Farenin Ventral Tegmental Alanı İçinde Optogenetik Kullanarak İki Farklı Gerçek Zamanlı Yer Tercihi Paradigması

Özet

Burada farelerde optogenetik kullanarak yer tercihi paradigmaları için adım adım takip edilmesi kolay iki protokol salıyoruz. Bu iki farklı kurulumkullanılarak, tercih ve kaçınma davranışları, yüksek mekansal ve zamansal seçicilik ile aynı cihaz içinde ve basit bir şekilde sağlam bir şekilde değerlendirilebilir.

Özet

Nöronal aktivasyonun belirli davranışsal çıktılara nasıl yol açtığını anlamak modern nörobilim için temel dir. Kemirgenlerde optogenetik ile doğrulanmış paradigmalarda davranışsal testlerin birleştirilmesi, farklı nöronların gerçek zamanlı olarak yüksek uzamsal ve zamansal seçicilik ile uyarılması üzerine davranışsal sonuçların ölçülmesine ve böylece nöronal aktivasyon ve davranış arasındaki nedensel ilişkiler. Burada, klasik koşullu yer tercihi (CPP) testinin değiştirilmiş bir sürümü olan gerçek zamanlı yer tercihi (RT-PP) paradigması için adım adım bir protokol açıklıyoruz. RT-PP üç bölmeli bir cihazda gerçekleştirilir ve belirli bir nöronal popülasyonun optogenetik stimülasyonunun ödüllendirici veya aversif olup olmadığını cevaplamak için kullanılabilir. Ayrıca RT-PP protokolünün alternatif bir sürümünü, sözde nötr bölme tercihi (NCP) protokolü, hangi nefret onaylamak için kullanılabilir açıklar. Bu iki yaklaşım, davranışsal farmakolojiden kaynaklanan klasik metodolojiuzantılarına ve nörolojik alanda optogenetik uygulamasına dayanmaktadır. Yer tercihini gerçek zamanlı olarak ölçmenin yanı sıra, bu kurulumlar koşullu davranışla ilgili bilgi de verebilir. Kendi veri örneklerimizin yanı sıra adım adım kolay protokoller sağlıyoruz ve bu tür deneyleri uygularken göz önünde bulundurulması gereken önemli hususları tartışıyoruz.

Giriş

Optogenetik uygulanması, Hangi ışık nöronal aktiviteyi kontrol etmek için kullanılan modern bir nörolojik deneysel araç, son yıllarda nasıl belirli nöronal popülasyonlar etkisi davranış^1,2,3anlamada önemli gelişmelere yol açmıştır . Optogenetik olağanüstü mekansal ve zamansal seçicilik çıkar ve davranışsal çıkış hücre gruplarının uyarma veya inhibisyonu arasında nedensel ilişkilerin kurulmasını sağlar^2,3. Optogenetikte mekansal seçicilik yaygın cre-Lox sistemi ile sağlanır hangi Cre rekombinaz aktivitesi Lox siteleri arasında mevcut herhangi bir DNA dizisire kombinasyonyol açar, sözde floxed aleller (lox siteleri ile çevrili)⁴. Optogenetikte Cre-Lox sistemini kullanmanın amacı, gözçevresindeki nöronları ifadeden yoksun bırakırken, optogenetik opsinleri belirli ilgi nöronlarında kodlayan alellerin ekspresyonunu elde etmektir. Opsinler ışığa duyarlı proteinlerdir ki, belirli dalga uzunluğunun ışık stimülasyonu üzerine, nöral uyarılabilirliği etkileyen iyon akışına izin verir veya aşağı akım efektör yollarını modüle ederek hücresel fonksiyonları etkiler. Eylem (uyarıcı, inhibitör, modülatör), mekanizma, ışık dalga boyu ve kinetik özellikleri⁵ ile aktivasyon farklı opsinlerin yeni türevleri sürekli belirli deneysel yaklaşımların ihtiyaçlarını karşılamak için geliştirilmiştir. Uyarılabilirlik ile ilgili olarak, bir depolarize veya hiperpolarize opsin kullanarak nöronların aktivitesini dikte (uyarma veya inhibisyon, sırasıyla) belirli bir dalga boyunda ışık uyarımı üzerine beyne teslim³.

Seçici organizatör aktivitesi cre rekombinaz ekspresyonunu ilgi nöronlarına yönlendirir. Ilgi opsin bir floxed alel uygulayarak, Cre aracılı rekombinasyon opsin seçici cre rekombin3 ifade nöronlarda ifade edilmesini sağlayacaktır^3,6. Mekansal seçiciliği yönlendirmek için çift transgenik kullanımı optogenetikte çok etkili olmuştur. Böylece, opsinler etkinleştirmek için ışık stimülasyon geniş bir ışık kaynağına bağlı bir intraserebral implante optik fiber ile teslim edilirken (LED veya lazer)³, sadece nöronların hem Cre rekombinaz ve floxed opsin alel ifade bu uyarıma yanıt verecektir. Kemirgenlerde Cre-Lox sistemi sadece transgenik kullanılarak farklı şekillerde elde edilebilir (hem Cre rekombinaz hem de floxed opsin yapısı transgenik hayvanlarda kodlanır), sadece viral enjeksiyonlar (Cre rekombinaz için DNA yapıları ve floxed opsin her ikisi de viral taşıyıcı üzerinden teslim edilir), ya da ikisinin bir kombinasyonu (örneğin, Cre rekombinaz floxed opsin yapı taşıyan bir virüs enjekte edilir transgenik bir hayvan tarafından kodlanır)⁵. Floxed opsin DNA yapısı genellikle doku bölümlerinde Cre aracılı rekombinasyon görselleştirme sağlamak için bir muhabir gen ile çerçeve içinde klonlanır. Sıçanlarda optogenetik de yapılabilse de fareler için sunulan protokoller oluşturulmuştur. Sadelik için, cre rekombinaz ve floxed opsin taşıyan fareler "optogenetik fareler" olarak anılacaktır. Aşağıda açıklanan protokollerde, optogenetik fareler karışık transgenik (Cre rekombinaz iki farklı promotörlerin kontrolü altında) ve viral (adeno ilişkili bir virüs kullanarak, AAV, floxed opsin DNA yapısı sunmak için - bizim durumumuzda ChR2/H134R) yaklaşım tarafından üretilmiştir. Transgenik fare hatlarının elde edilmesi ve sürdürülmesi metodolojinin önemli bir parçasıdır. Cre-driver ve floxed opsin transgenik fareler her amaç için üretilebilir, ya da ticari olarak mevcutsa satın alınabilir, cre rekombinaz ve floxed opsins farklı şekillerde kodlama DNA dizileri taşıyan virüslerin bir dizi gibi.

