Vivo'da Genişlemiş Kardiyomiyopatinin Doxorubicin Kaynaklı Murine Modeli

Özet

Tarif edilen, doxorubicin'in uzun süreli intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla farelerde Doxorubicin kaynaklı genişlemiş kardiyomiyopati (DCM) modeli oluşturmak için bir protokoldür.

Özet

Genişlemiş kardiyomiyopati (DCM), hipertansiyon, valvüler, konjenital veya iskemik kalp hastalıklarının yokluğunda ventrikül genişlemesi ve depresif kardiyak performans ile karakterize ve enfeksiyon, otoimmün veya metabolik anormallikler veya aile kalıtımı ile ilgili olabilecek heterojen miyokard bozuklukları spektrumunu ifade eder. Kötü bir prognoz ile konjestif kalp yetmezliğine doğru ilerleyebilir. Doxorubicin (Dox) yaygın olarak kemoterapötik bir ilaç olarak kullanılır, ancak miyokardda DCM benzeri değişikliklere neden olduğu için kullanımı sınırlıdır. Miyokard toksisitesi oksidatif stres, kronik inflamasyon ve kardiyomiyosit apoptoza atfedilir. Bu Dox kaynaklı DCM semptomlarından yararlanan bir DCM modeli oluşturulmamıştır.

Giriş

Kalp yetmezliğinin en yaygın nedenlerinden biri olan DCM, ventrikül dilatasyonu ve kalp fonksiyonunun azalması ile karakterizedir ve dünya çapında kalp naklinin en yaygın nedenidir¹. Patogenezini daha fazla araştırmak ve etkili tedaviler bulmak için olgun hayvan modellerine erişim özellikle önemlidir. Açıklanan deneylerin amacı, insan DCM'sine benzeyen kararlı bir DCM fare modeli oluşturmaktır.

DCM'nin karmaşık patogenezleri nedeniyle, karşılık gelen hayvan modelleri yapmak için birçok farklı yöntem vardır. Spontan DCM modelleri² nispeten kararlıdır, ancak pahalıdır ve kolayca mevcut değildir. Genetiği değiştirilmiş hayvan modelleri³ köklü değildir ve daha deneysel kullanım gerektirir. Viral enfeksiyon⁴ veya otoimmün defektler⁵ tarafından indüklenen DCM hayvan modellerinin elde etmesi kolaydır, ancak tamamen DCM'yi temsil etmezler. Miyokard toksisitesi ile ilişkili modeller arasında alkol kaynaklı DCM modelleri ve Dox kaynaklı DCM hayvan modelleri bulunur.

Dox kaynaklı kardiyomiyopati modeli Dox^6'nınintraperitoneal enjeksiyonu ile elde edilir. Model Dox'un en şiddetli kronik yan etkisinden yararlanır: Dox maruziyeti sonrasında hastalar klinik homojenlik ile geç başlangıçlı DCM semptomları geliştirir⁷. Doksadatif stres⁸ ve mitokondriyal hasar⁹Kardiyomiyosit apoptoza yol açan DCM patogenezinde belirtilerdir. Akut ve kronik Dox tedavi modelleri vardır: tek bir yüksek doz Dox (15 mg / kg) kardiyomiyopati için kısa vadeli bir modele neden olur¹⁰, tekrarlayan düşük doz Dox enjeksiyonları (altı haftalık, 3 mg / kg) kardiyomiyopati için uzun vadeli bir modele neden^{olur 11}. Sunulan çalışmaya dayanarak, vahşi tip fareler intraperitoneally bir ay boyunca haftada bir kez 5 mg / kg ekran morfolojisi ve tedavinin sonuna kadar DCM özellikleri ile tutarlı kalbin histolojisi bir dozda enjekte edildi ve bir DCM modeli kurmak için ideal bir yol sağladı.

Protokol

Hayvan deneyleri Nanjing Drum Tower Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

1. Reaktiflerin ve hayvanların hazırlanması

1. Doxorubicin hidroklorür (Pfizer, ABD) sterilize su içinde çözün. 1 mg/mL'lik bir Dox çözeltisi elde etmek ve 4 °C'de tutmak için girdap.
2. C57BL/6 fare kullanın (8-10 haftalık; 25-30 g ağırlık). Bu çalışma için Nanjing Üniversitesi Model Hayvan Araştırma Merkezi'nden fareler satın alınmış ve Nanjing Davul Kulesi Hastanesi'nin hayvan odasında tutulmuştur.
3. Patojen içermeyen fare kafesleri 23 °C sabit sıcaklıkta 12 saat açık/karanlık bir döngü altında muhafaza edildi. Tüm hayvanlar normal bir yemek diyeti ile beslendi ve yiyecek ve su reklam libitum aldı.

