Quantifier la cytotoxicité de Staphyloccus aureus contre les leucocytes polymorphes humains

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour la purification des leucocytes polymorphes du sang humain entier et deux essais distincts qui quantifient la cytotoxicité de Staphylococcus aureus contre ces cellules immunitaires innées importantes.

Résumé

Staphylococcus aureus est capable de sécréter un large éventail de leucocidins qui ciblent et perturbent l'intégrité de la membrane des leucocytes polymorphes (PMN ou neutrophiles). Ce protocole décrit à la fois la purification des PMN humains et la quantification de la cytotoxicité de S. aureus contre les PMN dans trois sections différentes. La section 1 détaille l'isolement des PMN et du sérum du sang humain à l'aide de centrifugation de densité. La section 2 teste la cytotoxicité des protéines extracellulaires produites par S. aureus par rapport à ces PMN humains purifiés. La section 3 mesure la cytotoxicité par rapport aux PMN humains à la suite de la phagocytose de S. aureusvivant. Ces procédures mesurent la perturbation de l'intégrité de membrane de plasma de PMN par S. aureus leukocidins utilisant l'analyse de cytométrie d'écoulement des PMNs traités avec l'iodure de propidium, un fluorophore de liaison d'ADN qui est imperméable de membrane de cellules. Collectivement, ces méthodes ont l'avantage de tester rapidement la cytotoxicité de S. aureus contre les PMN humains primaires et peuvent être facilement adaptées pour étudier d'autres aspects des interactions hôte-pathogène.

Introduction

Staphylococcus aureus est une bactérie Gram-positive qui provoque un large éventail de maladies chez l'homme. Cet agent pathogène de premier plan produit de nombreux facteurs de virulence qui contribuent à différents aspects de l'infection. Il s'agit notamment de molécules de surface qui permettent à S. aureus d'adhérer à différents types de tissu hôte¹, protéines extracellulaires qui interfèrent avec la réponse immunitaire de l'hôte², et un tableau de toxines sécrétées qui ciblent différents types de cellules hôtes³. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode qui quantifie la cytotoxicité des protéines extracellulaires produites par S. aureus contre les leucocytes polymorphes humains (PMN souvers ou neutrophiles), cellules effectrices primaires de la réponse immunitaire innée de l'hôte.

Les PMN sont les leucocytes les plus abondants chez les mammifères. Ces cellules immunitaires circulantes sont rapidement recrutées sur le site de l'insulte de tissu hôte en réponse aux signaux de danger produits par les cellules résidentes ou par des composés uniques aux microbes envahissants. L'entrée extracellulaire de ces molécules et des contacts directs avec les cellules hôtes résidentes activées pendant l'extravasation augmentent l'état d'activation des PMN dans un processus connu sous le nom d'amorçage^4,5. Les PMN d'apaisement qui ont atteint le tissu affligé exécutent alors les réponses immunitaires innées importantes conçues pour empêcher l'établissement de l'infection. Il s'agit notamment de la liaison et l'internalisation, ou phagocytose, des micro-organismes envahisseurs qui déclenche une cascade d'événements intracellulaires cumulant dans la destruction des microbes par une batterie de puissants composés antimicrobiens⁵.

Les PMN jouent un rôle essentiel pour protéger les humains contre les agents pathogènes envahissants et sont particulièrement importants pour prévenir l'infection à S. aureus ⁴. Cependant, cette bactérie produit un large éventail de gènes de virulence qui entravent différentes fonctions PMN. Ceux-ci incluent les protéines extracellulaires qui bloquent la reconnaissance des molécules de signalisation, empêchent l'adhérence à l'emformation de l'hôte du tissu, inhibent la production de composés antimicrobiens, et compromettent l'intégrité de la membrane plasmatique⁴. S. aureus orchestre l'expression temporelle de ces gènes de virulence à travers l'entrée collective de plusieurs systèmes sensoriels à deux composantes qui reconnaissent des indices environnementaux spécifiques. Le système à deux composants SaeR/S est un important régulateur de la transcription du gène de la virulence de S. aureus lors de l'infection^{6,7,8,9,10,11}. En particulier, ce système à deux composants s'est avéré essentiel pour la production de leukocidins bicomposants qui ciblent spécifiquement les PMN humains¹².

