Farelerin Dorsal Raphe Çekirdeklerinde 5,7-Dihidroksitriptaminin Stereotaksik Enjeksiyonu ile Serotonerjik Nöronların Ortadan Kaldırılması

Özet

Bu protokol, superior sagital sinüsün yaralanmasını önlemek için açılı bir yaklaşım kullanılarak DRN'ye stereotaksik 5,7-dihidroksitriptamin enjeksiyonu ile dorsal raphe serotonerjik nöronların stabil kaybı ile dorsal raphe nucleus (DRN) lezyonlu bir fare modelini >(deneysel farelerde %90 sağkalım oranı) tanımlar.

Özet

Stereotaksik enjeksiyon, bileşiklerin veya virüslerin kemirgenlerde hedeflenen beyin bölgelerine doğrudan verilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Dorsal raphe nukleustaki (DRN) serotonerjik nöronların doğrudan hedefi, superior sagital sinüsün (SSS) altındaki konumu nedeniyle aşırı kanamaya ve hayvan ölümüne neden olabilir. Bu protokol, DRN'de stabil %>70 5-HT pozitif hücre kaybı ile DRN serotonerjik nöron lezyonlu fare modelinin (%>90 sağkalım oranı) oluşumunu tanımlar. Lezyon, SSS'nin yaralanmasını önlemek için açılı bir yaklaşım (ön/arka yönde 30°) kullanılarak DRN'ye seçici bir serotonerjik nörotoksin 5,7-dihidroksitriptaminin (5,7-DHT) stereotaksik enjeksiyonu ile indüklenir. DRN serotonerjik nöron lezyonlu fareler, DRN lezyon cerrahisinin başarısını doğrulamaya yardımcı olan anksiyete ile ilişkili davranış değişiklikleri gösterir. Bu yöntem burada DRN lezyonları için kullanılır, ancak orta hat yapılarından kaçınmak için açısal enjeksiyonlar gerektiren diğer stereotaksik enjeksiyonlar için de kullanılabilir. Bu DRN serotonerjik nöron lezyonlu fare modeli, yaygın anksiyete bozukluğu ve majör depresif bozukluk gibi psikiyatrik bozuklukların patogenezinde serotonerjik nöronların rolünü anlamak için değerli bir araç sağlar.

Giriş

Serotonin veya 5-hidroksitriptamin (5-HT), esas olarak bağırsaklarda ve beyinde üretilen önemli bir nörotransmiterdir ve çeşitli psikolojik işlevleri etkiler. Merkezi sinir sisteminde (CNS), serotonerjik sistem ruh hali ve sosyal davranış, uyku ve uyanma, iştah, hafıza ve cinsel arzunun düzenlenmesinde merkezi bir rol oynar. CNS'de serotonin, aşağıdaki iki gruba ayrılabilen serotonerjik nöronlar tarafından sentezlenir: neredeyse tüm beyni innerve eden artan çıkıntılara sahip rostral grup; ve esas olarak omuriliğe çıkıntı yapan kaudal grup¹. Beyindeki serotonerjik nöronların yaklaşık% 85'ini içeren rostral grup, beyindeki en büyük serotonerjik nöron popülasyonunun bulunduğu kaudal lineer çekirdek, medyan raphe çekirdeği ve DRN'den oluşur.

Serotonerjik sistemin düzensizliğinin genellikle majör depresif bozukluk (MDB) ve yaygın anksiyete bozukluklarının (YAB) patogenezi ile bağlantılı olduğuna ^{inanılmaktadır2}. Bunun nedeni, seçici serotonin geri alım inhibitörlerinin (SSRI'lar) bu psikiyatrik bozukluklar için etkili farmakolojik tedavi olmasıdır ^3,4. Ek olarak, birikmiş kanıtlar, mani⁵ ve intihar davranışı^6'nın DRN'de işleyen daha düşük serotonin seviyeleri ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca Pet1-Cre'nin; Lmx1b^{flox / flox} fareleri ve hTM-DTA^iPet1 fareleri (sırasıyla geç embriyonik evre⁷ ve yetişkinlik^8'den çoğu merkezi serotonerjik nörondan yoksun genetik fare modelleri) gelişmiş bağlamsal korku hafızası gösterir. Bununla birlikte, kapsamlı araştırmalara rağmen, DRN serotonerjik nöronlarının bu psikiyatrik bozukluklarda kesin rolü açıklığa kavuşturulmayı beklemektedir.

