santrifüjden sonra S. aureus'u yıkayın, DPBS'nin 1 mL'sinde peletli bakterileri yeniden sulandırın, numuneyi 30 s'ye girdaplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika 5 dakika için 5.000 × g'de santrifüj edin.
4. Opsonize S. aureus DPBS ile seyreltilmiş % 20 insan serumu 1 mL bakteriyel pelet resuaskıya ve 15 dakika ajitasyon ile 37 °C'de kuluçka.
5. Oda sıcaklığında 5.000 x g'de 5 dakika santrifüj opsonize edilmiş bakteriler. Yıkama S. aureus supernatant keserek santrifüj aşağıdaki, 1 mL DPBS peletli bakterileri resumize, sonra bakteri pelet tamamen ayrı artı ek bir 30 saniye kadar örnek girdap. Oda sıcaklığında 5 dakika 5 dakika için 5.000 × g centrifuge bakteri.
6. 1 mL RPMI opsonize S. aureus suşları resuspend, bakteriyel pelet tamamen parçalanana kadar örnek girdap, ve daha sonra ek bir 30 s. buz üzerinde bakteri yerleştirin.
7. Seyreltik opsonize S. aureus buz gibi RPMI ile istenilen konsantrasyona suşları. Girdap 30 s ve buz üzerinde yer.
8. Triptik soya agar üzerinde bakterilerin 1:10 seri seyreltme kaplama tarafından opsonize S. aureus konsantrasyonu doğrulayın.
   NOT: Bu testte kullanılan bakterilerin konsantrasyonundaki farklılıklar sonraki PMN plazma membran geçirgenliği üzerinde önemli bir etkiye sahip olabileceğinden(Şekil 3A),test edilen her bir suş konsantrasyonunun her deney için belirlenmesi ve suşlar arasındaki eşdeğer olması çok önemlidir.
9. 1.14 adımdan itibaren buz üzerindeki 96 kuyuluk plakadaki PMN'lere her S. aureus süzmesinden veya RPMI'den (pozitif ve negatif kontroller için) 100°L/kuyuyu yavaşça ekleyin. Yavaşça kaya plaka kuyularda S. aureus dağıtmak için.
10. 4 °C^15'te8 dk için 500 × g plakayı santrifüj ederek fagositoz senkronize edin. Santrifüjden hemen sonra 37 °C'de kuluçka plakası (T = 0).
11. İstenilen zamanlarda, kuvözden plakayı çıkarın ve buza yerleştirin. Pozitif kontrol kuyusu için %0,5 Triton X-100'ün 40 μL'sini ekleyin.
12. Plakaya bağlı tüm PMN'leri tamamen çıkarmak için numuneleri her kuyuda hafifçe inip çıkarın, ardından numuneleri 1 μL propidium iyodür ile 200 μL buz gibi DPBS içeren buz üzerinde sitometri tüpleri akmaya aktarın.
13. Adım 2.9'da açıklandığı gibi akış sitometrisini kullanarak propidium iyodür boyama örneklerini analiz edin.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan prosedürlerin MRSA PFGE tipi USA300 kullanarak insan PMN'lerine karşı S. aureus'un sitotoksisitesini nispeten ölçmek için nasıl kullanılabileceğini ve bu türdeki saeR/S'nin izojenik deletion mutantı (USA300ΔsaeR/S)önceki çalışmalarda nasıl kullanıldığını gösterdik⁶. Bu protokolün 1. Saflaştırılmış PMN'lerin monosit veya lenfositlerle(Şekil 1A,B)kontaminasyonunu göstermek için ileri ve yan dağılım çizimleri kullanıldı ve PMN bütünlüğü propidium iyodür boyama(Şekil 1C)kullanılarak belirlendi. İnsan PMN arınma açıklanan yöntem sürekli 0,5 x 10⁷ için 1 x 10⁸ PMNs >98% saf ve >95% propidium iyodür negatif verim olabilir.

USA300 ve USA300ΔsaeR/S tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlerin sitotoksisitesi, bu protokolün 2. Bu deneyler, USA300 tarafından üretilen ekstrasellüler proteinler ile 30 dk zehirlenmesinden sonra saflaştırılmış PMN'lerin propidium iyodür boyamasında konsantrasyona bağlı bir artış göstermektedir(Şekil 2B). Önceki çalışmalar saer / S iki bileşenli sistem insan PMNs⁶,^10,11,16hedef çok sayıda iki bileşenli lökocidins ifade için önemli olduğunu göstermiştir . Bu önceki bulgularla uyumlu olarak, USA300ΔsaeR/S (Şekil 2B)tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlere maruz kaldıktan sonra çok az propidium iyodür-pozitif PMN saptandı. Diğer deneyler, yaklaşık 30 dakika(Şekil 2C)sonra platolanan USA300 hücre dışı proteinlerin zehirlenmesini takiben lysed PMN'lerin oranında sürekli bir artış olduğunu göstermiştir. USA300ΔsaeR/Starafından üretilen ekstrasellüler proteinlere maruz kaldıktan sonra tüm zaman dilimlerinde insan PMN'lerinin minimal lysis'i belirtilmiştir. Bu sonuçlar, insan PMN'lerine karşı hücre dışı S. aureus proteinleri tarafından sitotoksisitenin göreceli niceliği için bu tahkizin yararını göstermektedir.