Ce protocole est divisé en trois sections différentes. La première section décrit la purification des PMN à partir du sang humain à l'aide de la centrifugation du gradient de densité à l'aide d'un protocole qui a été adapté à partir de méthodes établies par le bôyum¹³ et le Nauseef¹⁴. Les deuxième et troisième sections détaillent deux techniques différentes pour examiner la cytotoxicité de S. aureus ; l'un enivre les PMN avec des protéines extracellulaires produites par S. aureus tandis que l'autre examine la capacité des bactéries vivantes à endommager les PMN à la suite de la phagocytose. Ces procédures utilisent l'iodure de propidium pour mesurer la perte de l'intégrité de la membrane plasmatique PMN causée par les toxines formant des pores de S. aureus. Propidium iodide est un fluorophore liant l'ADN qui est normalement membrane cellulaire imperméable, mais peut traverser les membranes plasmatiques qui ont été perturbés par les toxines S. aureus. L'analyse de la cytométrie des flux permet la quantification rapide des PMN positifs en iodure de propidium pour mesurer la cytotoxicité relative des souches de S. aureus. Le S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) identifié comme électrophoresis de gel pulsé USA300 et mutant de la délétion isogénique de saeR/S dans cette souche (USA300MDsaeR/S)ont été utilisés comme modèles pour démontrer comment ces procédures peuvent quantifier la cytotoxicité de S. aureus contre les PMN humains.

Protocole

Le sang veiné héparinisé de donneurs en bonne santé a été recueilli conformément au protocole approuvé par la Commission d'examen institutionnel pour les sujets humains à l'Université d'État du Montana. Tous les donateurs ont donné leur consentement écrit pour participer à cette étude.

1. Purification des leucocytes polymorphes humains et isolement du sérum humain

REMARQUE : Tous les réactifs doivent être systématiquement vérifiés pour la présence d'endotoxine à l'aide d'un kit de détection d'endotoxines disponible dans le commerce et doivent contenir une endotoxine de 25,0 pg/mL pour prévenir l'amorçage indésirable des PMN.