DRN serotonerjik nöronlarının serotonin ile ilişkili psikiyatrik bozuklukların patogenezini düzenlediği mekanizmaları araştırmak için hayvan modelleri oluşturulmuştur. Sıçan DRN'sinde serotonerjik nöronları inhibe etmek için optogenetik araçlar uygulanmıştır ve bu hayvanlar artan anksiyete benzeri davranışlar sergilemektedir⁹. Bununla birlikte, optogenetiğin sınırlamaları vardır. Örneğin, beynin derinliklerinde hedeflenen bölgeye bir ışık verme cihazı implante edilmelidir ve çevredeki doku, implantasyon ameliyatı sırasında veya ışık cihazından yayılan ısı ile yaralanabilir. Sıcaklık değişimi saptanabilir beyin dokusu hasarına neden olmasa bile, yine de dikkate değer fizyolojik ve davranışsal etkilere neden olabilir¹⁰.

Farmakolojik manipülasyon, DRN serotonerjik nöron lezyonlu hayvan modelleri oluşturmak için daha kolay bir yaklaşım olabilir. Bazı gruplar, DRN'de serotonin nörotoksin 5,7-DHT'nin stereotaksik mikroenjeksiyonu ile DRN serotonerjik nöron lezyonlu sıçanlar oluşturmuştur. Bununla birlikte, bu sıçan modelleri, anksiyolitik davranış¹¹, artan kaygı benzeri davranış¹² ve bozulmuş nesne hafızası¹³ gibi farklı davranış değişiklikleri gösterir. Sıçanlarda yapılan birçok çalışmaya rağmen, 5,7-DHT'nin fareler üzerindeki etkileri üzerinde daha az çalışma yapılmıştır. Bir grup, DRN 14'te 5,7-DHT'lik stereotaksik mikroenjeksiyonlar alan deney farelerinde aşırı mortalite (%^>50) ve sınırlı serotonin tükenmesi bildirmiştir. Başka bir grup, öngörülemeyen kronik hafif stresin (UCMS) 5,7-DHT ile indüklenen DRN lezyonlu farelerde önemli atak gecikmesi değişikliğine neden olabileceğini bildirdi. Bununla birlikte, DRN^15'teki kesin serotonerjik nöron kaybını doğrulamak için hiçbir histolojik sonuç sağlanmamıştır. Standart prosedürler kullanılarak DRN'ye stereotaksik enjeksiyon, DRN'nin anatomik konumunun SSS^16'nın altında olduğu gerçeği göz önüne alındığında, farelerde büyük kanamaya ve yüksek mortaliteye yol açabilir.

Bu protokol, 5,7-DHT'lik stereotaksik enjeksiyon ile DRN serotonerjik nöronlarının stabil kaybı ile bir DRN serotonerjik nöron lezyonlu fare modeli (deneysel farelerin %>90 hayatta kalma oranı) oluşturmak için protokolü açıklar. DRN'deki enjeksiyon, SSS'nin yaralanmasını önlemek için açılı bir yaklaşım kullanır. Bu ameliyat, farelerin DRN'sinde sürekli olarak %>70 serotonerjik nöron kaybına neden olur ve anksiyete ile ilişkili davranış değişikliklerine neden olur. Burada kullanılan protokol DRN lezyonlarını indüklemek içindir, ancak diğer orta hat yapılarında stereotaksik enjeksiyonlar yapmak isteyen araştırmacılar için de yararlı olabilir. Ek olarak, bu DRN serotonerjik nöron lezyonlu fare modeli, psikiyatrik bozukluklarda (yani MDB ve YAB) serotonerjik nöronların rolünü anlamak ve bu durumlar için potansiyel nöroprotektif ajanları veya terapötik stratejileri değerlendirmek için değerli bir araç sağlar.

Protokol

Tüm cerrahi müdahaleler ve hayvan bakım prosedürleri, Tongji Üniversitesi, Şangay, Çin, Yaşam Bilimleri ve Teknolojisi Okulu Hayvan Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvanların barınması

1. Erkek C57BL/6NCrl fareleri (10 haftalık, 25 g, n = 21) standart koşullarda (24 °C sıcaklık; %55 nem) 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde koruyun.
2. Yiyecek ve su ad libitum sağlayın.
   NOT: Burada, farelerden üçü iğne izini doğrulamak için kullanılır.