Davranışsal testler ile birleştiğinde Optogenetik farklı beyin bölgelerinin rolünü incelemek için değerli bir araç olduğu kanıtlanmıştır, ya da ayrık nöronal popülasyonlar, davranış belirli türleri. Ödülle ilgili davranış bağlamında, optogenetik davranışsal farmakoloji ve deneysel psikoloji alanlarında önceki bulguların doğrulanmasını sağlamıştır ve ayrıca bazı nöronların davranışı nasıl etkilediğine dair yeni bir spatio-temporalile ilgili diseksiyon düzeyine olanak sağlamıştır. Ödülle ilgili davranışları değerlendirmek için çeşitli çalışmalarda kullanılan yöntemlerden biri, Koşullu Yer Tercihi (CPP) olarak bilinen klasik yöntemin değiştirilmiş bir versiyonudur. Klasik CPP çevre ipuçları ile Pavlovian dernekler ikna yeteneği ile istismar ilaçların ödüllendirici veya aldatıcı özelliklerini değerlendirmek için kullanılmıştır^7,8. Pavlovian açısından, ilaç, sırasıyla ödüllendirici veya aldatıcı ise yaklaşım veya çekilme ortaya çıkarmak beri koşulsuz bir uyarıcıdır. Çeşitli nötr uyaranlarla ilacın sürekli eşleşmesi, kendilerini herhangi bir yanıt ortaya çıkarmak değil, yaklaşım veya çekilme sadece daha önce nötr sunumu üzerine yol açabilir, ancak eşleştirme sonra, sözde şartlı uyaranlar⁹. CPP analizi genellikle aynı boyutta iki bölme içeren ancak her bölmenin zemin dokusu, duvar desenleri ve aydınlatma (nötr uyaranlar) gibi farklı özelliklerle tanımlandığı bir cihazda gerçekleştirilir. İki bölme bir koridor veya bölmeler arasında bir açıklık ile bağlanır. Klima sırasında, konu, genellikle küçük bir kemirgen, diğer bölme ile sınırlı iken iki ana bölmeleri ve tuzlu biri ile sınırlı iken bir ilacın pasif enjeksiyonları alır. Konu serbestçe tüm cihaz keşfetmek için izin verildiğinde ilacın ödüllendirici etkileri daha sonra bir ilaç ücretsiz oturumda değerlendirilir. Daha önce uyuşturucu eşleştirilmiş bölmede harcanan zaman miktarı (şartlı yanıt) Pavlovian öğrenme mekanizmaları ilacın ödüllendirici etkileri ve onun yönetimi ile ilişkili kompartman ın ipuçları arasında aracılı yansıtmak için kabuledilir (şartlı uyaranlar). Hayvan ilaç eşleştirilmiş bölmede daha fazla zaman geçirirse, ilaç davranış üzerinde ödüllendirici etkileri olduğu anlamına gelir şartlı bir yer tercihi indüklenen vardır. Öte yandan, ilaç aversive olarak algılanırsa, hayvan ilaç eşleştirilmiş bölmesi önlemek ve tuzlu eşleştirilmiş bölmede daha fazla zaman harcamak, şartlı yer kaçınma gösteren (CPA)^8,9,10,11.

Optogenetik nöronal aktiviteyi "gerçek zamanlı" olarak kontrol etmek için uygulanabildiği için, CPP kurulumuna benzer, ancak farklı bir davranışsal paradigmanın kullanımı, doğrudan nöronal aktivasyon üzerine yer tercihinin ölçülmesine olanak sağlar. Bu nedenle yer tercihinin optogenetik odaklı analizi genellikle gerçek zamanlı yer tercihi (RT-PP) analiz paradigması olarak adlandırılır. RT-PP paradigmasında, Cre-Lox sistemi ile farklı nöronların optogenetik stimülasyonu klasik CPP'de uygulanan bir ilacın sistemik tesliminin yerini alır, böylece RT-PP paradigması bunun yerine optogenetik olarak indüklenen nöronal stimülasyon ödüllendirici veya aldatıcı olarak algılanır. Mevcut açıklama optogenetik fareler üzerinde durulacak, ama aynı zamanda optogenetik sıçanlar benzer protokoller kullanılarak test edilebilir.

Klasik CPP paradigmasında olduğu gibi bir seferde bir bölmeye koşullandırma yerine, RT-PP paradigmasındaki optogenetik farenin tüm cihazda serbestçe hareket etmesine izin verilir ve seans boyunca davranış kaydedilir. Bölmelerden birine giriş intrakranial ışık stimülasyonu ile eşleştirilmiş. Uygun ışık stimülasyon parametreleri altında, uyarıcı bir opsin ifade nöronlar bu şekilde aktive edilecektir. Işık stimülasyonu ödüllendirici olarak algılanırsa, optogenetik fare ışık eşleştirme bölmesinde kalır, ışık stimülasyonu ise aversive olarak algılanırsa, fare uyarımdan kaçmak için bölmeden çıkar. Bu tür bir analiz, şartlı öğrenmenin değerlendirilmesine olanak sağlar: Konu, bir bölmeye girerek ışık stimülasyonu ve dolayısıyla nöronal aktivasyonu tetikleyebilir ve enstrümental bir görev sırasında kol basmasına benzer şekilde bölmeden çıkarken stimülasyonu durdurabilir. Ayrıca, her bölmede geçirilen zamanın uyarılma yokluğunda ölçüldüğü sonraki seanslarda da assosiyatif öğrenme mekanizmaları değerlendirilebilir. Bu şekilde, araştırmacı ilgi nöronların uyarılması üzerine hemen ödüllendirici etkileri ve onunla ilgili ilişkisel bellek oluşumu arasında ayrışabilir¹².

Bu çalışmada, serbestçe hareket eden farelerin optogenetik odaklı yer tercihi davranışı için adım adım kurulum protokolleri tanımlanmıştır. İlk protokol rt-PP üç bölmeli bir cihaz içinde açıklar ve son zamanlarda Root ve meslektaşları¹³ ve diğer yazarlar^12,14,15,16,17^,18tarafından sunulan protokollere dayalı olarak özetlenmiştir . Deney, birkaç günlük seanstan oluşan iki aşamadan oluşur (Şekil 1A'dagösterilmiştir). Her seans farklı amaçlar için tasarlanmıştır ve bir bölme ile bağlantı stimülasyonu parametreleri buna göre değiştirilir. İlk oturum, "Pretest", deneğin ilk tercihini bölümlerden birine değerlendirmek için kullanılır. Yama kablosuna bağlı yken, denek 15 dakika boyunca uyarılma yokluğunda cihazı serbestçe keşfetmesine izin verilir. Herhangi bir bölmenin ilk tercihi %80'den fazlaysa, ilk yan sapma analizi çarpıtabileceğinden fare çözümlemenin dışında tutulur. "Pretest", "Faz 1" başladıktan sonra. İlk bölüm iki ardışık oluşur, günlük, 30 dk oturumları "RT-PP". "Faz 1" sırasında, optogenetik fare yama kablosu ile lazer kaynağına bağlanır ve serbestçe keşfetmek için arenaya yerleştirilir. Fare ana bölmelerden birine girdikten sonra intrakranial lazer stimülasyon alır. Hangi bölmenin lazer le eşli olarak atanacağını ve hangibölmenin eşleşmeden olduğunu belirlemek için pilot deneyler yapılabilir. Stimülasyonun ödüllendirici olduğu gösterilmişse, lazer "Pretest" sırasında en az tercih edilen bölmeye ve uyarım engeledici ise en çok tercih edilen bölmeye birleştiğinde olacaktır. Böylece, sunulan RT-PP protokolü lazer stimülasyon rastgele iki ana bölme (tarafsız tasarım) herhangi bir atanmış değildir anlamında önyargılı bir tasarım izler, ancak farenin herhangi bir ilk tercihi önlemek için seçilir. Diğer ana bölmeye veya iki ana bölmeyi birbirine bağlayan nötr bölmeye giriş, intrakranial ışık stimülasyonuna yol açar ve bu nedenle ışıkla eşleşmez. Bu seanslar, belirli nöronal popülasyonların uyarılmasının ödüllendirici veya aversif özelliklerinin gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesini sağlar. "Faz 1"in son gününde, herhangi bir uyarılma olmadan 15 dk oturum gerçekleşir. Bu oturum, uyarım ve alındığı ortam arasındaki İlişkisel öğrenmeden kaynaklanan koşullu yanıtları ("CR") ele almaya hizmet eder. "Faz 1"den en az üç gün sonra, "Ters Aşama" " " Faz1" ile aynı yapıyı takip eden gerçekleşir, ancak daha önce eşleşmeyen ana bölme artık ışık stimülasyonu ile eşlenmiştir. "Faz 1" durumunda olduğu gibi, iki stimülasyon seansı "CR" seansı takip edilir. "Ters Evre" farenin davranışının optogenetik stimülasyona bağlı olduğunu ve rastgele parametrelerle ilişkili olmadığını doğrulamak için kullanılır. RT-PP deneyinin her oturumu izleme yazılımı içinde ayrı ayrı programlanmalıdır. Geçerli protokol belirli bir yazılımdaki bu ayarları açıklar, ancak ışık kaynağına transistör-transistör-mantık (TTL) modülasyon sinyalleri gönderebilen diğer izleme yazılımları kullanılabilir.

