C2C12 Myoblast Hücre Hattında Ki Ekstrasellüler Matriks Proteinlerini Kodlayan Genlerin Kararlı Nakavtı Küçük Saç Tokası (sh)RNA

Özet

C2C12 miyoblastlarında küçük saç tokası (sh) RNA kullanarak hücre dışı matriks (ECM) proteinlerini kodlayan genleri yere sermek için bir protokol sağlıyoruz. ADAMTSL2'yi örnek olarak hedefleyerek, C2C12 miyoblastı sırasında mRNA, protein ve hücresel düzeydeki nakavt etkinliğinin doğrulanması ve miyotube farklılaşması na yönelik yöntemleri tanımlıyoruz.

Özet

Ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri iskelet kas gelişimi ve homeostaz için çok önemlidir. C2C12 miyoblastlarında ECM proteinleri için kodlayan genlerin kararlı nakavt iskelet kas gelişiminde bu proteinlerin rolünü incelemek için uygulanabilir. Burada, C2C12 hücrelerinde küçük saç tokası (sh) RNA kullanarak ECM proteini ADAMTSL2'yi bir örnek olarak tüketen bir protokol uyguluyoruz. shRNA plazmidlerinin transfeksiyonundan sonra, kararlı hücreler puromisin kullanılarak toplu olarak seçilmiştir. Bu hücre hatlarının bakımını ve mRNA ekspresyonu, protein ekspresyonu ve C2C12 farklılaşması ile testotipik analizini de tanımlıyoruz. Yöntemin avantajları istikrarlı C2C12 knockdown hücrelerinin nispeten hızlı nesil ve hücre kültürü ortamda serum tükenmesi üzerine multinükleli miyotüpler içine C2C12 hücrelerinin güvenilir farklılaşması vardır. C2C12 hücrelerinin farklılaşması parlak alan mikroskobu ile ve MiyoD, miyojenin veya miyozin ağır zincir (MyHC) gibi kanonik marker genlerin ekspresyon düzeyleri ölçülerek, C2C12 miyoblastiasyonunun miyotüplere doğru ilerlemesini gösteren izlenebilir. Küçük interferans (si) RNA ile genlerin geçici nakavt aksine, daha sonra C2C12 farklılaşma sırasında veya myotube olgunlaşma sırasında ifade edilen genler daha verimli shRNA ifade C2C12 hücreleri üreterek hedeflenebilir. Yöntemin sınırlamaları, CRISPR/Cas9'a dayalı gen nakavt stratejileri kullanılarak aşılabilecek spesifik shRNA'ya bağlı olarak nakavt verimliliğindeki değişkenlik ve shRNA'nın göz önünde bulundurulması gereken potansiyel hedef dışı etkileridir.

Giriş

Hücre dışı matriks (ECM) proteinleri tüm dokular için yapısal destek sağlar, hücre-hücre iletişimine aracılık eder ve hücre kaderini belirler. Oluşumu ve ECM dinamik remodeling böylece doku ve organ homeostaz korumak için önemlidir^1,2. ECM proteinleri için kodlayan çeşitli genlerdeki patolojik varyantlar kas distrofilerinden psödomousküler yapıya kadar çeşitli fenotiplerle kas-iskelet sistemi bozukluklarına yol açar^3,4. Örneğin, ADAMTSL2 patojenik varyantları son derece nadir kas-iskelet bozukluğu geleofisik displazi neden, hangi psödomus yapı ile ortaya çıkar, yani, iskelet kas kütlesi belirgin bir artış⁵. Fare ve insanlarda gen ekspresyonu verileri ile birlikte, bu iskelet kas gelişimi veya homeostaz ADAMTSL2 için bir rol göstermektedir^6,7.

Burada tanımladığımız protokol, ADAMTSL2'nin hücre kültürü ortamında iskelet kas gelişimini ve/veya homeostazını modüle etme mekanizmasını incelemek için geliştirilmiştir. Murine C2C12 miyoblast hücre hattında ADAMTSL2'yi yere serptik. C2C12 miyoblastlar ve miyotüpler içine farklılaşma iskelet kas farklılaşması ve iskelet kas biyomühendislik için iyi tanımlanmış ve yaygın olarak kullanılan hücre kültürü^modeli8,9. C2C12 hücreleri serum çekilmesinden sonra farklı farklılaşma adımlarından geçerek kültürde 3−10 gün sonra çok çekirdekli miyotüplerin oluşmasına neden olur. Bu farklılaşma adımları, MyoD, miyojenin veya miyozin ağır zincir (MyHC) gibi farklı marker genlerinin mRNA düzeylerinin ölçülmesiyle güvenilir bir şekilde izlenebilir. C2C12 hücrelerinde kararlı gen knockdowns üreten bir avantajı C2C12 farklılaşma sonraki aşamalarında ifade edilen genler daha verimli hedeflenebilir, geçici knockdown ile karşılaştırıldığında (si) RNA, genellikle transfeksiyon sonra 5−7 gün sürer, ve transfeksiyon verimliliği etkilenir. Burada açıklandığı gibi protokolün ikinci bir avantajı puromisin seçimi kullanarak C2C12 knockdown hücrelerinin toplu nispeten hızlı nesil. CRISPR/Cas9 aracılı gen nakavtı veya birincil iskelet kas hücresi öncüllerinin insan veya hedef-gen eksikliği olan farelerden izolasyonu gibi alternatifler teknik olarak daha zorludur veya hasta kas biyopsilerinin veya hedef geni eksik farelerin bulunmasını gerektirir. Ancak, diğer hücre kültürü tabanlı yaklaşımlara benzer şekilde, c2C12 hücrelerinin iskelet kas hücresi farklılaşması için model olarak kullanımında sınırlamalar vardır, hücre kültürü kurulumu nun iki boyutlu (2D) doğası ve farklılaşmamış iskelet kas öncül hücrelerinin korunması için kritik olan in vivo mikroortamın eksikliği¹⁰gibi.

Protokol

1. Escherichia coli shRNA Plazmid DNA hazırlanması

1. ShRNA plazmidleri taşıyan klonal bakteri kolonilerinin üretimi
   1. Hedefe özgü shRNA plazmidleri taşıyan E. coli gliserol stokları ve ticari kaynaklardan bir kontrol plazmidi elde edin(Malzeme Tablosu).
      NOT: Murine Adamtsl2 mRNA'nın farklı bölgelerini hedef alan üç farklı shRNA plazmid kullanıldı. Bir shRNA 3'-untranslated bölge (3'UTR) Adamtsl2 rekombinant tam uzunlukta ADAMTSL2 veya bireysel ADAMTSL2 protein etki alanları kodlama ifade plazmidler ile kurtarma deneyleri kolaylaştırmak için seçildi. Buna ek olarak, bir şifreli shRNA plazmid negatif kontrol olarak dahil edildi. ShRNA dizilerinin ayrıntıları Şekil 1A'daverilmiştir.
   2. Oda sıcaklığında shRNA bakteriyel gliserol stoku çözültün (RT). 100 μg/mL ampisilin (LB-Amp) ile desteklenen bir Luria-Bertani (LB) agar plakaüzerine bakteriyel gliserol stok10 μL transfer.
      NOT: LB-Amp plakalar 1L LB orta otoklavlama tarafından hazırlanır (1 L: 10 g tripto, maya ekstresi 5 g, NaCl 10 g, 7.0 için pH ayarlamak) birlikte 12 g agar. Orta ~50 °C'ye kadar soğumasını ve ampisilin (stok çözeltisi: steril suda 50 mg/mL) ilave edinve son konsantrasyonu μg/mL (LB-Amp agar). Hemen 10 cm Petri kabına ~ 20 mL LB-Amp agar dökün ve agar kullanmadan önce katılaşmak sağlar. 1 L LB-Amp agar genellikle yaklaşık 40 10 cm Petri yemekleri dökmek için yeterlidir. LB-Amp agar içeren petri kapları, karanlıkta 4 °C'de saklanırsa en az bir ay stabil dir.
   3. Tek bakteri kolonileri elde etmek için steril Drygalski spatula veya başka uygun bir yöntem ile yayılır bakteri. 37 °C'de bir gecede bakteri plakalarını baş aşağı kuluçkaya yatırın.
2. Plazmid hazırlığı
   1. Ertesi sabah, petri kabını tek tek bakteri kolonileriyle çıkarın ve bakteri kolonilerinin büyümesini ve uydu kolonilerinin oluşumunu önlemek için 4 °C'de saklayın. Bir gece veya daha uzun süre saklanırsa Petri kabını kapatın.
   2. Öğleden sonra, bir polipropilen bakteri kültür tüpü içine LB-Amp orta 5 mL ekleyin. Bir pipet ucu ile bir gecede kültürlenmiş Petri kabından tek bir bakteri kolonisi seçin ve LB-Amp ortamı içeren bakteri kültür tüpünde pipet ucunu çıkararak LB-Amp ortamını aşılayın.
   3. 37 °C'de 250 rpm'de bir çalkalayıcıda bir gecede bakteri kültürünü kuluçkaya yatırın ve kapağı gevşek bir şekilde tıkanarak havalandırmaya izin verin.
   4. Ertesi sabah bakteri kültürü tüpünü çıkarın ve bakteriyel büyümeyi önlemek için 4 °C'de tutun. Öğleden sonra, girdap tarafından bakterileri yeniden askıya ve 250 mL konik bir şişe LB-Amp orta 50 mL gecede bakteri kültürünün 1 mL transfer. 37 °C'de 250 rpm'de bir shaker'da bir gece kuluçkaya yatırın.
   5. Ertesi sabah bakterileri 50 mL'lik tek kullanımlık santrifüj tüpüne ve 15 dk.RT'de 6.000 x g'de santrifüj bakterilere aktarın.
      NOT: Plazmid DNA'sı hemen izole edilemiyorsa, santrifüj adımından sonra LB-Amp ortamını çıkarın ve bakteri peletini -20 °C'de saklayın.
   6. Plazmid hazırlama kiti (midi ölçek) için bakteri plazmid DNA ayıklamak için talimatları izleyin. Plazmid DNA kalitesini spektrofotometre kullanarak A_260/A280 oranını ölçerek değerlendirin.
      NOT: A₂₆₀/A₂₈₀ oranı >1.8 tercih edilir, plazmid DNA preparatının yüksek saflıkta olduğunu gösterir. Daha düşük A₂₆₀/A₂₈₀ oranı protein ile kontaminasyon veya ekstraksiyon reaktiflerinin yetersiz çıkarılmasını göstermektedir. Ek plazmid arınma adımları gerekebilir.