2. Reaktiflerin hazırlanması

NOT: Kontaminasyonu önlemek için tüm ilaç hazırlama adımları laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir. Hazırlanan tüm solüsyonlar -80 °C dondurucuda saklanır. Her seferinde bir alikot kullanılması, tamamen çözülmesi, kullanmadan önce iyice karıştırılması, tüpte kalanları atmanız ve tekrarlanan donma ve çözülmeden kaçınmanız önerilir.

1. 2.5 mg / mL'lik bir çözelti elde etmek için 0.25 g desipramin hidroklorürü 100 mL %0.9 tuzlu su içinde çözün. Çözeltiyi, 0.22 μm gözenek boyutunda hidrofilik PES membranlı bir şırınga filtresi kullanarak sterilize edin. Daha sonra, çözeltiyi (1.8 mL / tüp) 2 mL mikrosantrifüj (EP) tüplerinde alikotlayın. Etiketleyin, tarihlendirin ve hemen -80 °C dondurucuda saklayın. Hayvan kullanımı için önerilen doz 25 mg / kg'dır.
2. 5 μg / μL'lik bir çözelti elde etmek için% 0.1 askorbik asit içeren 1.67 mL 0.9% tuzlu su içinde 3 mg 5,7-DHT'yi çözün. Karıştırmak için hafifçe girdaplayın, çözeltiyi bir şırınga filtresi (0.22 μm gözenek boyutu) kullanarak sterilize edin ve çözeltiyi (10 μL / tüp) 0.5 mL EP tüplerinde ayırın. Etiketleyin, tarihlendirin ve hemen -80 °C'de dondurun. Hayvan kullanımı için önerilen doz 2 μL / faredir.
3. Daha önce tarif edilen yöntemi izleyerek ketoprofen'i (analjezik) çözün¹⁷. 250 mg ketoprofen'i 15 mL su ve 1 mL 1 M NaOH içinde çözün, pH'ı 7.3'e ayarlayın ve son hacmi 125 mL'ye oluşturun, bu da 2 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyonla sonuçlanacaktır. Çözeltiyi 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak sterilize edin ve çözeltiyi (0.4 mL / tüp) 1.5 mL EP tüplerinde ayırın. Etiketleyin, tarihlendirin ve kullanana kadar -80 °C'de dondurun. Hayvan kullanımı için önerilen doz 5 mg / kg'dır.

3. Aletlerin ve farelerin hazırlanması

1. Daha önce yüksek sıcaklıktaki otoklavlarda sterilize edilmiş bir cerrahi paket (neşter, bir çift doku forsepsi, bir makas, iğne tutucu, 3-0 dikiş, kulak küpeleri ve kulak küpesi aplikatörü içeren) hazırlayın. 32 G iğneli ve 1 cc şırıngalı bir Hamilton şırınga kullanarak bir ısıtma yastığının üzerine %75 etanol, povidon-iyot, %3 hidrojen peroksit, araç solüsyonu (%0,9 salin içinde %0,1 askorbik asit), pamuklu çubuk, ofloksasin göz merhemi ve bir fare kurtarma kafesi yerleştirin.
2. h 5,7-DHT enjeksiyonundan önce, farelerin vücut ağırlıklarını tartın ve kaydedin, daha sonra bunları intraperitoneal (IP) desipramin enjeksiyonlarına (2.5 mg / mL, 10 μL / g ağırlık) tabi tutun.
   NOT: 5,7-DHT enjeksiyonundan 1 saat önce desipramin uygulamasının amacı, katakolaminerjik hücre kaybını^{önlemektir 18}.
3. İzofluran inhalasyon anestezisi kullanarak fareleri uyuşturun (indüksiyon sırasında% 3, bakım sırasında% 1.5, akış hızı = 2 L / dak). Ketoprofen'i (2 mg / mL, 2.5 μL / g ağırlık) deri altı (sc) enjeksiyon yoluyla uygulayın. Kuyruk sıkışması tepkisi olmadan yeterli anestezi derinliğini onaylayın.

