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Method Article
Ce protocole décrit un modèle murin lésionné du noyau du raphé dorsal (DRN) (taux de survie de >90 % chez les souris expérimentales) avec une perte stable des neurones sérotoninergiques du raphé dorsal par injection stéréotaxique de 5,7-dihydroxytryptamine dans le DRN en utilisant une approche inclinée pour prévenir les lésions du sinus sagittal supérieur.
L’injection stéréotaxique a été largement utilisée pour l’administration directe de composés ou de virus à des zones cérébrales ciblées chez les rongeurs. Le ciblage direct des neurones sérotoninergiques dans le noyau du raphé dorsal (DRN) peut provoquer des saignements excessifs et la mort d’animaux, en raison de son emplacement sous le sinus sagittal supérieur (SSS). Ce protocole décrit la génération d’un modèle murin sérotoninergique lésionné par des neurones DRN (taux de survie de >90 %) avec une perte stable de >70 % de cellules 5-HT-positives dans le DRN. La lésion est induite par l’injection stéréotaxique d’une neurotoxine sérotoninergique sélective 5,7-dihydroxytryptamine (5,7-DHT) dans le DRN en utilisant une approche inclinée (30° dans la direction antérieure/postérieure) pour éviter de lécher le SSS. Les souris atteintes de lésions neuronales sérotoninergiques DRN présentent des altérations du comportement associées à l’anxiété, ce qui contribue à confirmer le succès de la chirurgie des lésions DRN. Cette méthode est utilisée ici pour les lésions DRN, mais elle peut également être utilisée pour d’autres injections stéréotaxiques qui nécessitent des injections angulaires pour éviter les structures médianes. Ce modèle murin de neurones sérotoninergiques DRN fournit un outil précieux pour comprendre le rôle des neurones sérotoninergiques dans la pathogenèse des troubles psychiatriques, tels que le trouble d’anxiété généralisée et le trouble dépressif majeur.
La sérotonine, ou 5-hydroxytryptamine (5-HT), est un neurotransmetteur important principalement produit dans les intestins et le cerveau et a un impact sur diverses fonctions psychologiques. Dans le système nerveux central (SNC), le système sérotoninergique joue un rôle central dans la régulation de l’humeur et du comportement social, du sommeil et de l’éveil, de l’appétit, de la mémoire et du désir sexuel. Dans le SNC, la sérotonine est synthétisée par les neurones sérotoninergiques, qui peuvent être séparés en deux groupes : le groupe rostral, qui a des projections ascendantes innervant pratiquement tout le cerveau ; et le groupe caudal, qui se projette principalement vers la moelle épinière1. Le groupe rostral, qui contient environ 85 % des neurones sérotoninergiques du cerveau, est composé du noyau linéaire caudal, du noyau médian du raphé et du DRN, dans lequel se trouve la plus grande population de neurones sérotoninergiques du cerveau.
On pense généralement que la dérégulation du système sérotoninergique est liée à la pathogenèse du trouble dépressif majeur (TDM) et des troubles anxieux généralisés (TAG)2. Cela est dû au fait que les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (ISRS) sont un traitement pharmacologique efficace pour ces troublespsychiatriques3,4. De plus, des preuves accumulées suggèrent que la manie5 et le comportement suicidaire6 peuvent être associés à des niveaux plus faibles de fonctionnement de la sérotonine dans le DRN. Il a également été signalé que Pet1-Cre ; Les souris Lmx1bflox/flox et les souris hTM-DTAiPet1 (modèles de souris génétiques dépourvus de la plupart des neurones sérotoninergiques centraux de la fin du stadeembryonnaire 7 et de l’âgeadulte 8, respectivement) présentent une mémoire contextuelle de peur améliorée. Cependant, malgré des recherches approfondies, l’implication exacte des neurones sérotoninergiques DRN dans ces troubles psychiatriques reste à élucider.
Afin d’explorer les mécanismes par lesquels les neurones sérotoninergiques DRN régulent la pathogenèse des troubles psychiatriques associés à la sérotonine, des modèles animaux ont été générés. Des outils optogénétiques ont été appliqués pour inhiber les neurones sérotoninergiques chez le rat DRN, et ces animaux présentent une augmentation des comportements anxiogènes9. Cependant, l’optogénétique a des limites. Par exemple, un dispositif d’administration de lumière doit être implanté dans la région ciblée profonde du cerveau, et les tissus environnants peuvent être blessés lors d’une chirurgie d’implantation ou par la chaleur émise par l’appareil lumineux. Même si l’altération de la température ne peut pas causer de lésions détectables aux tissus cérébraux, elle peut tout de même induire des effets physiologiques et comportementaux remarquables10.