2. C2C12 Hücrelerinin Culturing ve Transfeksiyonu ve Püromisin Seçimi

1. C2C12 hücre kültürü
   1. 37 °C'lik su banyosunda C2C12 hücrelerini(Malzeme Tablosu)hızlı bir şekilde boşaltın ve hücre kültüründe 100 ünite penisilin ve streptomisin antibiyotikler (serumsuz DMEM) ile birlikte 8 mL Dulbecco modifiye Kartal ortamı (DMEM) içeren steril tek kullanımlık 15 mL santrifüj tüpüne hücreleri dökün. RT'de 160 x g'da 3 dk santrifüj hücreleri.
   2. % 10 fetal sığır serumu (FBS) (komple DMEM) ile birlikte serumsuz DMEM'in 10 mL'lik hücre pelesini aspire etmek ve resuspend. Hücreleri 10 cm doku kültürüne aktarın plastik tabaklar tedavi edilir. %5 CO₂ atmosferinde 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçka yakan hücreler.
   3. Ertesi gün, ortamı taze tam DMEM ile değiştirin.
   4. 3−4 10 cm'lik tabaklarda düşük geçitli C2C12 hücrelerini genişletin. C2C12 hücreleri %50−60 birleştiğinde orta ve 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile C2C12 hücrelerini durular.
   5. 1 mL% 0.25 trypsin-EDTA ekleyin ve 2 dakika rt. Bir mikroskop altında hücre ayırma izlemek ve hücrelerin çoğu ayrışana kadar, gerekirse kuluçka süresini uzatmak için inkübat.
      NOT: Dikkatle çanak dokunarak hücreleri yerinden yardımcı olabilir.
   6. Hücrelerin çoğu ayrıldığında, tabağa 10 mL tam DMEM ekleyin, hacmi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetle ve hücre süspansiyonu steril tek kullanımlık 15 mL santrifüj tüpe aktarın. Rt. Aspire supernatant 160 x g 3 dakika için santrifüj hücreleri ve donma ortamının 2 mL hücre pelet resuspend (%10 dimetil sülfoksit [DMSO]/90% FBS).
   7. Cryovials 10 cm çanak başına iki 1 mL aliquots aktarın. -80 °C'lik dondurucuda en az 24 saat RT izopropanol dolu bir hücre dondurucu kabında kuluçkaya yatırın ve buz kristallerinin oluşumunu önlemek için dakikada yaklaşık -1 °C donma hızı elde edin. Hücreleri sıvı nitrojenin buhar fazında uzun süreli kullanım için saklayın.
      NOT: Satıcı, 15 numaralı geçide kadar C2C12 hücreleri kullanılmasını önerir. Yazarların deneyimleri de düşük geçiş sayısı hücrelerinin miyotüplere daha tutarlı ve hızlı bir farklılaşma gösterdiğini göstermiştir. C2C12 hücrelerinin erken farklılaşmanın önlenmesi için düşük hücre yoğunluğunda (<%50 birleşme) tutulması esastır. Farklılaşan veya farklılaştırılmış C2C12 hücreleri orijinal miyoblast durumuna geri döndürülemez ve atılmalıdır.
2. C2C12 hücrelerinin transfeksiyona hazırlanması
   1. Kültür 10 cm'lik bir kapta farklılaşmamış C2C12 hücreleri %50−60'a ulaşana kadar biraraya geldi. Orta, 10 mL PBS ile C2C12 hücreleri durulayın ve 0.25% trypsin-EDTA 1 mL ekleyin. RT'de 2 dakika kuluçka ya da mikroskop altında hücre ayrıştırmasını izleyin ve gerekirse kuluçka süresini, hücrelerin çoğu ayrılana kadar uzatın.
      NOT: Dikkatle çanak dokunarak hücreleri yerinden yardımcı olabilir.
   2. Hücrelerin çoğu koptuğunda, tabağa 10 mL tam DMEM ekleyin ve hücre süspansiyonu steril tek kullanımlık 15 mL santrifüj tüpe aktarın. Sentrifüj hücreleri 3 dk 160 x g'de RT. Aspire supernatant ve hücre peletini tam DMEM'in 4 mL'sinde yeniden askıya alın.
   3. 10 μL hücre süspansiyonu ile 1,5 mL'lik bir reaksiyon tüpünde 10 μL'lik trypan mavisini birleştirin, yukarı ve aşağı borular oluşturarak ve tepki tüpünü dikkatlice hareket ettirerek karıştırın ve hücreleri sayma slaytına aktarın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre numarasını/mL'yi belirleyin.
   4. C2C12 hücrelerini 50.000 hücre/mL'ye seyreltin ve bir gecede kuluçkadan sonra yaklaşık %40−50 biraraya gelmek için 6 kuyu plakasında kuyu başına 100.000 hücre (2 mL) tohumlayın. %5 CO₂ atmosferinde 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçka yakan hücreler.
3. Polietilenin (PEI) ve püromisin seçimi kullanılarak shRNA plazmid ile C2C12 hücrelerinin transfeksiyonu
   1. PEI stok çözeltisinin hazırlanması
      1. 50 mL'lik steril distile su (stok çözeltisinin konsantrasyonu: 0.32 mg/mL) içinde 16 mg PEI'yi vida kapağıolan 50 mL cam ortam şişesinde çözün. Çözeltiyi 65 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve çözeltiyi kuluçka süresi boyunca birkaç kez şiddetle girdapatarak PEI'yi tamamen eritin.
      2. 50 mL başına 15 μL 1N HCl ekleyerek pH 8'e ayarlayın.
         DİkKAT: HCl aşındırıcıdır. Konsantre HCl duman kaputu altında ele alınmalıdır. Müfettişler uygun kişisel koruyucu ekipman giymelidir.
      3. PEI çözeltisini -80 °C'de gevşek bir şekilde bağlanmış bir kapakla 1 saat dondurun ve çözünürlüğü daha da artırmak için 37 °C'de su banyosunda hızla çözülün. Donma-çözülme döngüsünü 3x tekrarlayın.
      4. PEI stok çözeltisini -20 °C'de tek seferlik kullanım için 0,5 mL aliquots olarak saklayın.
   2. C2C12 hücrelerinin transfeksiyonu
      1. PEI stok çözeltisinin 25,5 μL'lik (8,5 μL/μg plazmid DNA'sını) 1,5 mL'lik bir reaksiyon tüpünde 100 μL 25 mM NaCl ile birleştirin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Plazmid DNA'sının 3 μg'ını 100 μL 25 mM NaCl ile birleştirin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
      2. Seyreltilmiş PEI reaktifinin tüm hacmini seyreltilmiş plazmid ile birleştirin ve hafifçe yukarı ve aşağı borular ekleyerek karıştırın. 37 °C'de 25 dk kuluçka.
      3. Kuluçka süresi boyunca, FBS veya antibiyotik olmadan DMEM transfeksiyon için amaçlanan C2C12 hücrelerinin orta değiştirin.
      4. PeI/DNA transfeksiyon karışımını C2C12 hücrelerine ekleyin ve hücre kültürü yemeğini dikkatlice hareket ettirerek sürekli karıştırın. %5 CO₂ atmosferinde 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. 6 saat sonra dmem tamamlamak için orta değiştirin.
   3. Püromisin seçimi
      1. Transfeksiyondan 24 saat sonra orta ve seçim ortamına geçiş yapın (komple DMEM artı 5 μg/mL puromisin). Puromisin dirençli C2C12 hücreleri elde edilene kadar puromisin seçimine devam edin, bu da genellikle 10−14 gün sürer.
      2. 2.1.4−2.1.7 adımlarında açıklandığı gibi, farklılaşmamış durumu ve 6−10 şişenin kriyokorunu korumak için düşük hücre yoğunluğunda (<50−60% birleşimi) puromisin dirençli C2C12 hücrelerini genişletin.
         NOT: Rutin hücre kültürü ve genişlemesi için 5 μg/mL puromisin varlığında puromisin dirençli C2C12 hücrelerini koruyun. Ancak, püromisin farklılaşma deneylerinde atlandı.

3. C2C12 Farklılaşmasının Henotipik Analizi

NOT: Aşağıda açıklanan yöntemler, Batı lekelemesinde kullanılan spesifik antikorları veya kantitatif polimerazda kullanılan gen spesifik astarları değiştirerek C2C12 miyoblast farklılaşmasının miyotubelara genel henotypik analizi için kolayca uyarlanabilir. zincirleme reaksiyon (qPCR) analizi.

1. C2C12 farklılaşma protokolü ve brightfield mikroskobu
   1. Tohum 150.000 hücreleri / iyi bir 12 kuyu plaka. Kültür puromisin dirençli C2C12 kararlı hücreler 12 iyi plaka seçim ortamında bir nemlendirilmiş inkübatör 37 °C bir% 5 CO₂ atmosferde. Kültür C2C12 hücreleri ~% 95 biraraya ulaşana kadar tam DMEM hücreleri.
   2. C2C12 hücrelerinin farklılaşmasını sağlamak için, tam DMEM'i serumsuz DMEM (gün 0 farklılaşma) ile değiştirin. Her iki günde bir orta yıkın ve kameralı ters parlak alan mikroskobu kullanarak C2C12 miyotube oluşumunu takip edin.
      NOT: Birçok protokol, C2C12 hücrelerini miyotüplere ayırmak için %2 at serumu kullanır. Yazarların elinde, serumun çıkarılması da benzer bir etki yarattı. İnsülin C2C12 farklılaşmasını hızlandırmak için hücre kültürü ortamına bir katkı olarak tanımlanır. Ancak mevcut protokolde C2C12 hücreleri serum yoksunluğu ve insülin eklenmesigereksiz bulunduktan sonraki 3−5 gün içinde güvenilir bir şekilde miyotüplere ayrıldı.
2. Miyozin ağır zincir (MyHC) immünoboya miyotüpleri görselleştirmek için
   1. Tohum 50.000 puromisin dirençli C2C12 hücreleri oda başına tam DMEM 500 μL bir 8 kuyu odası slayt. Kültür hücreleri tam DMEM 'de %95 biraraya ulaşına kadar (yaklaşık 24 saat).
   2. Farklılaşmayı sağlamak için, tam DMEM'den 500 μL serumsuz DMEM'e (gün 0 farklılaşma) geçin. İstenilen zaman noktasında, orta ve durulama hücreleri 3x pbs 0.5 mL ile aspire.
      NOT: RT'de aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirin.
   3. PBS'de seyreltilmiş %4 paraformaldehit (PFA) ile 0,2 mL olan hücreleri 15 dakika boyunca durula.
      DİkKAT: PFA tehlikelidir. Uygun önlemleri alın ve paraformaldehit çözeltisi tehlikeli atık olarak atın.
   4. 5 dk. 0,5 mL PBS 3x pbs 3x her biri için 0,5 mL'lik 0,2 mL glisin ile PFA'yı bastırın.
   5. Hücre zarını permeabilize etmek için PBS'de 0,2 mL%0,1 non-iyonik yüzey aktif/deterjan(Malzeme Tablosu)ile inkübat hücreler. PBS'de 0,2 mL%5 büyükbaş serum albumini 1 h. Durulama hücreleri için 0,5 mL PBS 3x 5 dk için bloke edin.
   6. 0.2 mL MyHC antikor (PBS'de 1:200) olan hücreler için 2 saat. 0,5 mL PBS 3x ile 5 dk boyunca durulama hücreleri için.
   7. 0.2 mL keçi-anti fare rhodamine kırmızı konjuge sekonder antikor (PBS 1:200) ile inkübat hücreleri. 0,5 mL PBS 3x ile hücreleri 5 dk boyunca durula.
   8. Kantitatif PBS çıkardıktan sonra, oda başına 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) içeren montaj ortamı bir damla ekleyin. Üreticinin talimatlarına göre kapak kayma ve kür montaj ortamı. Ojeli fok.
   9. Uygun filtre kümesini kullanarak floresan mikroskobu kullanarak C2C12 hücrelerini gözlemleyin.
3. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile nakavt verimliliğinin değerlendirilmesi