1. Apportez 50 ml de 3 % de dextran-0,9 % NaCl (w/v), 35 ml de 0,9 % NaCl (w/v), 20 ml de 1,8 % NaCl (w/v), 12 ml de 1,077 g/mL de gradient de densité, et 20 ml d'eau de qualité injection ou d'irrigation à température ambiante.
2. Pour isoler le sérum humain, incuber 4 ml de sang humain fraîchement prélevé sans anticoagulant à 37 oC dans un tube de verre de 15 ml pendant 30 min. Après l'incubation, l'échantillon de centrifugeuses de 2 000 à 3 000 g pendant 10 min à température ambiante. Transférer la couche supérieure de sérum dans un tube conique frais de centrifugeuse de 15 ml et placer sur la glace.
3. Mélanger 25 mL de sang humain entier fraîchement dessiné (1000 unités/mL) avec 25 ml de température ambiante 3 % dextran-0,9 % NaCl (1:1 ratio) en deux répliques de tubes coniques centrifugeuses de 50 ml (50 mL de volume total par tube). Mélanger en berçant doucement chaque tube conique de 50 ml, puis laisser reposer à température ambiante pendant 30 min.
4. Après l'incubation à température ambiante, deux couches distinctes apparaîtront. Transférer la couche supérieure de chaque mélange dextran-sang dans de nouveaux tubes coniques de 50 ml et centrifugeuse à 450 x g pendant 10 min à température ambiante avec des freins bas ou nuls.
5. Aspirez soigneusement les deux supernatants et jetez sans déranger les granulés cellulaires. Resuspendre délicatement chaque granule de cellule dans 2 ml de température ambiante 0,9 % NaCl, mélanger les granulés en suspension dans un seul tube conique de 50 ml, puis ajouter le naCl de 0,9 % restant (volume final de 35 ml).
6. Sous-poser soigneusement 10 ml de température ambiante de 1,077 g/mL de solution de gradient de densité sous la suspension cellulaire à l'aide d'une pipette à main. Faire tourner à 450 x g pendant 30 min à température ambiante avec des freins bas ou nuls. Aspirez doucement le supernatant sans déranger la pastille cellulaire. Supernatant contiendra des cellules mononucléaires sanguines périphériques qui peuvent être recueillies comme précédemment décrit¹⁴.
7. Lyser les globules rouges en rependant la pastille cellulaire dans 20 ml d'eau à température ambiante. Mélanger délicatement en berçant le tube pendant 30 s. La lyse des globules rouges s'accompagnera d'une nette diminution de la turbidité.
8. Ajouter immédiatement 20 ml de 1,8 % de NaCl (à température ambiante [RT]) et un échantillon de centrifugeuse à 450 g pendant 10 min à température ambiante.
   REMARQUE : Il est important de réduire au minimum le temps que les PMN sont laissés dans l'eau seuls après la lyse des globules rouges afin de maximiser le rendement des PMN et de prévenir la lyse et/ou l'activation des PMN.
9. Aspirez soigneusement le supernatant sans déranger la pastille cellulaire. Resuspendre doucement le granule cellulaire dans 2 ml de RT RPMI 1640 moyen et placer sur la glace.
10. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Resuspendre les PMN purifiés à une concentration de 1 x 10⁷ cellules/mL avec le RPMI glacé et garder sur la glace.
11. Combiner 100 L de PMN purifiés (1 x 10⁶ cellules) avec 300 l de salline tamponnée par le phosphate (DPBS) de Dulbecco, qui contient 1 l de tache d'iodure de propidium dans deux tubes de cytométrie à débit répliqué. Pour un contrôle positif des dommages causés par la membrane plasmatique, ajouter 40 'L de 0,5% triton X-100 solution dans l'un des tubes de cytométrie de flux et mélanger soigneusement.
12. Utiliser la cytométrie du débit pour mesurer la diffusion vers l'avant, la diffusion latérale et la coloration de l'iodure de propidium (maxima d'excitation/émission à 535/617 nm) des cellules purifiées (figure 1).
    REMARQUE : L'analyse de la diffusion vers l'avant et latérale permettra d'identifier les populations indésirables de lymphocytes et de monocytes. L'iodure de propidium ne tachera que les cellules munies d'une membrane plasmatique compromise et les PMN purifiés qui ont des populations prononcées de cellules positives à l'iodure de propidium. Pour ces études, les PMN purifiés n'ont été utilisés que s'ils comprenaient des cellules purifiées et des souillées positives pour le propidium.
13. Préparer une plaque de 96 puits pour les tests de cytotoxicité PMN en enrobant les puits individuels qui seront utilisés dans cet analyse avec 100 L de sérum humain isolé de 20 % qui a été dilué avec DPBS.
    REMARQUE : Le plaquage des PMN directement sur le plastique ou le verre provoquera l'activation des cellules. Assurez-vous d'inclure au moins un puits de contrôle négatif qui ne recevra que les médias et au moins un puits de contrôle positif qui recevra 0,05% Triton X-100.
14. Incuber la plaque à 37 oC pendant 30 min. Après l'incubation, laver les puits enduits deux fois avec du DPBS glacé pour enlever tout excès de sérum. Appuyez doucement sur la plaque à l'envers pour enlever tout DPBS résiduel et placez-la sur la glace.
15. Ajouter délicatement 100 L de PMN humains purifiés à 1 x 10⁷ cellules/mL à chaque puits enduit (1 x 10⁶ PMN/puits). Permettre aux PMN de s'installer dans les puits en couvant la plaque sur la glace pendant au moins 5 min. Maintenir le niveau de la plaque pour permettre une distribution uniforme des cellules dans chaque puits et laisser sur la glace pour éviter l'activation non désirée des PMN.