İkinci protokol, Nötr Bölme Tercihi (NCP) paradigması olarak adlandırılan yeni bir kurulumu tanımlar. RT-PP'nin bu değiştirilmiş protokolü, dar ve saydam bileşimi sayesinde fare tarafından doğal olarak önlenen bağlantı koridorunun küçük boyutundan ve şeffaflığından yararlanır. Her iki ana bölmeyi ışık stimülasyonu ile eşleştirerek ve koridoru sadece ışık stimülasyonundan uzak bırakarak, NCP kurulumu, optogenetik stimülasyonun fareyi koridorda daha fazla zaman geçirmeye zorlayıp zorlamayacağı konusunda kullanılabilir. optogenetik stimülasyon. İki ışık eşleştirilmiş bölmede geçirilen süre ile koridorda geçirilen süre karşılaştırılarak, optogenetik kaynaklı nefretin doğrulanması yapılabilir. NCP deneyi, optogenetik farelerin tercihi gerçek zamanlı olarak ölçmek için stimülasyon (her biri 30 dakika) aldığı ve RT-PP'dekilere benzer koşullu yanıtları değerlendirmek için bir lazersiz seans (15 dk) aldığı iki ardışık günlük seanstan oluşur. Protokolü.

Aşağıda verilen RT-PP ve NCP protokolleri son zamanlarda ventral tegmental alanda bulunan nöronların farklı türleri (VTA) ödül ile ilgili davranış çeşitli yönleriyle ilgili nasıl çalışmada laboratuarımızda doğrulandı¹². Burada, RT-PP ve NCP protokollerinin uygulanmasını örneklemek için, dopamin taşıyıcı (DAT)-Cre¹⁹ ve veziküler glutamat taşıyıcı 2 (VGLUT2)-Cre²⁰ transgenik fareler stereotaktik olarak VTA'ya floksed channelrhopsin2 (ChR2) DNA yapısı taşıyan AAV enjekte edildi ve bunun üzerine VTA'nın üzerine optik fiber yerleştirildi. Sağlanan RT-PP ve NCP protokolleri kullanılarak bu farelerin analizi ile elde edilen davranışsal yanıtlar VTA içinde dopaminerjik ve glutamaterjik nöronların aktivasyonunun farklı davranışsal yanıtlara nasıl yol açtığını göstermektedir(Şekil 1).

RT-PP ve NCP paradigmaları için adım adım protokoller transgenik farelerin genotipleme, stereotaksik viral enjeksiyonlar ve fiberoptik yerleştirme, lazer kontrolü ve davranışsal izleme yazılımı programlama kadar bilgi ile sağlanır Değerlendirme. Ayrıca, protokolün stimülasyon parametreleri ve bilimsel sonucu etkileyebilecek deneysel yönleri açısından değiştirilmesine yönelik öneriler tartışılmıştır. Protokoller VTA bağlamında açıklansa da, ilgili Cre-driver ve floxed opsins gibi ilgili optogenetik araçları, mevcut olması koşuluyla, herhangi bir beyin alanı veya nöronal nüfus uygulanabilir.

Protokol

Bu çalışma her iki cinsten heterozigot DAT-Cre¹⁹ ve VGLUT2-Cre²⁰ fareler kullanılarak, yaş >8 hafta ve tartım >20 g. Tüm deneyler İsveç (Hayvan Refahı Yasası SFS 1998:56) ve Avrupa Birliği Mevzuatı (Convention ETS 123 ve Direktif 2010/63/EU) uyarınca yerel Hayvan Etik Komitelerinin izni ile gerçekleştirilmiştir.

1. Farelerin genotiplemesi

1. Transgenik farelerin genotipleme için kullanmak için bir kulak zımba kullanarak kulak biyopsileri alın.
2. Amaca yönelik astarlar kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) reaksiyonu gerçekleştirmek için kulak yumruklarını hazırlayın.
   NOT: Bu protokolde Cre-directed astarkullanılmıştır.
   1. Kulak yumruğu içeren her 1,5 mL tüpe 75 μL lysis tampon (tampon 1: 250 mM NaOH, 2 mM EDTA) ekleyin.
   2. 30 dakika boyunca 96 °C'de bir ısıtma bloğunda kuluçka.
   3. Numuneler 5 dakika soğumasını bekleyin ve ardından nötralizasyon arabelleği 75 μL ekleyin (arabellek 2: 400 mM Tris-HCl pH 8.0).
3. PcR'yi standart prosedürlere göre gerçekleştirin^12,21 uygun astarları kullanarak (burada: Cre FW 5'-ACGAGTGATGAGGTTCGCAAGA-3', Cre REV 5'-ACCGACGATGAAGGTTTAG-3').
   DİkKAT: PCR kaputunun altındaki buz üzerinde çalışın ve reaktifleri ve numuneleri kirletmemeye dikkat edin.
   1. PCR ana karışımını hazırlayın. Aşağıdaki hacimleri, uygun kontrol örnekleri de dahil olmak üzere kaç örnek analiz edileceklerine göre çarpın. Reaktifleri tek bir 25 μL son hacim reaksiyonu için aşağıdaki sırayla karıştırın: distile su (18,9 μL), MgCl₂ (2,5 μL), 10 mM dNTP karışımı ile 10x tampon (0,5 μL), 10 μM ileri astar (1°L), 10 μM ters astar (1 μL), 5 U/μL DNA polimeraz (0,1 μL) ve şablon DNA (1 μL; sonraki adımlarda eklenecektir).
      NOT: Geçerli sonuçlar elde etmek için her zaman negatif, pozitif ve boş (şablon DNA'sı olmadan) denetim ekleyin.
   2. PCR tüplere 24 μL ana karışım ekleyin.
   3. Her PCR tüpüne 1 μL şablon DNA (her fareden gelen kulak yumruğu) ekleyin.
   4. Şablon DNA'nın ana karışımın içinde olduğundan emin olmak için PCR tüplerini kısa bir süre santrifüj edin.
   5. Tablo 1'dekibisiklet programını kullanarak bir termal döngücü ile PCR gerçekleştirin.
4. Elektroforez kullanarak örnekleri çalıştırmak için bir agarose jel hazırlayın.
   NOT: Boyutu analiz edilmesi gereken örnek sayısına bağlıdır.
   1. Bir cam şişede 1x Tris-asetat-EDTA (TAE) tampon% 1 w / v agarose tozu ekleyin. Agarose tamamen eriyene kadar mikrodalga ısı, üzerinde kaynamaz düzenli olarak kontrol.
      DİkKAT: Yanıkları önlemek için önlemler alın.
   2. Jel yaklaşık 50 °C'ye kadar soğumasını bekleyin ve bir nükleik asit jellele lekesi (0,5 μL/50 mL jel) ekleyin.
   3. Jeli iyi taraklar içeren döküm tepsiye dökün ve tamamen katılaşana kadar oda sıcaklığında bırakın. Tarakları nazikçe çıkarın.
   4. Elektroforez tankını 1x TAE tamponuyla doldurun ve jeli tanka yerleştirin.
   5. DNA örneklerinin her birine 2 μL 1x DNA yükleme boyası ekleyin.
   6. Jelin ilk kuyusu DNA merdiveni 4 μL yükleyin, sonra kalan kuyularda örneklerin tam hacmi yüklemek için devam edin.
   7. Elektroforezin güç kaynağını 140 V'a ayarlayın ve 25−30 dk çalıştırın.
   8. Jeli uv kaynağının altına yerleştirin ve sonuçların fotoğrafını çekin.