   1. Kültür C2C12 hücreleri bölüm 3.1'de açıklandığı gibi 12 kuyu plakasında farklılaşma koşulları altında.
   2. İstenilen zaman noktasında, farklılaşma ortamını kaldırın, hücreleri 1 mL PBS ile bir kez durulayın ve kuyu başına 0,5 mL RNA ekstraksiyon reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin. Hücreleri dikkatlice yukarı ve aşağı borular ile lyse ve steril bir 1,5 mL reaksiyon tüpü hücre lysate aktarın. Üreticinin protokolünü dikkatle izleyerek RNA'yı yalıtın.
      DİkKAT: RNA ekstraksiyon reaktifi fenol içerir. Duman kaputunun altında kullanılmalıdır. RNA çıkarma reaktif atıklarını toplayın ve tehlikeli atık olarak atın. Müfettişler uygun kişisel koruyucu ekipman giymelidir.
   3. Son RNA peletini 20 μL dietil pirokarbonat (DEPC) ile işlenmiş suda çözün. RNA hazırlığının miktarını ve kalitesini bir spektrofotometre kullanarak belirleyin ve kalite ölçüsü olarak A_260/A280 oranını belirleyin.
      NOT: 12 kuyu plakasının 1 kuyusundan tipik bir verim, 1,8−2 A_260/A280 oranıile toplam RNA'nın 5−7 μg'sidir.
   4. Kalıntı kosaflaştırılmış genomik DNA'yı sindirmek için, pcr tüpte toplam 8 μL DEPC ile işlenmiş su hacminde 1 μg RNA seyreltin. 1 μL 10x reaksiyon tamponu ve 1 μL DNase I (1 birim/μL)(Malzeme Tablosu)ekleyin ve RT.'de 15 dakika kuluçkaya yatırın. 1 μL stop çözeltisi (25 mM EDTA) ekleyin ve 70 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
   5. CDNA oluşturmak için, 10 μL DNa tedavi edilmiş RNA'yı ters transkriptaz, rasgele astarlar, 4 mM dNTP karışımı (her dATP, dTTP, dGTP ve dCTP) içeren 10 μL 2x ters transkriptaz ana karışımı ile birleştirin ve ters transkriptaz reaksiyon tamponu oluşturun. Üretici tarafından tavsiye edilen programı kullanarak bir termocycler reaksiyon kuluçka. CDNA'yı 1:5 oranında su ile seyreltin.
   6. QRT-PCR reaksiyonu hazırlamak için, 5 μL SYBR yeşil qPCR ana karışımını sırasıyla 0,5 μL gen-spesifik ileri ve ters astarlarla (stok: 10 μM) ve reaksiyon başına 2 μL DEPC ile işlenmiş su ile birleştirin. Pipet qPCR reaksiyonbir kuyuda 96 iyi qRT-PCR plaka ve seyreltilmiş cDNA 2 μL ekleyin. Her biyolojik çoğaltma için üç teknik çoğaltma ayarlayın ve Gapdh veya Hprt1gibi bir temizlik geni içerir.
   7. Aşağıdaki programı kullanarak pcr-PCR termocycler ile PCR ürününün yükseltin: 2 dk için 50 °C (urasil-DNA glikozilaz [UDG] aktivasyonu), 2 dk için 95 °C (çift kilitli DNA polimeraz aktivasyonu), 15 s için 95 °C 40 °C, 30 s için 60 °C ve 1 dk için 72 °C.
   8. Gapdh veya Hprt1gibi bir temizlik genine normalleşen DDCt yöntemini kullanarak qRT-PCR sonuçlarını ölçün.
4. Batı lekeleme ile nakavt verimliliğinin değerlendirilmesi
   1. Tohum 300,000 puromisin dirençli C2C12 hücreleri batı leke analizi için 6 iyi plaka iyi başına. 24 saat sonra, farklılaşma (gün 0 farklılaşma) başlatmak için serumsuz DMEM orta değiştirin.
   2. İstenilen zaman noktasında, 1,5 mL'lik bir reaksiyon tüpünde serumsuz iki mL klimalı ortam ve 5 dakika 5 dakika boyunca 5 dakika boyunca 5 000 x g'de 5 dakika boyunca ayırılmış hücreleri ve hücre enkazını temizlemek için iki mL serumsuz klimalı ortam toplayın.
