Kemirgen Davranışı Üzerindeki Genetik Etkileri Sorgulamak için İkili İn Utero Elektroporasyonunu Kullanan Bir Boru Hattı

Özet

Nöropsikiyatrik bozuklukların patogenezinde yakın zamanda keşfedilen hastalıkla ilişkili genlerin rolü belirsizliğini korumaktadır. Modifiye edilmiş bir in utero elektroporasyon tekniği, büyük nöron popülasyonlarında gen transferine ve gen ekspresyon değişikliklerinin sosyal davranış üzerindeki nedensel etkilerinin incelenmesine izin verir.

Özet

Genom çapındaki ilişki çalışmaları birçok nörolojik hastalığın heterojen genetik temellerine ışık tuttukça, spesifik genlerin beyin gelişimine ve işlevine katkısını inceleme ihtiyacı artmaktadır. Belirli genetik manipülasyonların rolünü incelemek için fare modellerine güvenmek her zaman mümkün değildir, çünkü transgenik fare çizgileri oldukça maliyetlidir ve birçok yeni hastalıkla ilişkili gen henüz ticari olarak mevcut genetik çizgilere sahip değildir. Ayrıca, bir fare satırı oluşturmak için geliştirme ve doğrulama yıllar alabilir. Rahim elektroporasyonunda, gen ekspresyonunu hücre tipi spesifik bir şekilde manipüle etmek için nispeten hızlı ve kolay bir yöntem sunar in vivo, sadece belirli bir genetik manipülasyonu elde etmek için bir DNA plazmidi geliştirmeyi gerektirir. Utero elektroporasyonda bilateral, frontal korteks piramidal nöronların büyük popülasyonlarını hedeflemek için kullanılabilir. Bu gen transfer yöntemini davranışsal yaklaşımlarla birleştirmek, genetik manipülasyonların prefrontal korteks ağlarının işlevi üzerindeki etkilerini ve genç ve yetişkin farelerin sosyal davranışlarını incelemenizi sağlar.

Giriş

Genom çapındaki ilişki çalışmaları (GWAS), beyin patolojileri 1 ,²,^3,4ile ilişkili yeni aday genlerin keşfini yönlendirmektedir. Bu çalışmalar, yeni genlerin araştırılmasının yeni araştırma ve terapötik müdahale hatları için bir fırlatma noktası olarak hizmet ettiği şizofreni (SCZ) gibi yıkıcı nöropsikiyatrik bozuklukları anlamada özellikle yararlı olmuştur^5,6. SCZ için risk barındıran genler, doğum öncesi ve erken postnatal gelişim sırasında prefrontal kortekste (PFC) önyargılı ifade gösterir, çeşitli nöropsikiyatrik bozuklukların patolojisine karışan bir bölge⁷. Ek olarak, psikiyatrik bozuklukların fare modelleri PFC ağlarında anormal aktivite sergiler^6,8,9. Bu sonuçlar, SZC ile ilişkili genlerin bu bölgenin gelişimsel kablolarında rol oynayabileceğini göstermektedir. Bu aday genlerin PFC'de bağlantıların kurulmasına katkısını anlamak ve bu genlerin nöropsikiyatrik bozuklukların patogenezinde nedensel bir rolü olup olmadığını belirlemek için hayvan modelleri kullanılarak daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir. Farelerde, doğum öncesi ve erken postnatal gelişim sırasında belirli nöronal devrelerdeki gen ekspresyon değişikliklerinin incelenmesine izin veren genetik manipülasyon teknikleri, gen ekspresyon değişikliklerini PFC disfonksiyonu ile ilişkilendiren moleküler mekanizmaları anlamak için umut verici bir yöntemdir.

Genetik fare çizgileri, belirli genlerin beyin gelişimi ve işlevi üzerindeki etkisini incelemek için bir yöntem sunar. Bununla birlikte, transgenik farelere güvenmek sınırlayıcı olabilir, çünkü belirli genlerin sinir devreleri geliştirme üzerindeki etkilerini incelemek için her zaman ticari olarak kullanılabilir çizgiler yoktur. Ayrıca, özel fare çizgileri geliştirmek son derece maliyetli ve zaman alıcı olabilir. Transgenik fareleri viral yaklaşımlarla birleştiren kesişimsel genetik manipülasyon stratejilerinin kullanılması, beynin anlaşılmasında devrim yaptı^10,11,12. Çok ilerlemeye rağmen, viral stratejiler viral vektör tipine bağlı olarak, viral ifade^13'ü ve viral ifade ile ilişkili hücre toksisitesini kısıtlayabilecek ambalaj kapasitesi sınırları da dahil olmak üzere belirli sınırlamalarla birlikte gelir¹⁴. Ayrıca, çoğu deneysel durumda, adeno ilişkili virüs (AAVs) kullanarak sağlam gen ekspresyonu yaklaşık 2 ila 4 hafta^{gerektirir 15}, erken doğum sonrası gelişim sırasında genleri manipüle etmek için rutin viral stratejileri imkansız hale getirir.

Rahim elektroporasyonunda (UUİ), floresan etiketleme ve farmakogenetik veya optogenetik yaklaşımlarla birleştiğinde nöronal devrelerin işlevini parçalamak için güçlü bir platform sağlayan hızlı ve ucuz bir gen transferi sağlayan alternatif bir yaklaşımdır^16,17. Ek olarak, CRISPR-Cas9 genom düzenleme genlerinin geliştirilmesiyle, hücre tipi spesifik devirme veya belirli genlerin nakavt edilmesi veya uyarıcıların modülasyonu yoluyla aşırı ifade edilebilir veya tam olarak değiştirilebilir^18,19. İEÜ'leri kullanan gen manipülasyon yaklaşımları özellikle genlerin nöronal devreler üzerindeki etkisinin dar gelişimsel pencereler sırasında test edilmesi gerektiğinde avantajlıdır²⁰. IUE çok yönlü bir tekniktir ve aşırı ifade, belirli bir promotör altında bir ifade vektörüne bir gen eklenerek kolayca gerçekleştirilebilir. Gen ekspresyonunun ek kontrolü, farklı güçlerdeki promotörler kullanılarak veya gen ekspresyonunun zamansal olarak kontrol edilebilen indüklenebilir promotörleri kullanarak ifadeyi yönlendirerek elde edilebilir^21,22. Ayrıca, İEÜ, belirli kortikal katmanlar, hücre tipleri ve beyin bölgelerindeki hücrelerin hedeflanmasına izin verir, bu da diğer yaklaşımlar^5,17kullanılarak her zaman mümkün değildir. Daha verimli bir elektrik alanı dağılımı oluşturan üç elektrot kullanımına dayanan UUİ yapılandırmasındaki son gelişmeler, bu yöntemin işlevsel repertuarını genişletti ve bilim adamlarının yeni hücre türlerini hedeflemelerine ve hedeflenebilecek hücre verimliliğini, doğruluğunu ve sayısını artırmalarına izin verdi^23,24. Bu teknik son zamanlarda PFC fonksiyonunda ve erken biliş^5'teSCZ'ye bağlı bir gen olan kompleman bileşeni 4A'nın (C4A)nedensel rolünü belirlemek için kullanılmıştır.

Burada sunulan, PFC de dahil olmak üzere frontal korteksteki büyük uyarıcı nöron popülasyonlarını hedeflemek için gen transferi yaklaşımlarını, sadece hücre ve devre düzeyindeki değişikliklerin incelenmesini sağlamakla kalmayıp, aynı zamanda davranışın erken doğum sonrası gelişim ve yetişkinlik boyunca izlenmesini sağlayan davranış paradigmalarıyla birleştiren deneysel bir boru hattıdır. İlk olarak, frontal kortikal bölgelerdeki büyük tabaka (L) 2/3 piramidal nöron popülasyonlarını iki taraflı olarak transfect etmek için bir yöntemdir. Daha sonra, genç ve yetişkin farelerde sosyal davranışları test etme görevleri özetlenmiştir. Hücre transfeksiyonunun kapsamını ve yerini ölçmek için davranışsal görevlerin tamamlanmasıyla hücre sayıları elde edilebilir. Ayrıca, transfected hücre sayısı, daha fazla sayıda transfected hücrenin davranışta daha fazla pertürbasyona yol açıp yol açtığını belirlemek için davranışsal verilerle ilişkilendirilebilir.