2. Stereotaksik cerrahi

1. Genotiplemeden sonra, ayrı fareler Cre için pozitif olanları tutmak. En az 8 haftalık olana kadar bekleyin ve ameliyat yapmak için 20 g tartın.
   1. Çevreyi dezenfekte edin ve aseptik koşullarda ameliyat yapmak için cerrahi araçları sterilize edin.
   2. Ameliyattan önce farelere subkutan olarak analjezik 30 dk enjekte edin.
   3. Isofluran ile fareler anestezi (2−3% indüksiyon için normal hava ve 1.5−2.0% anestezi bakımı için). Farenin ayak parmaklarını hafifçe çimdikleyerek ağrı reflekslerinin yokluğunu test ederek yeterli anestezi seviyesine ulaşıldığından emin olun. Buna göre isoflurane teslimat ayarlayın.
   4. Fareyi stereotaksik aygıtın üzerine yerleştirin. Kuruluk nedeniyle göz lezyonu önlemek ve kafatası üst saç tıraş göz yağlayıcı ekleyin. Farenin sıcaklığını sabit tutmak için bir ısıtma yastığı kullanın.
   5. Kafatası derisinin altına 100 μL lokal anestezi enjekte edin ve 5 dakika etkisini bekleyin.
   6. İnsizyon bölgesini iyotla dönüşümlü olarak alkol veya steril salinin üç dairesel uygulaması ile hazırlayın. Steril bir pamuk ucu kullanın ve kesi hattından uygulamayı dışa doğru başlatın.
   7. Yavaşça forseps ile deri kaldırın ve kafatası yüzeyini ortaya çıkarmak için cerrahi makas ile rostrokaudal eksenboyunca ~ 1.5 cm bir kesi yapmak.
   8. Bir pamuk çubuğu kullanarak, periostkaldırmak için H₂O₂ çözeltisi uygulayın.
   9. Kafatasını steril salinle durulayın ve steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak kurulayın.
   10. Bregma ve lambda'yı bulun.
   11. Bregma ve lambda üzerine stereotaksik çerçeve üzerinde ayarlanmış enjeksiyon iğnesi ucu nu konumlandırarak düz kafatası hizalama sını tespit edin. Her pozisyon için ventral koordinatları ölçün ve karşılaştırın. Kafatası düz olduğunda hem bregma hem de lambda için ventral koordinat aynıdır. Değilse, baş pozisyonunu ayarlayın ve ölçümleri tekrar alın.
   12. Cre-bağımlı virüsün enjeksiyonunun ve optik fiberin implantasyonunun gerçekleşeceği ve mikro matkap la küçük bir delik açacağı Franklin ve Paxinos^22'yegöre bregma'dan pozisyon (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm) bulun ve işaretleyin.
   13. Hassas bir pompa kullanarak stereotaksik cihaza monte edilen 10 μL şırıngada 400 nL virüs yükleyin.
   14. İğneyi (34 G, yontma) dikkatlice düşürün ve VTA'ya (AP: -3,45 mm, ML: -0.2 bregma mm ve kafatası yüzeyinden -4.4 mm, Franklin ve Paxinos²²göre ) hassas pompa kullanarak 100 nL / dk enjeksiyon hızı.
   15. Enjeksiyondan sonra, virüsün difüzyonu için ek bir 10 dakika için yerinde iğne bırakın (Şekil 2A).
   16. İğneyi enjeksiyon bölgesinden yavaşça geri çek.
   17. Optik fiber ve diş çimento kompleksi stabilize edecek çapa vidaları sığdırmak için bir mikromatkap kullanarak küçük delikler olun.
   18. Bregma koordinatlarını tekrar alın ve Franklin ve Paxinos^22'yegöre optik fiberi (200 m çapında, 0,37 NA) şu anda yerleştirin: -3,45 mm, ML: bregma'dan -0,2 mm ve kafatası yüzeyinden -4,0 mm(Şekil 2B).
   19. Diş çimentosu kullanarak kafatasıüzerindeki lif sabit. Optik fiber ferule etrafında kafatası na sabitlemek için yeterli çimento uygulayın ama yama kablosu(Şekil 2C)bağlantı sağlamak için çimento ücretsiz ferule üst 3−4 mm bırakmaya dikkat edin.
       NOT: Bu beyin dokusu hasarına neden olabilir gibi çimento ile delik doldurmak için dikkat edin. Bunun olmasını önlemek için deliğe hemostatik malzemeler eklenebilir.
   20. Herhangi bir açık yara kapatmak ve en az iki hafta kurtarmak için hayvan bırakmak için doku tutkal veya emilebilir dikişkullanın. Ameliyattan sonra ek doz analjezik 12−24 saat verin.

3. Lazer kaynağının kontrolünün kurulması

1. Lazer kaynağını kontrol etmek için tek tahtamikrodenetleyicileri kullanın. Uygun yazılımı kullanarak bir komut dosyası yazın. Bilgisayara uygun bağlantı kablosunu kullanarak komut dosyasını mikrodenetleyici panosuna yükleyin.
   NOT: Komut dosyası, izleme yazılımından bir TTL kutusu üzerinden gelen dış modülasyon (giriş) ve stimülasyon parametrelerini kontrol etmek için lazere bir çıkış içermelidir. 20 Hz frekansında 10 ms darbe genişliği için, Tamamlayıcı Kodlama Dosyası'ndabulunan komut dosyasını kullanın.
2. Kartı lazere ve izleme donanımının TTL kutusuna bağlayın.
   1. TTL kutusunu tahtaya bağlamak için bir ağ kablosu kullanın (sağlanan komut dosyası için 5'i pin)(Şekil 3A,C).
   2. Lazerin harici modülasyon la kontrol edilebilmesi için ayarlandığından emin olun ve lazeri fc/PC kablosu kullanarak tahtaya bağlayın (verilen komut dosyası için 13 pin)(Şekil 3B,C).
   3. Uygun pimleri tahtanın zemin parçalarına bağlayın.
3. Lazer kaynağını optik fibere bağlayın.
   1. Lazer kaynağını döner bir derkiye bağlayın (Şekil 3D).
   2. Bir yama kablosunu(Şekil 3E)döner derder bağlayın.
   3. Döner dergiyi cihazın üzerinde ve kayıt alanının dışında sabitle. Fiber optik yama kablosunun uzunluğunun, farenin arenada zorluk çekilmeden hareket etmesini sağlamak için uygun olduğundan emin olun (Şekil 3F).

4. İzleme yazılımı içinde RT-PP yaklaşımı için denemenin ayarlanması

1. Arena kurulumını kalibre edin. Fiziksel aygıtın belirli bir bölümünü ölçmek için cetvel kullanın, Çizim Ölçeği sekmesinin altındaki yazılımdaki görüntüde ölçülen parçaya karşılık gelen bir çizgi çizin ve zaten bilinen değeri girin (Şekil 4'tekiadım 1).
2. Arenayı tasarla. Farelerin hareketinin kaydedildiği alanı çizin (Şekil 4'teki2.
3. Bölgeleri oluşturun. Sonunda lazer eşli, lazer eşleşmemiş ve "nötr" olarak atanacak bölgeleri çizin (Şekil 4'teki3.
4. Çakışan parametreler olmadığını doğrulamak için kurulumu doğrulayın(örneğin arena dışındaki bölgeler (Şekil 4'tekiadım 4)
5. Deneme parametrelerini sekme deneme kontrol ayarlarının altında ayarlayın (Şekil 4'tekiadım 5).
   1. 30 dk RT-PP oturumu için Şekil 5'teki 1.adımda gösterildiği gibi deneme süresini ayarlayın.
   2. "Donanım denetiminin" etkin olduğundan emin olun, faregirişinin izleme yazılımı aracılığıyla mikrodenetleyici panosuna ttl sinyalini tetikleyeceği lazer eşli bir bölme atayın. Şekil 5'te (adım 2) lazer le eşleştirilmiş bölme A bölmesidir. Geri alma aşaması için bölmeleri değiştirin, böylece B bölmesi lazerle eşlenecek ve A bölmesi eşleşmez. Bunu, yazılımda A ve B ile A'yı değiştirerek yapın.

5. NCP yaklaşımını kullanarak stimülasyonun önlenebilir özelliklerini test etmek için kurulumun değiştirilmesi

1. Daha önce açıklandığı gibi 4.1−4.4 adımlarını izleyin.
2. "Başvuru" kutusu ayarlarındaki "Tekrar et" seçeneği ile denemesüresini 30 dk olarak ayarlayın (Şekil 6'dakiadım 1).
3. A ve B bölmelerinin ayarlarıyla ilgili koşul kutusu için "Merkez noktası A ve Bölge B'nin herhangi birinde olduğunda" ekleyerek hem A hem de B bölgelerini lazer eşli olarak (Şekil 6'dakiadım 2) atayın. Hayvan nötr bölmede bulunduğunda lazerin kapanacağını unutmayın.

6. Lazer stimülasyon kullanarak bir deney yapmak

1. Algılama ayarlarını ayarlayın.
   1. Uygun algılama ayarlarını sağlamak için fareye benzemek için bir kukla kullanın.
   2. Kuklayı aygıtın bir bölmesine yerleştirin ve dinamik çıkarma ile otomatik kurulum kullanın.
   3. Kuklayı çıkarın ve karşı bölmeye yerleştirin. Kuklanın tam olarak algılandırDığından emin olun ve değilse, doğru algılamayı elde etmek için yazılım aracılığıyla ayarları ayarlayın.
      1. Bu adımda da uyarım olması gerektiği gibi çalışıp çalışmaz kontrol edin. Daha önce yapılandırılmış deneme kontrol ayarlarını kullanarak edinmeye başlayın ve kuklayı lazer eşleştirilmiş bölmeye yerleştirin ve uyarımı gerektiği gibi tetikleyip tetiklenmemeye karar ver. Daha sonra mankeni eşleşmemiş ve/veya nötr bölmeye yerleştirin ve uyarım Durdurulup durduruladığına bakın.
2. Lazer üzerindeki ahzıbı kullanarak lazer gücünü 10 mW'a ayarlamak için sensörlü bir güç ölçer kullanın(Şekil 3B). Lazer stimülasyon her kullanıldığında bu adımı gerçekleştirin.
   DİkKAT: Lazer ışığına doğrudan maruz kalma kalıcı göz hasarına neden olabilir gibi koruyucu göz ekipmanı kullanın.
3. Fareyi cihaza yerleştirin.
   1. Fareyi yavaşça kafenindışına alın ve fiber optik implantı seramik bir kılıf kullanarak fiber optik yama kablosuna bağlayın.
   2. Fareyi üç bölmeli aparatın nötr bölmesine hafifçe yerleştirin.
   3. Fare yazılım tarafından algılanana kadar bekleyin.
   4. Hayvanın ana bölmelere girmesini kısıtlayan dikey sürgülü kapıları çıkarın.
   5. Hayvanın herhangi bir rahatsızlık duymadan özgürce keşfetmesine izin verin.
      NOT: 6.2. adımın gerekli olmaması ve lazerin tüm zaman boyunca kapalı olması dışında hayvan uyarılma olmadığında da aynı prosedür uygulanır.

Sonuçlar

Üç bölmeli cihaz(Şekil 3F)ilaçların ödüllendirici etkilerini ele almak ve optogenetik kullanarak nöronların doğrudan uyarılmasının ödüllendirici veya yıkıcı özelliklerini gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için uygundur. İki ana bölmeden (20 cm [W] x 18 cm [L] x 25 cm [H]) ve bir küçük bağlantı bölmesi (20 cm [W] x 7 cm [L] x 25 cm [H]) oluşur. Ana bölmeler, ilişkilendirme öğrenmeyi kolaylaştırmak için farklı duvar ve zemin dokusuna ve desenlere sahiptir, bağlantı/nötr bölmedar ve saydam olduğundan fareler doğal olarak daha az zaman geçirirler. Yukarıda açıklandığı gibi, izleme yazılımı hareket ve her bölmede harcanan zaman da dahil olmak üzere farelerin çeşitli davranış parametreleri kaydetmek için kullanılabilir, ve lazer stimülasyon kontrol etmek için. TÜM RT-PP deneyi 8 seans boyunca gerçekleşir(Şekil 1A)ve doğrudan uyarımın ödüllendirici veya yıkıcı özelliklerinin (gün 3, 4, 6 ve 7) değerlendirilmesi ve önceki deneyimlere yanıt olarak pozitif veya negatif olan çağrışımların oluşumuna (gün 5 ve 8, "CR") izin verir.

İlk olarak, VTA'da AAV-ChR2-eYFP virüsü enjekte edilen DAT-Cre farelerini dopaminerjik nöronları hedef almak için test ettik. Literatüre uygun olarak, stimülasyonla eşleştirilmiş bölmede zaman geçirmeyi tercih eden farelerin(Şekil 1B,faz 1, gün 3 ve 4, mavi daireler, varyans [ANOVA], F_(2,18) = 141, p < 0.001; seans x bölmesinin etkisi_(12.108) = 42.1, p < 00.01; Tukey sonrası hoc testi eşleştirilmiş vs eşleşmemiş p < 0.001). Bölmelerin lazer stimülasyonla eşleşmesinin değiştirildiği tersine çevirme evresi, bu gözlemleri(Şekil 1B, gün 6 ve 7, mavi daireler, Tukey'in hoc sonrası testi eşlenmiş vs eşleşmemiş bölme p < 0.001) bu şekilde, faz 1'den elde edilen sonuçların yan önyargılar veya rastgele parametrelerle ilişkili olduğu ihtimalini dışlamıştır. RT-PP dört gün boyunca her bölmede harcanan zaman ortalama fareler lazer eşleştirilmiş bölmesi olarak eşlenmemiş (%~ 20) aksine zamanlarının yaklaşık% 70 geçirdidoğruladı ve nötr (~10%) bölmeler (Şekil 1B çubuk grafiği, tek yönlü RM ANOVA, stimülasyonun etkisi F_(2,6) = 139, p < 0.001, Tukey sonrası nasıl eşleştirilmiş vs eşleşmemiş ve nötr bölmeleri p < 0.001). Ayrıca, stimülasyon yokluğunda, 5 ve 8. Bu veriler literatüre uygun olup, mevcut yöntemin VTA'daki spesifik nöronal popülasyonların optogenetik stimülasyonunun ödüllendirici etkilerini araştırmak için güvenilir bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir.

Daha sonra VTA glutamaterjik nöronlar hedef için, yukarıdaki gibi VTA AAV-ChR2-eYFP enjekte VGLUT2-Cre fareler test etti. Bu deneyde, DAT-Cre farelertarafından gösterilenden farklı bir davranışsal fenotip gözlemledik. Böylece, fareler stimülasyonla eşleştirilmiş bölmeden kaçındı lar ve tüm RT-PP günlerinde eşleşmeden daha fazla zaman geçirdiler(Şekil 1C sol, iki yönlü RM ANOVA, F_(2,12) = 40,9, p < 0,001; seans x bölmesi etkisi_(12,72) = 16.1, p < 0.001; Tukey sonrası hoc testi eşleştirilmiş vs eşleşmemiş p < 0.001; Şekil 1C sağ, tek yönlü RM ANOVA etkisi stimülasyon F_(2,6) = 162, p < 0.001, Tukey sonrası hoc eşleştirilmiş vs eşleşmemiş ve nötr bölmeler p < 0.001). İlginçtir ki, "CR" gün 5 ve 8 sırasında, fareler daha önce eşleştirilmiş bölme (eşleştirilmiş ve eşleşmemiş bölmeleri arasında hiçbir fark) net bir kaçınma göstermedi. Lazer eşli bölmede geçirilen yetersiz zaman nedeniyle şartlı tepki eksikliğinin lazer aktivasyonu ile bunun gerçekleştiği ortam arasında ilişki oluşmasını engellediği mümkündür. Bu kaçınma fenotipini daha fazla araştırmak için, "nötr bölme tercihi" adını verdiğimiz, ncp kısaltılmış değiştirilmiş bir protokol kullandık. Bu deneyde, her iki ana bölme stimülasyonla eşleştirilmiş ve nötr bölme stimülasyonsuz kalmıştır(Şekil 7A). Stimülasyonun önleyici özelliklere sahip sayılmaması durumunda farenin bundan kaçınmak için daha küçük, nötr bölmede zaman geçirmek zorunda kalınacağını varsaydık. Nitekim, stimülasyon her iki gün (Stim1 ve Stim2) fareler nötr bölmesi (% yaklaşık% 80) zaman çoğunluğu geçirdi eşleştirilmiş bölmelerle karşılaştırıldığında(Şekil 7B,C; sol: F_(2,8) = 70,9, p < 0.001; seans x bölmesinin etkisi F_(4,16) = 6,9, p = 0.002, Tukey sonrası hoc "Stimulation 1" nötr bölme vs bölmesi 1 ve 2 p < 0.01, "Stimulation 2" nötr bölme vs bölmesi 1 ve 2 p < 0.001; sağ: tek yönlü RM ANOVA, stimülasyon F_{etkisi (2,2)} = 54, p 0.018, Tukey sonrası hoc testi eşleştirilmiş 1 ve 2 vs nötr p < 0.05). RT-PP testi sırasında "CR" günlerinde olduğu gibi, fareler bölmeler ve stimülasyon arasında negatif ilişki oluşturmuş gibi görünmüyordu; diğer bir deyişle, stimülasyon (CR) yokluğunda, tüm bölmeleri aynı derecede araştırdılar(Şekil 7B, eşleştirilmiş bölmelerde harcanan zaman ile nötr bölme arasında fark yoktur). Bu deneylerin sonuçları RT-PP kurulumu sırasında gözlenen davranışsal fenotipdoğruladı ve bu şekilde hem RT-PP hem de NCP paradigmalarının kombinatoryal uygulanmasını desteklemiştir.

Şekil 1: RT-PP paradigmasında optogenetik kullanılarak yapılan davranışsal testler. (A) Deneylerin zaman çizelgesinin şematik gösterimi. (B,C) Sol üstte: DaT-Cre (N = 10) ve VGLUT2-Cre (N = 7) fareler için RT-PP deneyi boyunca her bölmede harcanan zaman yüzdesini temsil eden grafik AAV-ChR2-eYFPile enjekte edilir. Mavi daireler: lazer eşleştirilmiş bölmesi; beyaz, siyah daireler: ana bölmeler; gri daireler: nötr bölme. Sağ üst: 3, 4, 6 ve 7 (RT-PP) günlerinde her bölmede geçirilen ortalama zaman yüzdesi. Alt: Bir DAT-Cre ve VGLUT2-Cre fare için her bölmede harcanan zamanın temsili ısı haritaları. Tüm veriler normalde dağıtıldı (Shapiro-Wilk testi). Sonuçlar ortalama ± SEM. ***p < 0.001 eşleştirilmiş vs eşleşmemiş olarak sunulur; #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 eşleştirilmiş vs nötr bölme; §§p < 0.01, §§§p < 0.001 eşleşmemiş vs nötr bölme. Bu rakam Bimpisidis ve ark.^12'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Optogenetik deneyler için cerrahi işlem. (A) VTA'da Cre-bağımlı viral vektör enjeksiyonu. (B) Optik fiberin enjeksiyon bölgesinin üzerine yerleştirilmesi. Stabilizasyon için kullanılan çapa vidalarına dikkat edin. (C) Diş çimentosu kullanılarak kafatası üzerindeki elyafın kalıcı olarak sabitlemesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Optogenetik deneylerinde kullanılan ekipmanlar. (A) Çalışmalarda kullanılan TTL kutusu. İzleme yazılımından giriş alır ve Mikrodenetleyici panosuna TTL sinyalleri gönderir. (B) Deneylerde kullanılan lazer kaynağının ön (üst) ve arka görünümü (alt). (C) Lazer stimülasyonunu kontrol etmek için kullanılan mikrodenetleyici panosu. TTL kutusundan lazer kaynağına olan bağlantıları not edin. (D) Döner mafsal. (E) Deneylerde kullanılan fiber optik yama akoru. (F) RT-PP ve NCP deneyleri için kullanılan üç bölmeli aparat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: İzleme yazılımı içindeki alan ve bölgelerin tasarlanması. Adım 1: Kurulumun kalibrasyonu. Adım 2: Tüm arenanın çizimi. Adım 3: Arena içinde çizim bölgeleri. Adım 4: Kurulum doğrulaması. Adım 5: Zaman ve uyarım parametrelerini ayarlamak için Deneme Denetimi Ayarları sekmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: İzleme yazılımı içinde bir RT-PP deneyinin zaman ve stimülasyon parametrelerinin ayarlanması. Süre (adım 1) ve ışık stimülasyonu için koşullar (adım 2) için özel kurallar ekleme. Koşullar kolayca geri alma aşaması için gereksinimleri uyacak şekilde değiştirilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: İzleme yazılımı içinde NCP deneylerinin zaman ve uyarım parametrelerinin ayarlanması. Stimülasyon seanslarının süresi (adım 1) RT-PP için olanlara benzer, ancak ışık stimülasyon aktivasyonu için koşullar (adım 2) farklıdır. Her iki ana bölmeye giriş (burada Bölge A ve Bölge B olarak adlandırılır) optogenetik stimülasyonla sonuçlanır ve bu uyarı, sadece fare nötr bölmeye girdiğinde sonlandırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: NCP paradigmasında optogenetik kullanılarak yapılan davranışsal testler. (A) Deneysel kurulumun şematik gösterimi. (B) Sol: Iki günlük stimülasyon sırasında (Stim1 ve Stim 2) ve VTA'da AAV-ChR2 enjekte edilen VGLUT2-Cre fareler için koşullu tepki (CR) seansı sırasında her bölmede harcanan sürenin yüzdesini temsil eden grafiktir (N = 5). Sağ: NCP'nin uyarılmasının iki günü boyunca her bölmede harcanan ortalama zaman yüzdesi. (C) Uyarım günlerinden birinde bir VGLUT2-Cre fare için her bölmede harcanan zamanın temsili ısı haritası. Veriler normalde dağıtıldı (Shapiro-Wilk testi). Sonuçlar ortalama ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 eşleşmemiş vs eşleştirilmiş 1 ve eşleştirilmiş 2 bölme olarak sunulmaktadır. Bu rakam Bimpisidis ve ark.^12'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Adım	Sıcaklık	Süre	Döngü
1. İlk denatürasyon	95 °C	4 dk	1
2. Denatürasyon	95 °C	30 s	30
3. Annealing	55 °C	30 s
4. Uzantı	72 °C	40 s
5. Son uzatma	72 °C	6 dk	1
6. Bekletin	4 °C	Deneyci tarafından durdurulana kadar	1