2. Essai de cytotoxicité des protéines extracellulaires de S. aureus contre les leucocytes polymorphonucléaires humains

1. Culture S. aureus pendant la nuit dans le bouillon de soja tryptique (TSB) à l'aide d'un incubateur secouant réglé à 37 oC. Pour ces études, 20 mL de BST en flacons Erlenmeyer séparés de 150 mL ont été inoculés avec des cultures congelées de souches de S. aureus USA300 ou USA300MDsaeR/S et ont poussé pendant environ 14 h avec des secousses à 250 tr/min.
2. Sous-culture S. aureus en effectuant une dilution 1:100 de la culture bactérienne du jour au lendemain avec des médias frais. Incuber à 37 oC en secouant jusqu'à ce que la bactérie atteigne la phase de croissance stationnaire précoce.
   REMARQUE : Pour ces expériences, 20 ml de bouillon de soja tryptique dans 150 mL de flacons Erlenmeyer ont été inoculés avec 200 OL d'USA300 cultivés pendant la nuit ou USA300SaeR/S et incubés à 37 oC avec des secousses à 250 tr/min pendant 5 h.
3. Lorsque les bactéries ont atteint la phase de croissance stationnaire précoce, transférer 1 ml de S. aureus sous-cultivé dans un tube de microcentrifuge et une centrifugeuse de 1,5 ml à 5 000 g pendant 5 min à température ambiante.
4. Après centrifugation, transférer le supernatant dans une seringue de 3 ml. Passer les supernatants à travers un filtre de 0,22 m et dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 ml sur la glace.
5. Effectuer des dilutions en série de supernatants avec des médias glacés utilisés pour la culture S. aureus.
   REMARQUE : Pour les expériences présentées, les supernatants d'USA300 et d'USA300SaeR/S ont subi quatre dilutions consécutives de 1/2 de billots avec le BST glacé.
6. Ajouter délicatement des échantillons de supernatant ou des supports seuls (pour des contrôles négatifs et positifs) aux puits individuels de la plaque de 96 puits contenant des PMN sur la glace à partir de l'étape 1.15. Pour ces expériences, 10 échantillons de supernatant USA300 ou USA300MDont été ajoutés à chaque puits. Plaque de roche délicate pour distribuer les supernatants dans les puits et incuber à 37 oC.
7. Aux heures désirées, retirer la plaque de l'incubateur et la placer sur la glace. Ajouter 40 'L de 0.5% Triton X-100 au bien de contrôle positif.
8. Faites doucement la pipette les échantillons de haut en bas dans chaque puits pour retirer complètement tous les PMN adhérés à la plaque, puis transférez les échantillons dans des tubes de cytométrie d'écoulement sur la glace qui contiennent 300 L de DPBS glacé avec 1 l d'iodure de propidium.
9. Mesurer la proportion de PMN positifs à l'iodure propidium à l'aide de la cytométrie du débit (figure 2A). Lorsqu'il est lié à l'ADN, le propidium iodide a une excitation/émission de 535/617 nm.

3. S. aureus cytotoxicité test contre les leucocytes polymorphes humains suite à la phagocytose

REMARQUE : Les courbes de croissance définies par la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) et la concentration de bactéries doivent être déterminées empiriquement pour que les souches de S. aureus soient testées avant de commencer cet essai. Le succès de ces expériences nécessite la récolte constante de concentrations égales de chaque souche de S. aureus testée à mi-exponentielle phase de croissance à l'aide de l'OD₆₀₀ de bactéries sous-cultivées.

1. Commencez les cultures du jour au lendemain des souches de S. aureus et des bactéries de sous-culture telles que décrites dans les étapes 2.1.1 et 2.1.2.
2. Récolte sous-culture S. aureus quand il a atteint une croissance mi-exponentielle en transférant 1 ml de bactéries cultivées à un tube microcentrifuge de 1,5 ml et en centrifugeant à 5 000 g pendant 5 min à température ambiante.
   REMARQUE : Dans nos conditions de croissance, USA300 et USA300MDsaeR/S ont atteint la phase de croissance à mi-exponentielle après environ 135 min d'incubation⁶.
3. Laver S. aureus après centrifugation en aspirant le supernatant, en reconpendant les bactéries granulées dans 1 ml de DPBS, en faisant du vortex l'échantillon pendant 30 s, et en centrifugeant à 5 000 g pendant 5 min à température ambiante.
4. Opsoniser S. aureus en reconpendant la pastille bactérienne dans 1 ml de sérum humain dilué à 20 % de sérum humain dilué avec dPBS et en couvant à 37 oC avec de l'agitation pendant 15 min.
5. Centrifugeuse bactéries opsonisées à 5 000 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Laver S. aureus après centrifugation en aspirant le supernatant, en reconpendant les bactéries granulées dans 1 mL DPBS, puis vortex l'échantillon jusqu'à ce que la pastille bactérienne est complètement brisée plus 30 secondes supplémentaires. Bactéries centrifugeuses à 5 000 g pendant 5 min à température ambiante.
6. Resuspendre les souches opsonisées de S. aureus dans 1 mL de RPMI, vortex l'échantillon jusqu'à ce que la granule bactérienne soit complètement brisée, puis pour 30 s supplémentaires. Placez les bactéries sur la glace.
7. Diluer les souches opsonisées de S. aureus à la concentration désirée avec le RPMI glacé. Vortex pour 30 s et placer sur la glace.
8. Confirmer la concentration de S. aureus opsonisé en placage 1:10 dilutions sérielles de bactéries sur l'agar de soja tryptique.
   REMARQUE : Étant donné que les différences dans la concentration des bactéries utilisées dans cet essai peuvent avoir un impact majeur sur la perméabilité ultérieure de la membrane plasmatique PMN (figure 3A),il est très important que la concentration de chaque souche testée soit déterminée pour chaque expérience et soit équivalente entre les souches.
9. Ajouter délicatement 100 l/puits de chaque souche de S. aureus ou RPMI (pour les contrôles positifs et négatifs) aux PMN dans la plaque de 96 puits sur la glace à partir de l'étape 1.14. Plaque de roche délicate pour distribuer S. aureus dans les puits.
10. Synchroniser la phagocytose en centrifuant la plaque à 500 g pendant 8 min à 4 oC¹⁵. Incuber la plaque à 37 oC immédiatement après la centrifugation (T à 0).
11. Aux heures désirées, retirer la plaque de l'incubateur et la placer sur la glace. Ajouter 40 'L de 0.5% Triton X-100 au bien de contrôle positif.
12. Faites doucement pipette les échantillons de haut en bas dans chaque puits pour retirer complètement tous les PMN adhérés à la plaque, puis transférer les échantillons à des tubes de cytométrie d'écoulement sur la glace contenant 200 L de DPBS glacé avec 1 l d'iodure de propidium.
13. Analyser les échantillons pour la coloration de l'iodide de propidium à l'aide de la cytométrie du débit tel que décrit à l'étape 2.9.

Résultats

Nous avons démontré comment les procédures décrites ci-dessus peuvent être utilisées pour quantifier relativement la cytotoxicité de S. aureus contre les PMN humains utilisant LE SARM PFGE-type USA300 et un mutant de suppression isogénique de saeR/S dans cette souche (USA300MDsaeR/S) généré dans des études précédentes⁶. Les PMN isolés à l'aide des procédures décrites à la section 1 de ce protocole ont été tachés d'iodure de propidium et examinés à l'aide de la cytométrie du débit. Des parcelles de diffusion vers l'avant et latérales ont été utilisées pour illustrer la contamination des PMN purifiés par des monocytes ou des lymphocytes(figure 1A,B)et l'intégrité du PMN a été déterminée à l'aide de la coloration de l'iodure de propidium (figure 1C). La méthode décrite de purification humaine de PMN peut uniformément produire 0.5 x 10⁷ à 1 x 10⁸ PMNs qui sont 'gt;98% pur et sont 'gt;95% propidium iodide négatif.

La cytotoxicité des protéines extracellulaires produites par USA300 et USA300SDsaeR/S a été testée contre des PMN purifiés (figure 2) suivant les procédures décrites à la section 2 de ce protocole. Ces expériences démontrent une augmentation dépendante de la concentration de la coloration de l'iodure de propidium des PMN purifiés après 30 minutes d'intoxication avec des protéines extracellulaires produites par USA300 (Figure 2B). Des études antérieures ont démontré que le système à deux composants SaeR/S est important pour l'expression de nombreuses leucocidines bicomposants qui ciblent les PMN humains^6,10,11,16. Conformément à ces résultats antérieurs, très peu de PMN positifs à l'iodure de propidium ont été détectés à la suite d'une exposition à des protéines extracellulaires produites par USA300S/S (Figure 2B). D'autres expériences ont démontré une augmentation constante de la proportion de PMN lysés à la suite d'une intoxication par usa300 protéines extracellulaires qui ont plafonné après environ 30 min (figure 2C). Une lyse minimale des PMN humains a été notée à tous les momentssuivant l'exposition aux protéines extracellulaires produites par USA300S/S . Ces résultats illustrent l'utilité de cet analyse pour la quantification relative de la cytotoxicité par les protéines extracellulaires de S. aureus contre les PMN humains.

Nous avons testé USA300 et USA300MDsaeR/S en utilisant le test de cytotoxicité De S. aureus contre les PMN humains suivant la phagocytose qui est décrite dans la section 3 de ce protocole (figure 3). Une augmentation dépendante de la concentration de la proportion de PMN positifs à l'iodure de propidium a été observée 90 min après la phagocytose d'USA300 (figure 3A). Une diminution significative a été observée dans la proportion de PMN qui étaient positifs en iodure de propidium à la suite de la phagocytose de USA300MDsaeR/S (figure 3A), à l'appui d'autres résultats qui indiquent que le système à deux composants SaeR/S est important pour la cytotoxicité de S. aureus contre les PMN humains (Figure 2)^7,11. Comme mentionné précédemment et démontré à la figure 3A, les différences dans la concentration de S. aureus ont un impact prononcé sur la lyse PMN à la suite de la phagocytose. L'énumération de l'inoculum USA300 et USA300MDsaeR/S utilisé dans chacune de ces expériences a démontré que le contraste de cytotoxicité entre ces souches n'était pas dû à des différences dans la concentration des bactéries utilisées (Figure 3B). Ces résultats montrent comment l'analyse de cytotoxicité de S. aureus contre les PMN humains suivant la phagocytose peut être employée pour évaluer la capacité des différentes souches de S. aureus à compromettre l'intégrité humaine de membrane de plasma de PMN.

Figure 1 : Analyse de cytométrie des flux des PMN purifiés. Des parcelles de points cytométrie représentatives de (A) ont purifié des PMN humains et (B) des PMN qui ont été volontairement contaminés par des cellules mononucléaires sanguines périphériques. (C) Histogramme de cytométrie de flux représentatif démontrant la coloration minimale d'iodure de propidium (lt;1%) des PMN purifiés (gris ombragé) par rapport aux PMN traités avec 0,05% De Triton X-100 (rouge ombragé). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Analyse de cytométrie de flux des PMN intoxiqués avec des protéines extracellulaires produites par S. aureus. (A) Histogramme de cytométrie de flux représentatif de PMNs tachés d'iodure de propidium après 30 min d'incubation avec contrôle des médias (bleu ombragé), supernatant USA300 filtré à une concentration finale de 1:110 (gris ombragé), ou 0,05% Triton X-100 (rouge ombragé). (B) La proportion de PMN positifs à l'iodide au propidium après 30 min d'incubation avec différentes concentrations de supernatants USA300 ou USA300-saeR/S. (C) La proportion de PMN positifs à l'iodide propidium au fil du temps après l'incubation avec USA300 ou USA300saeR/S supernatant à une concentration finale de 1:110. Les données sont présentées comme étant la moyenne de seM d'au moins 3 expériences distinctes avec un test t à deux queues, p. 0,05 et 0,005. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Analyse de cytométrie de flux des PMN suivant la phagocytose de S. aureus. (A) La proportion de PROPidium iodide positif PMN 90 min après la phagocytose de différentes concentrations d'USA300 ou USA300SS/ S. (B) Concentration de souches opsonisées de S. aureus utilisées pour les expériences présentées dans le panneau A. Les données sont présentées comme moyennes - SEM de 4 expériences distinctes avec le test desaeR p 0,01 comme déterminé par le test à deux queues. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Ce protocole décrit la purification des PMN du sang humain et deux essais distincts qui emploient l'iodure de propidium pour quantifier la cytotoxicité de S. aureus contre ces cellules immunitaires innées importantes. Le succès de ces procédures dépendra de la qualité des PMN purifiés et de la préparation appropriée de S. aureus et de protéines extracellulaires produites par cet agent pathogène. Pour l'isolement des PMN, il est important de minimiser l'activation des PMN pendant et après la purification en utilisant des réactifs exempts de contamination par l'endotoxine, en traitant les préparations cellulaires en douceur et en maintenant les cellules à la température appropriée. Les signes qui indiquent l'activation des PMN incluent l'agglutination des cellules pendant la purification et quand plus de 5% de cellules isolées tachent positive pour l'iodure de propidium. En raison de la durée de vie relativement courte des PMN, ces cellules doivent être isolées du sang humain et testées dans la même journée. Les PMN commenceront à montrer des signes d'apoptose spontanée s'ils sont laissés sur la glace pendant plus de 3 h après la purification. Comme mentionné précédemment, il est très important que chaque préparation PMN soit soigneusement évaluée à l'aide de l'analyse de cytométrie du débit de la diffusion vers l'avant et latérale ainsi que de la coloration de l'iodure de propidium pour assurer la pureté et l'intégrité des cellules isolées.

L'expression des leukocidins bicomposants par S. aureus est responsable de la majorité de l'intégrité compromise de membrane de plasma de PMN qui est observée utilisant les essais décrits dans ce protocole. La variation de l'expression de ces toxines et d'autres peptides formant des pores, tels que les modulins solubles dans le phénol, entre les souches de S. aureus produira des différences de cytotoxicité par rapport aux PMN humains. Des écarts significatifs pendant la croissance in vitro entre les souches de S. aureus influenceront également l'expression des toxines formant des pores et la cytotoxicité subséquente. En outre, le rapport entre S. aureus et les PMN dans les essais de phagocytose a un impact majeur sur la perméabilité subséquente de la membrane plasmatique PMN (figure 3A) et ces expériences nécessitent la récolte constante de concentrations égales de chaque souche de S. aureus testée à mi-exponentielle en utilisant l'OD₆₀₀ de bactéries sous-cultivées. Compte tenu de ces considérations, il est très important de définir les courbes de croissance pour toutes les souches qui seront examinées avant de commencer les essais de cytotoxicité. Nous ne recommandons pas ces méthodes pour analyser la cytotoxicité de S. aureus avec des souches qui présentent des différences significatives de croissance in vitro.

USA300 est un isolat virulent de SARM qui est connu pour être fortement cytotoxique contre les PMN humains¹⁵ et la perte de SaeR/S dans cette souche réduit considérablement la transcription de nombreuses leucocidins bi-composants qui ciblent les PMN humains^6,12, ce qui rend ces souches modèles idéales pour comparer la cytotoxicité en utilisant les essais décrits. Cependant, il existe une grande variation génétique entre les différents isolats de S. aureus et les paramètres détaillés dans ces protocoles peuvent ne pas entraîner de changements substantiels de cytotoxicité par rapport aux PMN humains lors de l'essai d'autres souches de S. aureus. L'adaptation des conditions de croissance, des volumes de supernatants ajoutés, ou le rapport des bactéries aux PMN peut être nécessaire pour le succès avec ces méthodes utilisant d'autres souches de S. aureus.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container	Baxter	2B1323Q	PMN purification
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps	VWR	89000-044	Used in washing cells
1.8% Sodium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	S5150	PMN purification
12x75mm Culture tubes	VWR	60818-430	Used as flow cytometry tubes
20% (w/w) Dextran	Sigma-Aldrich	D8802	PMN purification
3125 Hand Tally Counter	Traceable Products	3125CC	For counting cells
50 mL conical centrifuge tubes	VWR	89039-656	For dispensing media
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium	FischerScientific	211823	For growing cell cultures
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL	FischerScientific	BD 309657	For filtering supernatants
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Cell counting apparatus
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium	Corning	21-030-CV	Used in washing cells
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02	PMN purification
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets	FischerScientific	13-678-11E	For aspirating liquid
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Millipore Sigma	M0687	Plate for holding experimental samples
OMICRON Syringe Filters	Omicron Scientific	SFPV13R	For filtering supernatants
Propidium iodide	ThermoFisher Scientific	P3566	Membrane impermeable DNA stain
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks	Cole-Parmer	EW-34503-24	For growing cell cultures
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red	Corning	17-105-CV	Used in resuspending cells
Sterile Water for Irrigation, USP	Baxter	2F7113	PMN purification
The Pipette Pump	Bel-Art Products	F37898	For aspirating liquid
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Membrane integrity positive control