2. DCM hayvan modelinin kurulması

1. Fareleri normal (n = 5) bir gruba ve Dox (n = 5) grubuna randomize edin.
2. Dox grubu için haftada 1x mL sterilize şırıng kullanarak Dox çözeltisini intraperitoneal olarak 5 mg/ kg dozda uygulayın. Kontrol farelerini aynı miktarda tuzlu su çözeltisi ile aynı şekilde tedavi edin.
3. Haftalık olarak iki grubun vücut ağırlığını ölçün. Buna göre, enjeksiyon dozunu haftalık olarak vücut ağırlığına göre toplam 4 hafta boyunca, kümülatif doz 20 mg/ kg ile ayarlayın (Şekil 1).
   NOT: 4 haftalık ekokardiyografide iki grup arasında kardiyak fonksiyonda anlamlı bir fark olduğu için 4 haftalık bir zaman dilimi seçilmiştir.

3. Ekokardiyografik inceleme

1. Dördüncü haftanın sonunda, farelerin ekokardiyografik incelemesini gerçekleştirin.
2. Fareleri intranazal olarak% 2 izofluran ile uyuşturun. Fareler cildin bir tutamına dişli bir cımbızla yanıt vermezse veya parmakları ve kuyrukları uyarmazsa, protokole devam edin.
3. Fareyi supine konumunda bir hayvan işleme platformuna yerleştirin. Anesteziyi korumak için, hayvanın burnunu ve ağzını bir burun konisi ile kapatın ve% 2 izoflurane teslim edin.
   NOT: IP anestezisi için% 4 kloral hidrat 0.2 mL / 20 g dozda enjekte edin.
4. Göğüs kürkünü elektrikli tıraş makinesiyle dikkatlice çıkarın. Transtorasik ekokardiyografi kullanarak in vivo kardiyak fonksiyonu değerlendirin.
5. LV ekokardiyogramını hem parasternal uzun eksenli hem de kısa eksenli görünümlerde 233 Hz kare hızında gerçekleştirin.
6. M modundaki izlemelerde, ortalama LV uç-sistolik çapı (LVIDd), LV uç diyastolik çapı (LVID'ler), müdahale septal kalınlığını (IVS) ve LV arka duvar kalınlığını (LVPW) 3-5 kalp atışından ölçün. Ayrıca ekokardiyografiye dayanarak çıkarma fraksiyonunu (EF) ve kesir kısaltmasını (FS) hesaplayın.

4. Histolojik lekeleme

1. Ekokardiyografik analizden sonra, % 10 potasyum klorürün intraventriküler enjeksiyonu ile fareleri kurban edin.
2. Karaciğer ve akciğer soluklaşana kadar diseksiyondan sonra kalbi yaklaşık 30 mL salin ile perfuse edin.
3. Kalbi dışarı dökün ve kanı ekstrüze etmek için fosfat tampon çözeltisinde iyice yıkayın.
4. Kalbi oda sıcaklığında 24 saat boyunca% 4 formalin olarak sabitleyin ve dokuyu bir parafin kutusunda tedavi edin, böylece parafin balmumu soğur ve katır.
5. Patolojik lekeleme için kalpleri 5 μm kalınlığında dilimler halinde kesin.
6. Papiller kas içeren dewax ve rehidrat bölümleri.
   1. 30 dakika boyunca 55 °C'de kuluçkaya yaslanın. Daha sonra, her biri 2 dakika boyunca ksilen 2x'te kuluçkaya yatırın; Her biri 2 dakika için% 100 etanol 2x; Her biri 2 dakika için% 95 etanol 2x; 2 dakika boyunca% 80 etanol; 2 dakika boyunca% 75 etanol; ve 2 dakika boyunca% 50 etanol.
7. Hematoksilin ve eozin (H&E) ve Masson lekesi kullanarak leke.

Sonuçlar

Kardiyak fonksiyon
Genişlemiş kardiyomiyopati progresif ventriküler dilatasyon ve kontrtil disfonksiyon ile karakterizedir. Şekil 2'de iki grubun temsili ekokardiyografik görüntüleri gösterdir. Dox ile tedavi edilen fareler belirgin şekilde azalmış sol ventrikül çıkarma fraksiyonu ve sol ventrikül fraksiyonel kısaltması gösterdi (Şekil 3A,B). LV çapı ayrıca hem diyastolik hem de sistolik fazlarda artmı?...

Tartışmalar

Dox, klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan spesifik olmayan periyodik bir antitümör kemoterapi ilacıdır¹². Ana yan etkisi kardiyomiyopatidir, kardiyomiyopati ve sonraki kalp yetmezliği ile karakterizedir¹³. Alttaki mekanizma miyokard lipid peroksidasyonunun hasarını, miyokard sarkoplazmik retikülum Ca²⁺-ATPase aktivitesinin inhibisyonunu ve miyokard lokal renin-anjiyotensin sisteminin aktivasyonunu içerir, bu da AT II üretiminin artmasına ve hü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB