Tüm Genom Nanopore Sıralama doğrulama, Örnek olarak Usutu Virüs kullanarak

Özet

Daha önce bir nanopore sıralama platformu üzerinde amplicon tabanlı tüm genom Usutu virüsü (USUV) sıralama için bir protokol doğruladı. Burada, daha ayrıntılı olarak kullanılan yöntemleri açıklar ve nanopore R10 akış hücresinin hata oranını belirleriz.

Özet

Tüm genom dizilimi viral salgınları karakterize etmek ve izlemek için kullanılabilir. Nanopore tabanlı tüm genom dizileme protokolleri birkaç farklı virüs için tanımlanmıştır. Bu yaklaşımlar, belirli bir virüsü veya genetik olarak ilişkili virüs grubunu hedeflemek için kullanılabilecek örtüşen amplikon temelli bir yaklaşım kullanır. Virüs varlığının teyidine ek olarak, dizileme genomik epidemiyoloji çalışmaları için, virüsleri izlemek ve kökeni, rezervuarları ve bulaşma modlarını çözmek için kullanılabilir. Bu tür uygulamalar için, kullanılan platformile ilişkili hata oranının olası etkilerini anlamak çok önemlidir. Klinik ve genel sağlık ortamlarında rutin uygulama, protokoldeki her önemli değişiklikle belgelenmeyi gerektirir. Daha önce, nanopore sıralama platformunda tüm genom Usutu virüs dizilimi için bir protokol (R9.4 flowcell) Illumina sıralama doğrudan karşılaştırıldığında doğrulandı. Burada, R10 akış hücresi ile Illumina dizilimi arasındaki karşılaştırmayı örnek olarak kullanarak gerekli okuma kapsamını belirlemek için kullanılan yöntemi açıklıyoruz.

Giriş

Üçüncü nesil dizi teknolojilerinde hızlı gelişmeler, viral salgınlar sırasında gerçek zamanlı sıralamaya yakın bir şekilde ilerlememizi sağlar. Genetik bilginin bu zamanında kullanılabilirliği viral patojenlerin kökeni ve evrimini belirlemek için yararlı olabilir. Ancak yeni nesil sıralama alanlarında altın standartlar, hala ikinci nesil sequencers vardır. Bu teknikler, emülsiyon PCR veya klonal köprü amplifikasyonu sırasında klonal amplifikasyon gibi belirli ve zaman alıcı teknikler kullanır. Üçüncü nesil sequencers ucuz, el ve basitleştirilmiş kütüphane hazırlama metodolojileri ile birlikte gelir. Özellikle sıralı cihazın küçük boyutu ve düşük satın alma fiyatı onu konuşlandırılabilir, alana uygun sıralama için ilginç bir aday yapar. Bu örneğin Sierra Leone Ebola virüs salgını sırasında ve^Brezilya'dadevam eden arbovirüs salgını soruşturmaları sırasında görülebilir 1^,2,3. Ancak, bildirilen yüksek hata oranı⁴ nanopore sıralama kullanılabilir uygulamaları sınırlayabilir.

Nanopore sıralama hızla gelişmektedir. Yeni ürünler piyasada düzenli olarak mevcuttur. Buna örnek olarak, DNA molekülünün her iki iplikçiğinin dizilemesini sağlayan 1D kare kitleri, böylece adlandırılan bazlar^5'in doğruluğunu artırma ve gözenek^6'dakiiki farklı durumda akımdaki değişimi ölçen R10 akış hücresinin geliştirilmesi verilebilir. Buna ek olarak, basecalling iyileştirmeler gibi geliştirilmiş biyo-informatik araçlar basecalling^{doğruluğunu artıracaktır 7}. En sık kullanılan basecallers biri, (örneğin, Albacore), 9 aylık bir süre içinde en az 12 kez güncellendi⁵. Son zamanlarda, üretici de varsayılan nanopore yazılım⁸uygulanan flip-flop denilen yeni bir basecaller yayımladı. Birlikte, tüm bu geliştirmeler daha doğru dizileri yol açacakve nanopore sequencer hata oranını azaltacaktır.

Usutu virüsü (USUV) Flaviviridae familyasından sivrisinek kaynaklı bir arbovirüstür ve yaklaşık 11.000 nükleotitlik pozitif iplikli RNA genomuna sahiptir. USUV esas olarak büyük gri baykuşlar ve karakuşlar etkiler^9,10, diğer kuş türleri de USUV enfeksiyonu duyarlı olmasına rağmen¹¹. Son zamanlarda, USUV da kemirgenler ve sivri fareler de tespit edildi virüs iletimi potansiyel rolü bilinmeyen kalır rağmen¹². İnsanlarda, asemptomatik enfeksiyonlar kan bağışçılarında tarif edilmiştir^13,14,15,16 USUV enfeksiyonları da ensefalit veya meningo-ensefalit ile ilişkili olduğu bildirilmiştir^17,18. Hollanda'da USUV ilk olarak 2016 yılında yabani^{kuşlarda, 2018} yılında ise asemptomatik kan bağışçılarında tespit edilmiştir.¹⁴ USUV'nin ilk tespitinden bu yana, sonraki yıllarda salgınlar rapor edilmiştir ve tüm genom dizilemesi de dahil olmak üzere gözetim, şu anda daha önce naif bir popülasyonda bir arbovirüsün ortaya çıkmasını ve yayılmasını izlemek için devam etmektedir.

Ebola virüsü, Zika virüsü ve sarı humma^virüsü3,^19,,20gibi diğer virüsler için açıklanan benzer, biz tam uzunlukta USUV²¹diziiçin bir astar seti geliştirdik. Bu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı yaklaşım, numunelerde beyin örnekleri gibi yüksek oranda kontamine olmuş numune tiplerinden tam uzunlukta USUV genomlarının 32 civarında ct değerine kadar geri kazanılmasına olanak sağlar. Amplicon tabanlı sıralama yaklaşımının yararları metagenomik sıralamaya göre daha yüksek duyarlılık ve daha yüksek özgüllüktür. Amplicon tabanlı bir yaklaşım kullanmanın sınırlamaları, dizilerin tüm suşlara uyan astarlar tasarlamak için benzer olması ve astarların virüs çeşitliliği hakkındaki mevcut bilgimiz üzerine tasarlanmasıdır.

Üçüncü nesil sıralamadaki sürekli gelişmeler ve gelişmeler göz önüne alındığında, sıralayıcının hata oranını düzenli olarak değerlendirmek gerekir. Burada, nanopore performansını doğrudan Illumina sıralamasına karşı değerlendirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem en son R10 akış hücresi ile oluşturulan dizilere uygulanır ve flip-flop basecaller'ın en son sürümü ile basecalling gerçekleştirilir.

Protokol

NOT: Kullanılacak yazılım araçları listesi: usearch v11.0.667; kas v3.8.1551; gözenek 0.2.4; cutadapt 2.5; minimap2 2.16-r922; samtools 1.9; trimmomatic 0.39; bbmap 38.33; maça v3.13.1; kma-1.2.8