Tablo 1: PCR bisiklet programı.

Ek Kodlama Dosyası. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Tartışmalar

Bu çalışmada, farelerde optogenetik kullanarak farklı yer tercih iami analizlerinin nasıl yapılacağına iliş iki adım adım protokol sunmuz. Özetlenen protokoller VTA nöronların ödüllendirici veya aversive davranışsal fenotipleri değerlendirmek için kullanılmıştır (Şekil 1 ve Şekil 6)¹², ancak diğer beyin bölgelerinde nöronların davranışsal rolünü keşfetmek için de kullanılabilir.

Birkaç yeni çalışmalar iki bölmeli RT-PP paradigmaları tarif var^23,24 ve üç bölmeli cihazlar^{13,14,15,16,17,18}. Mevcut protokoller, RT-PP ve NCP protokollerinin, kötüye kullanım ilaçlarının uygulanmasına yönelik davranışsal etkilerini değerlendirmek için Geleneksel olarak CPP deneylerinde kullanılanlara benzeyen üç bölmeli bir cihazdaki ayrıntılı kurulumlarını açıklayınız. Sonuçlar burada yalnızca farenin her bölmede geçirdiği sürenin yüzdesi olarak sunulsa da, izleme yazılımı bölgelere geçişler, hız, hareketsiz harcanan zaman ve daha fazlası gibi diğer birçok davranışsal parametrelerin analizine olanak tanır. Farklı parametrelerin analizi verilerin yorumlanması açısından önemli olabilir.

Mevcut RT-PP protokolleri esnektir ve farklı stimülasyon desenlerinin ödüllendirici etkileri olup olmadığını test etmek için değiştirilebilir. Lazer kontrolü parametreleri, mikrodenetleyici panosunun komut dosyası aracılığıyla veya kurulumçok yönlülüğünü gösteren izleme yazılımı içinde kolayca değiştirilebilir. Dopaminerjik ve glutamaterjik nöronlar ve terminalleri 13^,14^,16,^17,18,^23,24,^25,26,27) dopaminerjik ve glutamaterjik nöronlar ve bunların terminalleri çalışma önceki çalışmalarda uygulanan frekansların aralık içinde, ve bazen daha düşük bir 20 Hz stimülasyon frekansı öneririz. Son çalışmalar, yüksek stimülasyon frekanslarının davranışlar üzerinde alt frekanslara göre ters etkilere sahip olabileceğini ve bu etkilerin daha yüksek frekansların neden olduğu bir depolarizasyon bloğu aracılığıyla aracılık ettiğini göstermiştir²⁸. Benzer şekilde, lateral preoptik alanda glutamaterjik ve GABAerjik nöronlar uyarıcı davranışsal çıkış farklılıkları gösterilmiştir¹⁵. Bu çalışmalar VTA daha farklı alanlarda nöronların incelenmiş ve en büyük etkileri non-glutamaterjik nöronların yüksek frekansları gözlenmiştir^15,28. 20 Hz bizim seçim glutamaterjik ve dopaminerjik VTA nöronlar değişen stimülasyon frekansları ile gösteren önceki çalışmalara dayanmaktadır, ödül ile ilgili davranışsal çıkış önemli ölçüde değişmiş değildir^24,26.

Ayarlanabilen ve deneysel sonucu etkileyebilecek ek bir parametre de ışık kaynağının gücüdür. Yüksek lazer gücü, bazı deney türlerinde yararlı olabilecek ancak sıcaklık^5'tekiartışın dezavantajı ile ışıkla uyarılmış alanın boyutunu artırabilir. Nitekim, yeni bir çalışma da sıcaklık lazer kaynaklı artışlar beyin fizyolojisi değiştirebilir ve davranışsal ölçümleri etkileyebilir göstermiştir²⁹. Bu gözlemler, deneysel tasarıma opsin-negatif kontrollerin dahil edilebisinin önemini vurgulamaktadır. Mevcut protokolde, biz benzer ve daha önce VTA¹⁶dopaminerjik ve glutamaterjik nöronlar uyarılmasında etkili olduğu gösterilmiştir 10 mW lazer gücü kullanılır^,24,26. Deneyler kurulurken, ilgi hücrelerinin bulunduğu alanın büyüklüğüne ve fiber optik ve yama kablosu özelliklerine (sayısal diyafram açıklığı, çekirdek çapı) dikkat etmek önemlidir. Bu parametreler lazer gücü ile ilgili hesaplamalar yaparken dikkate alınması esastır. Ayrıntılı bilgi için Karl Deisseroth'un laboratuvarı(http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)tarafından geliştirilen hesap makinesi kullanılabilir.