4. Stereotaksik enjeksiyon

1. Anestezi uygulanmış fareyi stereotaksik platforma yerleştirin, ardından kafasını stereotaksik cihazın kulak çubukları ve kesici çubuğu ile sabitleyin.
2. Farenin kafasını tıraş edin, ardından açıkta kalan kafa derisini bir fırçala% 75 etanol ve ardından bir fırça povidon-iyot ile temizleyin.
3. Lokal analjezi sağlamak için pamuklu bir bez kullanarak kafa derisine lidokain merhem sürün. Korneayı korumak için gözlere loksasin göz merhemi sürün.
4. Gözlerin 1 mm arkasından interaural çizgiye kadar bir neşter kullanarak orta hat boyunca kafa derisi üzerinde bir kesi yapın.
5. Periosteumu çıkarmak için% 3 hidrojen peroksit ile ıslatılmış bir çubuk kullanın, ardından kafatasını kurutun ve kraniyal dikişleri ortaya çıkarın. Bregma ve lambda'nın yerini işaretleyin.
6. Bregma ve lambda aynı yatay düzlemde durana kadar kesici çubuğu kullanarak baş konumunu ayarlayın. İğne ucunu bregma veya lambdaya dokunacak şekilde ayarlayın, medial/lateral (ML) ve dorsal/ventral (DV) koordinatları kaydedin ve kesici çubuğu, bregma ve lambda'nın DV ve ML koordinatları sırasıyla eşit olacak şekilde ayarlayın.
7. Dikey konumlandırma düğmesinin ve kilit vidasının kilidini açın, ardından manipülatör kolunu (z ekseni) Şekil 30A,B'de gösterildiği gibi ön/arka (AP) yönde 1°'ye ayarlayın. Düğmeyi kilitleyin.
8. 2 μL 5,7-DHT (3 μg/μL) ile doldurulmuş Hamilton şırıngasını tutucuya sabitleyin (sahte grup için farelere %0,1 askorbik asit içeren %0,9 salin enjekte edilir). İğne ucunu bregma yer işaretine dokunacak şekilde ayarlayın, ardından dijital ekran modülünü kullanarak ML, AP ve DV değerlerini sıfırlayın.
   NOT: 5,7-DHT çözeltisi kahverengi renkli sıvıdır, bu da Hamilton şırıngasının uygun şekilde doldurulup doldurulmadığını belirlemeyi kolaylaştırır. Bir dijital ekran modülüne erişim yoksa, iğne ucu bregmaya temas ettiğinde üç eksende görüntülenen numarayı kaydedin ve son koordinatlar "kaydedilen numara artı bu protokolde sağlanan koordinatı" temsil eder. Örneğin, y ekseni (A/P yönü) manipülatör kolunda kaydedilen sayı "a" ise, A/P yönündeki son koordinat "a - 6.27" olmalıdır.
9. İğne ucunu enjeksiyon konumuna ayarlamak için manipülatör kolunu hareket ettirin (APa = -6.27, ML = 0; son koordinatları hesaplama formülü Şekil 1B'de listelenmiştir). Bir işaretleyici kalem kullanarak hedef konumu işaretleyin.
10. Portatif mikromotor yüksek hızlı matkap kullanarak çapak deliğini delin, ardından iğne ucunu hedefe indirmek için manipülatör kolunu hareket ettirin (DVa = -4.04). 2 μL solüsyonu beyne yavaşça (0,5 μL / 3 dk) enjekte edin, solüsyon sızıntısını önlemek için iğneyi 5 dakika daha yerinde tutun. Enjeksiyondan sonra iğneyi nazikçe çıkarın.
11. 3-0 dikişler kullanarak kesi üzerine kesik dikişler uygulayın. Enfeksiyonu önlemek için dikişli kesiği povidon-iyot batırılmış bir pamuklu çubukla sarın.
12. Sağ kulağı povidon-iyot pamuklu çubukla temizleyin, ardından sterilize edilmiş kulak küpesini tanımlama için kulağın tabanına uygulayın.
13. Deneysel fareleri stereotaksik cihazdan çıkarın ve anesteziden tam iyileşme gözlenene kadar bir ısıtma yastığının üzerine bir fare kurtarma kafesine yerleştirin.

5. Farelerin ameliyat sonrası bakımı

1. Fareleri ameliyattan 2 gün sonrasına kadar günde 1 kez ketoprofen enjeksiyonlarına tabi tutun.
2. Ameliyattan sonra 7 güne kadar fareleri günlük olarak inceleyin.

6. Yükseltilmiş T-labirent testi

NOT: Testi daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirin ^19,20.

1. Yükseltilmiş T-labirent (ETM) testinin, bir merkez platforma (30 cm x 5 cm x 0.5 cm) sahip iki kapalı kola (30 cm x 5 cm x 16 cm x 0.5 cm) dik iki açık koldan (5.0 cm x 0.5 cm) oluştuğundan emin olun. Kapalı kollardan biri, bir T şekli oluşturmak için opak bir plastik tabaka ile bloke edilmiştir (Şekil 2A).
2. ETM testinden üç gün önce, hayvanları her gün 5 dakika tutarak alışkanlık haline getirin.
3. Ameliyattan sonraki 30. günde ETM testini yapın.
4. Davranış testinin yapıldığı gün, fareleri 10 dakika boyunca açık kollardan birine maruz bırakın.
5. İnhibitör kaçınma testi için, her fareyi kapalı kolun distal ucuna yerleştirin ve bu kolun ayrılması için geçen süreyi üç denemede dört pençe ile kaydedin. İlk deneme temel kaçınma, ikinci deneme kaçınma 1 ve üçüncü deneme kaçınma 2'dir.
6. Fareleri parkurlar arasında 30 saniye boyunca kafeslerinde tutun ve bir kesme süresi belirleyin (burada her deneme için 300 saniye kullanılır).

7. Perfüzyon, fiksasyon, immünohistokimyasal boyama ve miktar tayini

1. Çalışmanın sonunda (ameliyattan 35 gün sonra, davranış testinden sonra), fare genel anestezi altındayken tüm vücut perfüzyonu ve fiksasyonu gerçekleştirin.
   1. Fareyi adım 3.3'te anlatıldığı gibi uyuşturun. Derin anestezi uygulanmış fareyi sırt yaslanmaya yerleştirin.
   2. Kürkü tüm ventral alan boyunca% 75 alkolle ıslatın.
   3. Göğüs kafesinin altında bir kesi yapın ve ardından göğüs kafesinde V şeklinde bir kesi yapın. Kalbi açığa çıkarmak için kelepçeyi kullanarak göğüs kafesini kavrayın.
   4. Venöz infüzyon iğnesini sol ventriküle sokun, ardından kanın dışarı akmasını sağlamak için atriyal apendiksiyi hemen makasla kesin.
   5. Salini dolaşım sistemi yoluyla tüm vücuda perfüze etmek için peristaltik pompayı açın. Sağ atriyumdan çıkan sıvı berraklaştığında ve karaciğerin rengi kırmızıdan soluk kırmızıya döndüğünde salinden %4 paraformaldehite (PFA) geçin. Fare kuyruğu hareket ettiğinde ve vücut sertleştiğinde 5 mL %4 PFA daha perfüze edin.
      NOT: Fare kuyruğunun sallanması, yeterli perfüzyonun işaretidir.
2. % 4 PFA ile intrakardiyak perfüzyon sonrası beynin izolasyonu
   1. Büyük bir makas kullanarak farenin kafasını kesin, ardından kafatasını ortaya çıkarmak için cildi kesin.
   2. Kafatasının tabanında (boyuna bağlı) iki kesi yapın, gözleri birbirine bağlayan çizgi boyunca bir kesi yapın, ardından kafatasını sagital sütür boyunca kesin. Forseps kullanarak beyni ortaya çıkarmak için her yarım kürenin kafatasını dışa doğru kavrayın ve soyun.
      NOT: Kafatasının sagital sütür boyunca kesilmesi dikkatli bir şekilde yapılmalıdır, aksi takdirde beyin hasar görebilir ve parçalara ayrılabilir.
   3. Beyni çıkarın ve sabitleme sonrası için gece boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'ya yerleştirin, ardından beyni dibe çökene kadar% 30 sükroz içine aktarın.
      NOT: Bölümler vibratom ile kesilirse% 30 sükroz kullanılarak dehidrasyon gerekli değildir.
3. Gömmeden önce bir kağıt havlu kullanarak mendilin etrafındaki fazla sıvıyı emdirin. Beyin dokusunu, rostral yüzü ayna üzerinde olacak şekilde OCT'ye gömün.
   NOT: Numunenin yönü önemlidir. Kesme kenarının kaudal kısım olduğundan emin olmak için beynin rostral yüzü aynaya bağlanmalıdır.
4. Bir kriyostat kullanarak DRN'nin koronal bölümünü (bregmadan 4.0–4.8 mm arka) 30 μm kalınlığında (dört kesitli aralıklarla) kesin ve bölümleri PBS'de toplayın. Beyin bölümü kriyoprezervasyon solüsyonunda (SCS) -20 °C'de saklayın.
   NOT: DRN'nin tanımlanması çok önemlidir. Ardışık anatomik yapılar Şekil 3A-H'de gösterilmiştir. Karakteristik yapılar şu şekildedir: dördüncü ventrikülün lateral girintisi (LR4V, Şekil 3A,E'de kırmızı çizgi çizgisi), dördüncü ventrikül (4V, Şekil 3B,F'de kırmızı çizgi üçgeni), ikinci serebellar lobül (2Cb, Şekil 3C/G'de kırmızı çizgili elmas şeklindeki yapı) ve su kemeri (Aq, Şekil 3D,H'de kırmızı çizgi deliği). Şekil 3D,H'de gösterildiği gibi yapılar gözlendiğinde dokuları toplamaya başlayın, ardından toplam 24 koronal kesit elde etmek için 30 μm kalınlığında kesitler (dört kesitli aralıklarla) kesin. Bölümlerin H&E boyaması (Şekil 3E–H)'de gösterilmiştir. Dört bölümün her birinin dördüncü bölümü, immünofloresan boyama yapmak için seçilecektir. Kalan bölümler SCS'de depolanır. Yapıları tanımak zorsa, bölümlerin bir parçasını slayt üzerine monte etmek yardımcı olur.
5. Daha önce tarif edildiği gibi immünohistokimyasal test yapın^21,22.
6. ImageJ kullanarak tüm DRN boyunca farklı bölüm seviyelerinde 5-HT pozitif hücreleri sayın.