      NOT: Bu adım, ancak ecm proteinleri veya şartlı ortamdaki diğer salgılanan proteinler incelenirse gereklidir. İlgi proteini sitoplazmada lokalize ise veya membranbağlıysa, hücre kültürü ortamını aspire edin ve hücre lisis adımlarını uygulayın (3.4.7−3.4.12). Hücre lisisi, proteolitik bozulmayı ve hücre tabakasının uzun süreli depolanmasının diğer istenmeyen sonuçlarını en aza indirmek için serumsuz koşullu ortamdan gelen protein çökeltmesine paralel olarak yapılmalıdır.
   3. Santrifüjden sonra, 1 mL'lik klimalı ortamı yeni bir 1,5 mL reaksiyon tüpüne aktarın ve trikloroasetik asit (TCA) ve iyonik olmayan yüzey aktif madde/deterjan karışımından 0,391 mL ekleyerek proteinleri çökeltin. Kısaca karışımı girdap ve buz üzerinde 10 dakika kuluçka.
      NOT: Protein çökeltme karışımını kullanımdan önce %55 TCA'nın 0,252 mL'si ve 0,139 mL'si 0,139 mL'lik iyonik olmayan yüzey aktif/deterjanı mL'de koşullu ortam ve girdap başına kısaca birleştirerek hazırlayın. Çözüm bulanıklaşır.
      DİkKAT: TCA aşındırıcıdır ve uygun şekilde ele alınmalıdır.
   4. 4 °C'de 10 dk için >16.000 x g çökelmiş proteinlerpelet. Supernatant atın.
      DİkKAT: Süpernatant TCA içerir ve ayrı olarak toplanmalı ve tehlikeli madde olarak imha edilmelidir.
   5. Protein peletini buz gibi aseton ve santrifüj ile her seferinde >16.000 x g'de 10 dakika boyunca 4 °C'de yıkayın.
   6. Protein peletini RT'de 3−4 dakika boyunca hava kurutun ve %5 β-mercaptoetan ile desteklenen %5 sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) örnek tampon (50 mM Tris pH 6.8, %2 SDS, %6 gliserol ve %0.004 bromofenol mavisi) 50 μL'lik 1x sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezinde çözünür. Numuneyi 95 °C'de 5 dk kaynatın ve standart prosedürleri kullanarak istenilen hedef proteini tespit etmek için Batı lekeleme için kullanın.
      DİkKAT: β-Mercaptoethanol kokulu ve toksiktir ve duman kaputunda kullanılmalıdır.
   7. Hücre içi ve membrana bağlı proteinler için hücre tabakasını 2 mL PBS ile bir kez durulayın.
   8. 1 mL PBS ekleyin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak kuyudan sıyrılarak hücreleri yerinden çıkarın. 4 °C'de 3 dk için 3.420 x g'de 1,5 mL reaksiyon tüpünde ve santrifüjde hücreleri toplayın. Hücre peletini 3 x 1 mL PBS ve santrifüj 3.420 x g'de 3 dk 4 °C'de yıkayın.
   9. Hücreleri lyse için, 0.2 mL lysis tampon (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1 mM EGTA, %1 NP40, %1 sodyum deoksikofat, 2,5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM β-glisofosfat ve 1 mM sodyum ortonovaat) 1x EDTA içermeyen proteeaseor kokteyl reaktifi ve inkübate ile birlikte 30 dk buz üzerinde.
   10. Ultrasonicate 15 s buz üzerinde bir güç çıkışı ayarı ile 10 bir çalışma frekansında 23 kHz.
   11. 4 °C'de 20 dk için 13.680 x g'de hücre enkazLarını santrifüj ile çıkarın. Yeni bir 1.5 mL reaksiyon tüpünde supernatant toplayın ve ticari bir Bradford tsay veya başka uygun bir yöntem kullanarak protein konsantrasyonu belirlemek.
   12. Her numune için, 100 μg proteini 5x SDS-PAGE örnek tamponu ile toplam 60 μL hacimde birleştirin ve 95 °C'de 5 dk kaynatın. İstenilen hedef proteinin varlığı için numuneleri standart Batı lekeleme prosedürleri ile analiz edin.