Bu protokolün 3. bölümünde açıklanan fagosittoz sonrası insan PMN'lerine karşı S. aureus sitotoksisite testini kullanarak USA300 ve USA300Δsaer/S test ettik(Şekil 3). USA300 fagositozundan sonra propidium iyodür pozitif PMN oranında konsantrasyona bağlı artış 90 dakika sonra gözlendi (Şekil 3A). USA300ΔsaeR/S (Şekil 3A)fagositozunun ardından propidium iyodür pozitif olan PMN'lerin oranında önemli bir azalma gözlenmiştir ve SaeR/S iki bileşenli sistemin insan PMN'lerine karşı S. aureus sitotoksisitesi için önemli olduğunu gösteren diğer sonuçları destekleyen(Şekil 2)^7,11. Daha önce de belirtildiği gibi şekil 3A'dagösterildiği gibi, S. aureus konsantrasyonundaki farklılıklar fagositöz sonrası PMN lysis üzerinde belirgin bir etkiye sahiptir. Bu deneylerin her birinde kullanılan USA300 ve USA300ΔsaeR/S inoculum'un numaralandırması, bu suşlar arasındaki sitotoksisite kontrastının kullanılan bakterilerin konsantrasyonundaki farklılıklardan kaynaklanmadığını göstermiştir(Şekil 3B). Bu bulgular, fagositotis sonrası insan PMN'lerine karşı S. aureus sitotoksisite tözünün insan PMN plazma membran bütünlüğünü tehlikeye atma yeteneğini değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Şekil 1: Saflaştırılmış PMN'lerin akış sitometri analizi. (A) saflaştırılmış insan PMN'leri ve (B) PERiferik kan mononükleer hücreleri ile kasıtlı olarak kontamine olmuş PMN'lerin temsili akış sitometri nokta plotları. (C) Minimal propidium iyodür boyama gösteren temsili akış sitometri histogramı (<%1) %0,05 Triton X-100 (gölgeli kırmızı) ile tedavi edilen PMN'lere kıyasla saflaştırılmış PMN'lerin (gölgeli gri). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: S. aureustarafından üretilen hücre dışı proteinler ile sarhoş PMN'lerin akış sitometri analizi. (A) Media control (gölgeli mavi) ile kuluçka 30 dakika sonra propidium iyodür ile boyanmış PMN'lerin temsili akış sitometri histogramı, 1:110 (gölgeli gri) veya% 0.05 Triton X-100 (gölgeli kırmızı) son konsantrasyonda USA300 supernatant filtreli. (B) 30 dk'lık kuluçkadan sonra, farklı konsantrasyonlarda USA300 veya USA300,saeR/S supernatants ile propidium iyodür pozitif PMN'lerin oranı. (C) Propidium iyodür pozitif PMN'lerin usa300 veya USA300 ile inkübasyonu takiben zaman içinde 1:110'luk son konsantrasyondasaeR/S supernatant oranı. Veriler, iki kuyruklu t-testi ile belirlenen * p ≤ 0.05 ve ** p ≤ 0.005 ile en az 3 ayrı deneyin ortalama ± SEM olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: S. aureusfagositosisi sonrası PMN'lerin akış sitometri analizi. (A) Propidium iyodür pozitif PMN'lerin farklı konsantrasyonlarda ABD300 veya USA300,saeR/S. (B) Panel A.'da gösterilen deneylerde kullanılan opsonize S. aureus suşlarının konsantrasyonu , iki kuyruklu test ile belirlenen 4 ayrı deneyin ortalama ± SEM±si olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Bu protokol, pmn'lerin insan kanından arındırılmasını ve s. aureus'un sitotoksisitesini bu önemli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerine karşı ölçmek için propidium iyodür kullanan iki ayrı tahlilyi tanımlar. Bu işlemlerin başarısı saflaştırılmış PMN'lerin kalitesine ve bu patojen tarafından üretilen S. aureus ve ekstrasellüler proteinlerin uygun şekilde hazırlanmasına bağlıdır. PMN'lerin izolasyonu için, endotoksin kontaminasyonundan arınmış reaktifler kullanarak, hücre preparatlarını nazikçe tedavi ederek ve hücreleri uygun sıcaklıkta tutarak saflaştırma sırasında ve sonrasında PMN aktivasyonunu en aza indirmek önemlidir. PMN aktivasyonu gösteren işaretler saflaştırma sırasında hücrelerin kümelenmesi ve izole hücrelerin% 5'ten fazla propidium iyodür için pozitif leke içerir. PMN'lerin nispeten kısa ömrü nedeniyle, bu hücreler insan kanından izole edilmeli ve aynı gün içinde test edilmelidir. PMN'ler arınma sonrası 3 saatten fazla buzüzerinde bırakılırsa spontan apoptoz belirtileri göstermeye başlayacaktır. Daha önce de belirtildiği gibi, her PMN preparatının, izole hücrelerin saflığını ve bütünlüğünü sağlamak için ileri ve yan dağılım akış sitometri analizi nin yanı sıra propidium iyodür boyama kullanılarak dikkatle değerlendirilmesi çok önemlidir.