1. Astar tasarımı

1. Genel veya özel veri koleksiyonlarından ilgili tüm genom dizilerini indirmek veya almakla başlayın. Örneğin, NCBI veritabanı²²tüm tam uzunlukta USUV genomları (taxid64286) almak. USUV yaklaşık 11.000 nükleotitten oluşan bir genomuyguluyor, bu yüzden sadece dizileri 8.000-12.000 nükleotit uzunluğunda geri alır. Bunu aşağıdaki arama girişini kullanarak yapın:
   - taxid64286[Organizma:noexp] VE 8000[SLEN]:12000[SLEN].
   1. Gönder 'e tıklayın | Tam Kayıt | Dosya; Format = FASTA'yı kullanın ve Dosyayı oluşturun.
2. Başvuru dizileri kümesini küçültmek için, veri kümesinden %99'dan fazla nükleotit kimliğine sahip yinelenen dizileri veya dizileri kaldırın. Bunu usearch^23'tenküme hızlı seçeneğini kullanarak yapın. Komut satırında girin:
   - usearch -cluster_fast All_USUV.fasta -id 0.99 -centroids All_USUV_dedup.fasta
3. Astaroluşturmak için dizilerin hizalanmış olması gerekir. Bu MUSCLE²⁴kullanılarak yapılır. Komut satırında girin:
   - kas -in All_USUV_dedup.fasta -çıkış All_USUV_dedup_aligned.fasta -log log_muscle.txt
   NOT: Tutarsızlıkları kontrol etmek için hizalamayı el ile incelemek esastır. Bunlar gerekirse el ile düzeltilebilir ve uçları çoğu genom dizisinin uzunluğuna göre kesilebilir.
4. Primal tam uzunlukta amplicon sıralama için kullanılabilir astar bir taslak seçim yapmak için kullanılır^19. Hizalamayı ilkel web sitesine(http://primal.zibraproject.org/)yükleyin ve tercih edilen amplicon uzunluğunu ve farklı ampliconlar arasındaki çakışma uzunluğunu seçin. primal.zibraproject.org gidin, Şema adınıdoldurun, hizalanmış fasta dosyasını yükleyin, amplicon uzunluğunu seçin, üst üste bindirin ve düzeni oluşturun.
5. Kullanılabilir tam USUV dizilerinin tam kümesini hizalayın (küçültülmüş veya çoğaltılmış kümeyi değil). Komut satırında girin:
   - kas -in All_USUV.fasta -çıkış All_USUV_aligned.fasta -log log_muscle.txt
   NOT: Oluşturulan astarları tam hizalamaya göre eşleyin (yinelenen hizalamayı kullanmayın), hataları el ile düzeltin ve en fazla 5 dejeneratif astar pozisyonu ekleyin.

2. Multipleks PCR

1. Tasarlanmış astarlar ve nanopore ve Illumina sıralama kullanarak multipleks PCR gerçekleştirin. USUV için multipleks PCR daha önce açıklandığı gibi yapıldı^19,21.
2. Flip-flop sürüm 3.0.6.6+9999d81 ile taban araması yapın.

3. Nanopore verilerinden konsensüs dizileri oluşturmak için veri analizi

1. Tek bir nanopore sıralama çalışmasında birkaç örnek çokkatlı olabilir. Sekans çalışmasını yaptıktan sonra nanopore verilerini demultiplex. Bunun için Porechop^25'i kullanın. Kontaminasyonu önlemek ve doğruluğu artırmak için require_two_barcodes bayrağını kullanın. Komut satırında girin:
   - gözenek -i Run_USUV.fastq -o Run_USUV_demultiplex --require_two_barcodes
2. Demultiplexing sonra, cutadapt²⁶kullanarak astar dizileri (her iki yönde Primers_Usutu.fasta dosyasında gösterilir) kaldırın. Buna ek olarak, uzunluğu 75 nükleotitten daha kısa olan dizileri çıkarın. Konsensus sırasına suni önyargılar getirebildikleri için astarların kaldırılması gerekir. Komut satırında girin:
   - cutadapt -b dosyası:Primers_USUV.fasta -o BC01_trimmed.fastq BC01.fastq -m 75
3. Demultiplexed sıralı okumalar minimap2²⁷ kullanarak farklı referans suşları bir panel karşı eşlenebilir ve bir konsensüs dizisi samtools²⁸kullanılarak oluşturulabilir. Referans tabanlı hizalama yordamını ve bir örneğin konsensüs sırası oluşturma yordamını gösteren aşağıdaki örneği izleyin: BC01. Komut satırında girin:
   - minimap2 -ax harita-ont Random_Refs_USUV.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam
   - samtools sıralama BC01.bam > BC01_sorted.bam
   - bcftools mpileup -Ou -f Random_Refs_USUV.fasta BC01_sorted.bam | bcftools çağrı -mv -Oz -o BC01.vcf.gz
   - bcftools endeksi BC01.vcf.gz
   - kedi Random_Refs_USUV.fasta | bcftools konsensüs BC01.vcf.gz > BC01_consensus.fasta
4. Referans tabanlı hizalamalar için yakından ilişkili bir başvuru dizisinin kullanılması esastır. Bu nedenle, en yakın başvuru türünü belirlemek için oluşturulan konsensüs sırası ile bir BlastN araması gerçekleştirin. Bundan sonra, referans tabanlı hizalamayı en yakın başvuru gerilimi ile başvuru olarak tekrarlayın (adım 3.3 ve 3.4). Komut satırında girin:
   - minimap2 -ax map-ont Ref_USUV_BC01.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01_ref.bam
   - samtools sıralama BC01_ref.bam > BC01_sorted_ref.bam
   - bcftools mpileup -Ou -f Ref_USUV_BC01.fasta BC01_sorted_ref.bam | bcftools çağrı -mv -Oz -o BC01_ref.vcf.gz
   - bcftools endeksi BC01_ref.vcf.gz
   - kedi Ref_USUV_BC01.fasta | bcftools konsensüs BC01_ref.vcf.gz > BC01_ref_consensus.fasta

4. Illumina verilerinin analizi

1. Bu diziler sıralamadan sonra otomatik olarak demultiplexed edilir. Okur trimmomatic²⁹kullanılarak kalite kontrol edilebilir. Eşleştirilmiş uçlu Illumina dizileri için, doğru, yüksek kaliteli okumalar elde etmek için yaygın olarak kullanılan kesme medyan PHRED puanı 33 ve 75 minimum okuma uzunluğu kullanın. Komut satırında girin:
   - trimmomatic PE -phred33 9_S9_L001_R1_001.fastq.gz 9_S9_L001_R2_001.fastq.gz 9_1P.fastq 9_1U.fastq 9_2P.fastq 9_2U.fastq LEADING:3 TRAILING:3 SÜRGÜLÜ PENCERE:3:15 MINLEN:75
2. Cutadapt²⁶kullanarak yapay önyargılar getirebildiklerinden (her iki yönde de Primers_Usutu.fasta dosyasında belirtilen) astarları kaldırın. Buna ek olarak, aşağıdaki komutları kullanarak uzunluğu 75 nükleotitten daha kısa olan dizileri çıkarın. Komut satırında girin:
   - cutadapt -b o 9_1P_trimmed.fastq -p 9_2P_trimmed.fastq 9_1P.fastq 9_2P.fastq -m 75
3. De novo montaj önce, dizi okuma genom genelinde eşit bir kapsama için normalize edilebilir. SPAdes gibi de novo assemblers sırasını bir araya alırken dikkate okuma kapsamı almak bu önemlidir okur. Normalleştirmek BBMap paketi³⁰BBNorm kullanarak 50 bir okuma kapsama okur. Komut satırında girin:
   - bbmap/bbnorm.sh target=50 in=9_1P_trimmed.fastq in2=9_2P_trimmed.fastq out=Sample9_FW_norm.fastq out2=Sample9_RE_norm.fastq
4. Normalleştirilmiş okumalar SPAdes³¹kullanılarak monte edilen de novo'dadır. Varsayılan ayarlar tüm farklı kmers (21, 33, 55, 77, 99 ve 127) kullanılarak montaj için kullanılır. Komut satırında girin:
   - spades.py -k 21,33,55,77,99,127 -o Örnek9 -1 Örnek9.qc.f.fq -2 Örnek9.qc.r.fq
5. Harita QC minimap2 ve Geneious, Bioedit veya Ugene gibi programları kullanarak elde edilen konsensüs sırasına karşı hizalama küratörlük okur. Bu başve bitişik sonu kontrol etmek önemlidir.
   1. QC minimap2 kullanarak elde edilen konsensüs sıralama karşı QC okur hizalamak.
   2. Geneious/Bioedit/UGene'deki hizalamayı içeri aktarın.
   3. Özellikle genomun başlangıcını ve sonunu el ile inceleyin, düzeltin ve küratörlük edin.

5. Altın standart olarak Illumina verileri kullanarak nanopore sıralamahata profilini telafi etmek için gerekli okuma kapsamı belirlenmesi

1. Bu durumda amplicon 26, bir amplicon için eşleme okur seçin. Daha sonra, harita nanopore minimap2 kullanarak bu amplicon karşı okur. Amplicon 26 için sadece okuma eşleme seçmek ve fastq içine bam dosyası dönüştürmek için Samtools kullanın. Komut satırında girin:
   - minimap2 -ax harita-ont -m 150 Amplicon26.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam
   - samtools görünümü -b -F 4 BC01.bam > BC01_mapped.bam
   - samtools bam2fq BC01_mapped.bam | seqtk seq - -> BC01_mapped.fastq
2. Örneğin 200 sıranın rastgele seçilen alt kümeleri bin kez okur. Örneğin, 10'a değiştirmek, 10 sıralık bir alt kümenin bin katı rasgele seçilmesiyle sonuçlanır. Komut dosyası Ek Dosya 1olarak sağlanır. Komut satırında girin:
   - piton Random_selection.py
3. Rasgele seçilen tüm sıra okumalar amplicon 26'ya hizalanır. Okuma sırasını haritalamak ve hemen bir konsensüs dizisi oluşturmak için KMA^32'yi kullanın. -bcNano bayrağıyla gösterilen nanopore sıralama için optimize edilmiş ayarları kullanın. Komut satırında girin:
   - kma indeksi -i Amplicon26.fasta
   - random_sample dosya için*;
   - sampleID=${file%.fastq}
   - kma -i ${sampleID}.fastq -o ${sampleID} -t_db Amplicon26.fasta -mem_mode -mp 5 -mrs 0.0 -bcNano
   - bitti
4. Komut satırında oluşturulan konsensüs dizilerini aşağıdakileri kullanarak inceleyin:
   - kedi *.fsa > All_genomes.fsa
   - minimap2 -ax harita-ont Amplicon26.fasta All_genomes.fsa > All_genomes.bam
   - samtools sıralama All_genomes.bam > All_genomes_sorted.bam
   - samtools istatistikleri All_genomes_sorted.bam > stats.txt
   1. Hata oranı stats.txt başlığı hata oranı #mismatches / üsleri eşlenenaltında görüntülenir. Aşağıdaki komutla ekranda görüntüleyin:
      - grep ^SN stats.txt | kesme -f 2-
   2. Indels miktarı döngü başına #Indelsbaşlığı altında görüntülenir. Aşağıdaki komutla ekranda görüntüleyin:
      - grep ^IC stats.txt | kesme -f 2-

Sonuçlar

Son zamanlarda, akış hücresi sürümü (R10) yeni bir sürümü serbest bırakıldı ve DNA dizileri (sözde flip-flop basecaller) için elektronik akım sinyali dönüştürmek için kullanılan basecaller iyileştirmeler sundu. Bu nedenle, daha önce bir R9.4 akış hücresi ve Illumina Miseq enstrüman²¹üzerinde sıralanmış bir USUV-pozitif baykuş beyin dokusundan USUV yeniden sıralanmış var. Burada, Illumina sıralamaile doğrudan karşılaştırıldığında güvenilir konsensüs çağrısı için gerekli okuma kapsamını belirlemek için kullanılan yöntemi tanımladık.

Basecaller flip-flop ile birlikte yeni akış hücresi kullanarak, 40x'lik bir okuma kapsamının Illumina dizilimi ile karşılaştırıldığında aynı sonuçlarverdiğini gösteriyoruz. 30x'in okuma kapsamı , sıralanmış her 585.000 nükleotitte bir hataya karşılık gelen %0,0002'lik bir hata oranıyla sonuçlanırken, 20x'in okuma kapsamı sıralanmış her 63.529 nükleotitte bir hatayla sonuçlanır. 10x'in okunması, diziliher 3.312 nükleotitte bir hatayla sonuçlanır, yani tam USUV genomu başına üç nükleotitten fazla yanlış çağrılmaktadır. 30x'in üzerinde bir okuma kapsamı ile, hiçbir indels gözlendi. 20x'lik bir okuma kapsamı bir indel pozisyonunun algılanmasıyla sonuçlanırken, 10x'lik bir okuma kapsamı 29 pozisyonda indels ile sonuçlandı. Farklı okuma kapsamı kesintileri kullanılarak hata oranına genel bir bakış Tablo 1'degösterilmiştir.