Cre-Lox rekombinasyonunun histolojik doğrulaması, optogenetik deneyleri uygularken bir diğer kritik yönüdür. Rekombinasyon etkinliğinin doğrulanması, büyük bir hayvan grubunda herhangi bir davranışsal deneyin başlamasından önce her zaman bir pilot kohortta yapılmalıdır. Bu etik nedenlerle değil, aynı zamanda optimize edilmiş deneysel çıktı için de önemlidir. Her viral yapı farklı nöronal türleri için değişken özgüllük gösterebilir ve farklı bölgelerde⁵, öngörülemeyen ve hatta yanıltıcı şekillerde deneyleri etkileyebilir bir parametre. Örneğin, daha önce DAT-Cre farelerin VTA AAV5 virüslerinin Cre-Lox rekombinasyon deseni doğruladı ve tek taraflı enjeksiyonlar ilgi alanının çoğunluğu hedef için yeterli olduğunu bulundu. Daha sonra VTA içinde uzamsal olarak kısıtlı alt popülasyonları incelediğimizde, nörod6 ekspresyonu ile karakterize bir tane gibi, ikili viral enjeksiyonların optogenetik ışık stimülasyonu üzerine daha belirgin davranışsal etkiler veren daha fazla sayıda nöronu hedeflemek için daha verimli olduğunu gözlemledik¹². Ayrıca, cerrahiden davranışsal deneylerin başlatılmasına kadar olan zaman dikkatle ele alınmalıdır. İki hafta bir ChR2 DNA yapısı için yeterli zaman biz burada göstermek gibi hücre organlarıifade edilecek, ama daha uzun bekleme süreleri (~ 8 hafta) araştırmacı projeksiyon alanlarında stimülasyon etkisini test ise gerekli olabilir^13,14,15,17.

VTA'daki nöronları incelerken enjekte edilen virüsün hacminin (bizim durumumuzda 300 nL) uygun olabileceğini, ancak transdüksiyonun etkinliğine ve çalışılan yapının büyüklüğüne bağlı olarak hacim ve titrenin ayarlanması gerektiğini belirtmekte yarar vardır. Ayrıca, mediolateral eksene uzak bir mesafede bulunan ikili yapılar için, ikili enjeksiyonlar yapmak ve aynı zamanda her iki yarımkürede aktivasyon / inhibisyon sağlamak için ikili fiberoptik implant gerekli olabilir.

Son olarak, Cre-Lox rekombinasyonunun verimliliğini doğrulamak ve doğrulamak ve optik fiberin istenilen yerde doğru implantasyon bölgesini doğrulamak için her zaman post-mortem histolojik analiz yapmak gereklidir. Beklenmeyen, aşırı kısıtlı veya aşırı Cre-Lox rekombinasyon amaçlanan alanın sınırları dışında Cre ifade nöronların bilinmeyen dağılımı nedeniyle oluşabilir, ya da virüs serotipi farklılıklar nedeniyle, virüsün kötü kullanımı, tıkanma virüs teslimi veya cerrahi ile ilgili diğer sorunlar için şırınga. Güvenli sonuçlar elde etmek için davranışsal değerlendirmelerin istatistiksel sonuçlarını doğrulamak için tatmin edici Cre-Lox rekombinasyon ve doğru fiberoptik-implantasyon doğrulaması yapılmalıdır.

Burada iki davranışparadigmasının nasıl kullanılabileceğinigösteren veriler açısından, RT-PP paradigmasında DAT-Cre farelerin analiz edilerek VTA'daki dopaminerjik nöronların optogenetik uyarılmasıyla elde edilen ışık eşleştirmeli tarafın önemli tercihi, önceki bulgulara dayanarak beklenmektedir^{23,24,25,26,27} ise VGLUT2-Cre tarafından gösterilen bu tarafın kaçınması tahmin edilmemektedir. VTA VGLUT2 nöronlar ve projeksiyonları hem ödül ve kaçınma dahil olduğu gösterilmiştir^{16,17,24,30,31}, ve bu nedenle daha ayrıntılı olarak mevcut RT-PP kurulum gözlenen belirgin kaçınma davranışı değerlendirmek için NCP analizi yapıldı. VTA glutamaterjik nöronların stimülasyonun aversif özelliklerini doğrulamak için tek ışık sızma eşlenmiş bölme olarak dar, şeffaf koridor kullanarak, bu özel üç bölmeli kurulum, bu nöronların optogenetik aktivasyon bir aversive yanıtneden olduğu açıktır. Rt-PP ve NCP protokollerinin kullanımından yararlanabilecek durumları örneklemek için burada gösterilen bu deneyler, yakın zamanda yayınlanan bir çalışmanın parçasıydı ve bu bulgulara ilişkin tüm veri seti ve bu bulgularla ilgili tartışmalar bu yayında bulunabilir¹².

NCP ek olarak, kaçınma onaylamak için alternatif yollar lazer aktivasyonu için arenanın geri kalanını eşleştirirken açık bir alan alanı içinde bir alanın güçlü aydınlatma dahil, ya da fare lazer stimülasyon sona erdirmek için davranış belirli bir desen gerçekleştirmek zorunda aktif bir kaçınma görevi gerçekleştirmek¹⁵.

Özetlemek gerekirse, açıklanan protokoller, ödül ve nefret içinde nöronal aktivasyonrolünü çözmek için RT-PP ve NCP analizinin en verimli şekilde nasıl başarılı bir şekilde gerçekleştirileceklerine iliş etti. Bilimsel hipoteze bağlı olarak, bu protokoller kullanılarak bir dizi parametre analiz edilebilir ve her protokol, belirli beyin lere hitap etmek için optogenetik uygulayan optimize edilmiş davranış analizleri için diğer doğrulanmış paradigmalarla da birleştirilebilir. alanlar ve ilgi nöronları.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV-Cre dependent virus	UNC Vector Core	-	a great variety of viruses to suit any project's needs
Agarose	VWR Life Science	443666A
Buffer for PCR	KAPA BIOSYSTEMS	KB1003	10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x
Bupivacaine (Marcain)	Aspen	N01BB01	local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription
Carprofen (Norocarp)	N-Vet	27636	anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription
dNTP set	Thermo Fisher Scientific	R0181	100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed
DNA ladder	Thermo Fisher Scientific	SM0243	100 bp, 50 μg Gene Ruler
DNA loading dye	Thermo Fisher Scientific	R0611	6x, dilute to 1x before using
Ear puncher	AgnThos	AT7000	ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals
Fiberoptic patchcords	Doric Lenses	MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25
Implantable fiberoptics	Doric Lenses	MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT	the properties of the fibers might change depending on the experiment
Infusion pump for virus injections	AgnThos	Legato 130	contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame
Isoflurane (Forane)	Baxter	N01AB06	Volatile anesthetic, requires prescription
Jewelry screws	AgnThos	MCS1x2
Laser source	Marwell Laser Systems	CNI MBL-III-473-100mW
Microcontroller board	Arduino	"Uno" board	can be ordered from several companies
Microdrill	AgnThos	1474	could be ordered with or without stereotaxic holder
Needle (34G)	World Precision Instruments	NF36BV
Nucleic Acid gel stain - GelRed	Biotium	41003-T
PCR tubes	Axygen	PCR-0208-CP-C
Power meter	Thorlabs	PM100D
Place Preference Apparatus	Panlab	76-0278
Rotary joint	Doric Lenses	FRJ_1x1_FC-FC
Sleeves	Doric Lenses	SLEEVE_ZR_1-25	mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber
Stabilization cement	Ivoclar Vivadent	Tetric EvoFlow
Syringe (10ul)	World Precision Instruments	NanoFil
Taq polymerase	KAPA BIOSYSTEMS	KE1000	500U
TAE buffer	Omega BIO-TEK	SKU:AC10089	50x concentration, has to be dilluted before use
Thermal cycler	BIO-RAD S1000	1852148	necessary to perfrom PCR reactions
Tissue glue	AgnThos	Vetbond
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
TTL box	Noldus	Noldus USB-IO box
UV transilluminator	Azure Biosystems	c200 model