Sonuçlar

Puromisin dirençli C2C12 seçimi, transfeksiyondan 10-14 gün sonra dirençli olmayan, yani transfeksiyonsuz hücrelerin etkin bir şekilde ortadan kaldırılması nedeniyle elde edilebilir (Şekil 1B). Tipik olarak, hücrelerin % 80'den fazlası hücre kültürü çanamından uzaklaşıyor ve bu hücreler rutin hücre bakımı sırasında çıkarılır. Kontrol (şifreli) shRNA ifade puromisin dirençli C2C12 hücreleri düşük hücre yoğunluğunda mil şeklinde, uzamı?...

Tartışmalar

Burada C2C12 miyoblastlarında ECM proteinlerinin kararlı bir şekilde yıkılması ve C2C12 miyoblastlarının miyotüplere farklılaşmasının henotik analizi için bir protokol uyguluyoruz. Deney sonucunu çeşitli faktörler belirler ve dikkatle düşünülmeli. C2C12 hücrelerinin çoğalma aşamasında tutulması, C2C12 hücrelerini miyoblast öncül durumunda tutmak için kritik bir adımdır. C2C12 hücrelerinin sürekli miyotüpler içine ayırt etmek için yeteneğini istinat i) hücrelerin geçiş sayısı, ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Chemical	191784
Agar	Fisher Bioreagents	BP1423
Ampicillin	Fisher Bioreagents	BP1760-5
Automated cell counter Countesse II	Invitrogen	A27977
Bradford Reagent	Thermo Scientific	P4205987
C2C12 cells	ATCC	CRL-1772
Chamber slides	Invitrogen	C10283
Chloroform	Fisher Chemical	183172
DMEM	GIBCO	11965-092
DMSO	Fisher Bioreagents	BP231-100
DNase I (Amplification Grade)	Invitrogen	18068015
Fetal bovine serum	VWR	97068-085
GAPDH	EMD Millipore	MAB374
Glycine	VWR Life Sciences	19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW)	Li-Cor	C90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red)	Jackson Immune Research	133389
HCl	Fisher Chemical	A144S
Incubator (Shaker)	Denville Scientific Corporation	1704N205BC105
Mercaptoethanol	Amresco, VWR Life Sciences	2707C122
Midiprep plasmid extraction kit	Qiagen	12643
Myosin 4 (myosin heavy chain)	Invitrogen	14-6503-82
Mounting medium	Invitrogen	2086310
NaCl	VWR Life Sciences	241
non-ionic surfactant/detergent	VWR Life Sciences	18D1856500
Paraformaldehyde	MP	199983
PBS	Fisher Bioreagents	BP399-4
PEI	Polysciences	23966-1
Penicillin/streptomycin antibiotics	GIBCO	15140-122
Petridishes	Corning	353003
Polypropylene tubes	Fisherbrand	149569C
Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	33576300
Puromycin	Fisher Scientific	BP2956100
PCR (Real Time)	Applied Biosystems	4359284
Reaction tubes	Eppendorf	22364111
Reverse Transcription Master Mix	Applied Biosystems	4368814
RIPA buffer	Thermo Scientific	TK274910
sh control plasmid	Sigma-Aldrich	07201820MN
sh 3086 plasmid	Sigma-Aldrich	TRCN0000092578
sh 972 plasmid	Sigma-Aldrich	TRCN0000092579
sh 1977 plasmid	Sigma-Aldrich	TRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop)	Thermo Scientific	NanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix	Applied Biosystems	743566
Trichloroacetic acid	Acros Organics	30145369
Trizol reagent	Ambion	254707
Trypan blue	GIBCO	15250-061
Tryptone	Fisher Bioreagents	BP1421
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco-Life Technology Corporation	2085459
Water (DEPC treated and nuclease free)	Fisher Bioreagents	186163
Western blotting apparatus	Biorad	Mini Protean Tetra Cell
Yeast extract	Fisher Bioreagents	BP1422