Kapsama	Hatalar yineleme 1	Hata oranı yineleme 1	Indels:	Hatalar yineleme 2	Hata oranı yineleme 2	Indels:	Hatalar yineleme 3	Hata oranı yineleme 3	Indels:
10×	100	0.0274%	4	116	0.0297%	18	110	0.0282%	7
20×	4	0.0010%	0	6	0.0015%	1	7	0.0018%	0
30x	2	0.0005%	0	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0
40x	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0
50×	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0	0	0.0000%	0

Tablo 1: Nanopore sıralamahata oranına genel bakış. Her yineleme bin rasgele örneği temsil eder.

Ek Dosya 1: Rastgele seçim. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Tartışmalar

Nanopore sıralama sürekli gelişmektedir ve bu nedenle hata oranını izlemek için yöntemler için bir ihtiyaç vardır. Burada, nanopore sequencer hata oranını izlemek için bir iş akışı açıklar. Bu, yeni bir akış hücresi yayımlandıktan sonra veya basecalling'in yeni sürümleri serbest bırakılırsa yararlı olabilir. Ancak, bu, kendi sıralama protokollerini ayarlamak ve doğrulamak isteyen kullanıcılar için de yararlı olabilir.

Farklı yazılım ve hizalama araçları farklı sonuçlar verebilir³³. Bu yazıda, yaygın olarak kullanılan ve açık belgelere sahip serbestçe kullanılabilen yazılım paketlerini kullanmayı amaçladık. Bazı durumlarda, tercih genellikle daha kullanıcı dostu arabirimleri var ama için ödenmesi gereken ticari araçlar, verilebilir. Gelecekte, bu yöntem sıralı teknoloji veya basecalling yazılım büyük değişiklikler tercihen bu basecaller veya flowcell her güncellemeden sonra yapılmalıdır tanıtılır durumunda aynı örnek uygulanabilir, ancak mevcut gelişmelerin hızı göz önüne alındığında bu da sadece büyük güncellemeler sonra yapılabilir.

Sıralamadaki hata oranındaki azalma, daha fazla sayıda örneğin çokkatlı olmasını sağlar. Bu nedenle, nanopore sıralama zaten grip virüsü tanı için durumdur tanı tahliller için geleneksel gerçek zamanlı PCRs yerine daha yakın oluyor. Buna ek olarak, hata oranının azaltılması, örneğin küçük varyantların belirlenmesi ve yüksek iş sahibi tarafsız metagenomik sıralama için bu tekniğin kullanılabilirliğini artırır.

Protokoldeki kritik bir adım, yakın ve güvenilir başvuru dizilerinin kullanılabilir olması gerektiğidir. Astarlar virüs çeşitliliği hakkında güncel bilgilere dayanmaktadır ve arada bir güncellenmesi gerekebilir. Amplicon tabanlı sıralama yaklaşımı kurarken bir diğer kritik nokta, amplicon derinliğinde eşit bir denge elde etmek için astar konsantrasyonunun dengelenmesidir. Bu, bir dizi çalışmasında daha fazla örneğin çoklaşmasını sağlar ve önemli bir maliyet azaltmayla sonuçlanır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881
dNTPs	Qiagen	201900
FLO-MIN106 R10 flowcell	Nanopore	R10 flowcell
KAPA Hyperplus libarary preparation kit	Roche	7962436001
Library Loading Bead Kit	Nanopore	EXP-LLB001
Ligation Sequencing Kit 1D	Nanopore	SQK-LSK109
Native Barcoding Kit 1D 1-12	Nanopore	EXP-NBD103
Native Barcoding Kit 1D 13-24	Nanopore	EXP-NBD104
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix	NEB	M0367S
NEB Next Quick Ligation Module	NEB	E6056
NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module	NEB	E7546S
Protoscript II Reverse Transcriptase	NEB	M0368X
Q5 High-Fidelity polymerase	NEB	M0491
Qubit dsDNA HS Assay kit	Thermo Fisher	Q32851
Random Primers	Promega	C1181
RNAsin Ribonuclease Inhibitor	Promega	N2111