S. aureus tarafından iki bileşenli lökocidinlerin ekspresyonu, bu protokolde açıklanan tahliller kullanılarak gözlenen, tehlikeye atılmış PMN plazma membran bütünlüğünün çoğunluğundan sorumludur. Bu toksinlerin ve fenol-çözünür modüler ler gibi diğer gözenek oluşturan peptidlerin ekspresyonundaki değişim, S. aureus suşları arasında insan PMN'lerine karşı sitotoksisite farklılıkları yaratacaktır. Buna ek olarak, s. aureus'un fagositoz tahlillerinde PMN'lere oranı sonraki PMN plazma membran geçirgenliği üzerinde önemli bir etkiye sahiptir(Şekil 3A) ve bu deneyler, alt kültürlü bakterilerin OD_600'ü kullanarak orta üstel büyüme evresinde test edilen her S. aureus suşunun eşit konsantrasyonlarda tutarlı bir şekilde hasat edilmesini gerektirir. Bu hususlar göz önüne alındığında, sitotoksisite tahlilleri başlamadan önce incelenecektir tüm suşları için büyüme eğrileri tanımlamak için çok önemlidir. S. aureus sitotoksisitesini in vitro olarak önemli büyüme farklılıkları gösteren suşlarla analiz etmek için bu yöntemleri önermiyoruz.

USA300 insan PMNs karşı son derece sitotoksik olduğu bilinen öldürücü MRSA izole¹⁵ ve bu suş SaeR / S kaybı önemli ölçüde insan PMNs hedef çok sayıda iki bileşenli lökocidinlerin transkripsiyon azaltır^6,12, bu suşları açıklanan tahlilleri kullanarak sitotoksisite karşılaştırmak için ideal modeller yapma. Ancak, farklı S. aureus izole leri arasında geniş genetik varyasyon vardır ve bu protokollerde ayrıntılı parametreler diğer S. aureus suşları test ederken insan PMN'lerine karşı sitotoksisite önemli değişikliklere neden olmayabilir. Büyüme koşulları, supernatants hacimleri veya PMN'ler için bakteri oranı terzilik S. aureusdiğer suşları kullanarak bu yöntemlerle başarı için gerekli olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container	Baxter	2B1323Q	PMN purification
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps	VWR	89000-044	Used in washing cells
1.8% Sodium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	S5150	PMN purification
12x75mm Culture tubes	VWR	60818-430	Used as flow cytometry tubes
20% (w/w) Dextran	Sigma-Aldrich	D8802	PMN purification
3125 Hand Tally Counter	Traceable Products	3125CC	For counting cells
50 mL conical centrifuge tubes	VWR	89039-656	For dispensing media
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium	FischerScientific	211823	For growing cell cultures
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL	FischerScientific	BD 309657	For filtering supernatants
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Cell counting apparatus
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium	Corning	21-030-CV	Used in washing cells
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02	PMN purification
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets	FischerScientific	13-678-11E	For aspirating liquid
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Millipore Sigma	M0687	Plate for holding experimental samples
OMICRON Syringe Filters	Omicron Scientific	SFPV13R	For filtering supernatants
Propidium iodide	ThermoFisher Scientific	P3566	Membrane impermeable DNA stain
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks	Cole-Parmer	EW-34503-24	For growing cell cultures
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red	Corning	17-105-CV	Used in resuspending cells
Sterile Water for Irrigation, USP	Baxter	2F7113	PMN purification
The Pipette Pump	Bel-Art Products	F37898	For aspirating liquid
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Membrane integrity positive control