La manipulation pharmacologique peut être une approche plus facile pour créer des modèles animaux atteints de lésions neuronales sérotoninergiques DRN. Certains groupes ont généré des rats atteints de lésions neuronales sérotoninergiques DRN par micro-injection stéréotaxique de neurotoxine sérotoninergique 5,7-DHT dans le DRN. Cependant, ces modèles de rats présentent différentes altérations comportementales, telles que le comportement anxiolytique11, l’augmentation du comportement anxiolytique12 et la mémoire d’objets altérée13. Malgré de nombreuses études chez le rat, moins d’études ont été réalisées sur les influences de la 5,7-DHT sur les souris. Un groupe a signalé une mortalité excessive (>50 %) et une déplétion limitée en sérotonine chez des souris expérimentales ayant reçu des micro-injections stéréotaxiques de 5,7-DHT dans le DRN14. Un autre groupe a rapporté que le stress chronique léger imprévisible (UCMS) peut induire une altération significative de la latence d’attaque chez les souris atteintes de lésions DRN induites par la 5,7-DHT. Cependant, aucun résultat histologique n’a été fourni pour confirmer la perte exacte de neurones sérotoninergiques dans le DRN15. L’injection stéréotaxique dans le DRN à l’aide de procédures standard peut entraîner des saignements massifs et une mortalité élevée chez les souris, étant donné que la position anatomique du DRN est inférieure à la SSS16.
Ce protocole décrit le protocole permettant de générer un modèle murin de neurones sérotoninergique DRN (taux de survie de >90 % des souris expérimentales) avec perte stable de neurones sérotoninergiques DRN par injection stéréotaxique de 5,7-DHT. L’injection dans DRN utilise une approche inclinée pour éviter de blesser le SSS. Cette chirurgie provoque systématiquement une perte de >70 % de neurones sérotoninergiques dans le DRN des souris, et elle produit des altérations du comportement associées à l’anxiété. Le protocole utilisé ici permet d’induire des lésions DRN, mais il peut également être utile aux chercheurs qui souhaitent effectuer des injections stéréotaxiques dans d’autres structures de la ligne médiane. De plus, ce modèle murin de neurones sérotoninergiques DRN fournit un outil précieux pour comprendre le rôle des neurones sérotoninergiques dans les troubles psychiatriques (c’est-à-dire le TDM et le TAG) et évaluer les agents neuroprotecteurs potentiels ou les stratégies thérapeutiques pour ces conditions.
Toutes les interventions chirurgicales et les procédures de soins aux animaux ont été approuvées par le Comité des animaux de l’École des sciences et technologies de la vie de l’Université de Tongji, à Shanghai, en Chine.
1. Logement des animaux
2. Préparation des réactifs
REMARQUE : Toutes les étapes de préparation du médicament doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination. Toutes les solutions préparées sont conservées dans un congélateur à -80 °C. Il est recommandé d’utiliser une aliquote à la fois, de décongeler complètement, de bien mélanger avant utilisation, de jeter les restes dans le tube et d’éviter la congélation et la décongélation répétées.
3. Préparation des instruments et des souris
4. Injection stéréotaxique
5. Soins postopératoires des souris
6. Test de labyrinthe en T élevé
REMARQUE : Effectuez le test comme décrit précédemment 19,20.
7. Perfusion, fixation, coloration immunohistochimique et quantification
8. Analyse statistique
Dans une coupe coronale, l’emplacement du DRN se situe juste en dessous du SSS et de l’aqueduc (Figure 1B,C) ; ainsi, le ciblage du DRN à l’aide de procédures standard peut entraîner des hémorragies massives et une mortalité élevée chez les souris16. Par conséquent, des injections stéréotaxiques ont été effectuées ici en utilisant une approche inclinée au lieu de l’approche verticale standard pou...
Ce protocole décrit avec succès la production d’un modèle murin fiable de neurones sérotoninergiques DRN avec une reproductibilité élevée des lésions et un faible taux de mortalité. Cibler le DRN est une tâche complexe, car il peut endommager le SSS situé juste au-dessus du DRN16 et entraîner des saignements excessifs et même la mort14. Par conséquent, des injections stéréotaxiques ont été effectuées en réglant le bras...
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu par le Programme national de recherche et de développement clés de la Chine [numéros de subvention 2017YFA0104100] ; la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [Subventions n° 31771644, 81801331 et 31930068] ; et les Fonds pour la recherche fondamentale pour les universités centrales.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22micron syringe filter | Millipore | SLGPRB | |
3% hydrogen peroxide | Caoshanhu Co.,Ltd, Jiangxi, China | ||
5,7-Dihydroxytryptamine | Sigma-Aldrich | SML2058 | 3ug/ul, 2ul |
Compact small animal anesthesia machine | RWD Life Science Co., Ltd | R500 series | |
Cryostat | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | CM1950 | |
Cy 3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-165-003 | 1:2,000 |
dapi | Sigma-Aldrich | D8417 | |
desipramine hydrochloride | Sigma-Aldrich | PHR1723 | 25mg/kg |
Eppendorf tube | Quality Scientific Plastics | 509-GRD-Q | |
goat anti-5-HT antibody | Abcam | ab66047 | 1:800 |
GraphPad Prism | Graphpad Software Inc, CA, US | ||
Hamilton Microliter syringe | Hamilton | 87943 | |
Ketoprofen | Sigma-Aldrich | K1751-1G | 5mg/kg |
L-ascorbic acid | BBI Life Sciences | A610021-0500 | 0.10% |
lidocaine ointment | Tsinghua Tongfang Pharmaceutical Co. Ltd | H20063466 | |
ofloxacin eye ointment | Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co.Ltd, China | H10940177 | |
peristaltic pump | Huxi Analytical Instrument Factory Co., Ltd, Shanghai, China | HL-1D | |
stereotaxic apparatus | RWD Life Science Co., Ltd | 68018 | |
ultra-low temperature freezer | Haier | DW-86L388 | |
Vortex | Kylin-bell | VORTEX-5 |
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