8. İstatistiksel analiz

1. Veri analizi için istatistiksel yazılım kullanın. Sonuçları SEM ± anlamına gelir.
2. İstatistiksel analiz için değerleri iki yönlü ANOVA veya eşleştirilmemiş t-testi ile işleyin ve **p < 0.01'de anlamlı farkları göz önünde bulundurun.

Sonuçlar

Bir koronal bölümde, DRN'nin konumu SSS ve su kemerinin hemen altındadır (Şekil 1B,C); bu nedenle, standart prosedürler kullanılarak DRN'yi hedeflemek, farelerde büyük kanamaya ve yüksek mortaliteye yol açabilir¹⁶. Bu nedenle, SSS'ye zarar vermemek için standart vertikal yaklaşım yerine açılı bir yaklaşım kullanılarak stereotaksik enjeksiyonlar yapıldı (Şekil 1

Tartışmalar

Bu protokol, yüksek lezyon tekrarlanabilirliği ve düşük mortalite oranı ile güvenilir bir DRN serotonerjik nöron lezyonlu fare modelinin üretimini başarıyla tanımlamaktadır. DRN'yi hedeflemek karmaşık bir iştir, çünkü DRN^16'nın hemen üzerinde bulunan SSS'ye zarar verebilir ve aşırı kanamaya ve hatta ölüme^{yol açabilir 14}. Bu nedenle, SSS'nin yaralanmasını önlemek için manipülasyon kolu AP yönünde 30°'ye aya...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22micron syringe filter	Millipore	SLGPRB
3% hydrogen peroxide	Caoshanhu Co.,Ltd, Jiangxi, China
5,7-Dihydroxytryptamine	Sigma-Aldrich	SML2058	3ug/ul, 2ul
Compact small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co., Ltd	R500 series
Cryostat	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM1950
Cy 3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-165-003	1:2,000
dapi	Sigma-Aldrich	D8417
desipramine hydrochloride	Sigma-Aldrich	PHR1723	25mg/kg
Eppendorf tube	Quality Scientific Plastics	509-GRD-Q
goat anti-5-HT antibody	Abcam	ab66047	1:800
GraphPad Prism	Graphpad Software Inc, CA, US
Hamilton Microliter syringe	Hamilton	87943
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	5mg/kg
L-ascorbic acid	BBI Life Sciences	A610021-0500	0.10%
lidocaine ointment	Tsinghua Tongfang Pharmaceutical Co. Ltd	H20063466
ofloxacin eye ointment	Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co.Ltd, China	H10940177
peristaltic pump	Huxi Analytical Instrument Factory Co., Ltd, Shanghai, China	HL-1D
stereotaxic apparatus	RWD Life Science Co., Ltd	68018
ultra-low temperature freezer	Haier	DW-86L388
Vortex	Kylin-bell	VORTEX-5