Protokol

Tüm deneysel protokoller, hayvan araştırmaları için Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergelerine göre yürütüldü ve Boston Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

1. DNA çözeltisi hazırlama

1. Ticari bir plazmid satın alın veya istediğiniz organizatörle plazmid içine ilgi genini subclone edin. Burada CAG promotörü (pCAG-EGFP) altında EGFP içeren bir plazmid kullanılmıştır.
   NOT: İstenen organizatörü gerekli ifade düzeyine göre belirleyin. Genel olarak, CAG promotörü altındaki plazmidler transjenin yüksek seviyelerine ulaşmak için kullanılabilirken, hücre tipine özgü promotörler (örneğin, nöronlar için sinapsin) daha az aktif olma eğilimindedir. Deneyci, her plazmid için uygun ifade düzeylerini ampirik olarak belirlemelidir.
2. Uygun antibiyotikle bakterileri dönüştürün ve bakteriyel ortamda stokları büyütün.
   1. Yetkin hücreleri (DH5α hücreleri) -80 °C'den çıkarın ve 20 dakika boyunca buzda çözün.
   2. Plazmid DNA'nın 100 pg -100 ng'lik kısmını 30 μL yetkin hücre ile karıştırın. Karışımı 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
   3. 42 °C'lik bir su banyosunda 45 sn kuluçkaya yatırarak ve ardından tüpü 2 dakika boyunca buza geri döndürerek ısı şoku gerçekleştirin.
   4. Dönüştürülmüş yetkin hücrelere 200 - 1.000 μL LB ortam ekleyin ve sallanan bir inkübatörde 37 °C'de 45 dakika büyüyün.
   5. Dönüştürülen hücrelerin plaka 200 μL'si uygun antibiyotiği içeren bir LB agar plakasına dönüşür ve plakayı bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırır.
   6. Ertesi gün, 200 mL LB suyunda bir bakteri kolonisini bir gecede sallanan bir inkübatörde 37 °C'de uygun antibiyotikle kuluçkaya yatırın.
3. Plazmid DNA'sını maxiprep kiti kullanarak arındırın.
   1. Elde edilen maxiprep kitinde sağlanan talimatları izleyin. Elution adımı için, DNA'ı elüasyon tamponuna elüte etmeyin. Bunun yerine, 200 μL steril 1x PBS veya moleküler dereceli su kullanarak DNA'sı elute edin.
   2. DNA'nın son konsantrasyonunun 1 μg/μL'den büyük olduğundan emin olun. İlgi genini içeren plazmid bir muhabir geni içermiyorsa, transfected hücrelerin görselleştirilmesine izin vermek için yeşil floresan protein (GFP) gibi bir muhabir molekülü ile birlikte transfect yapmak için bir plazmid hazırlayın.
4. Plazmid DNA'sını her plazmidin 1x PBS ila 1 μg/μL son konsantrasyonuna seyrelterek ameliyat için DNA çözeltisi hazırlayın. %0,1'lik son konsantrasyona DNA çözeltisine hızlı yeşil boya ekleyin. İki taraflı enjeksiyonlar için, baraj başına 60 μL çözelti hazırlayın (yaklaşık 10 yavru için).
   NOT: Plazmid bir muhabir geni içermiyorsa, GFP ile birlikte elektroporat. Ko-elektroporasyon oranları tipik olarak% 95 veya daha yüksektir. Bizim elimizde transfeksiyon verimliliği ko-transfeksiyondan etkilenmedi. Tüm elektroporlu plazmidler 1 μg/μL'ye seyreltilmelidir.

2. Süreli hamile farelerin sipariş veya üremesi

1. Süreli hamile fareler sipariş ediyorsanız, barajların hayvan barınmasına alışmak için yeterli zaman tanımak için farelerin embriyonik gün (E) 13 veya daha erken bir tarihte gelmesini emredin.  Bu protokolde, cd-1 dışlanmış fareler tüm deneyler için kullanılır.
   NOT: Birkaç gün önceden sipariş vermek hayvan stresini azaltacak ve yavruların hayatta kalma oranının daha yüksek olmasına yol açacaktır.
2. Süreli hamile fareler yetiştirilirse, dişi fareleri haftada bir kez bir gecede bir erkekle eşleştirin. Ertesi sabah vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin (E0.5). Dişi farelerin ağırlığını izleyerek hamileliği belirleyin.
   NOT: Farklı fare suşları hamilelik boyunca farklı kilo artışlarına sahiptir, bu nedenle kullanılan fare zorlanması için tipik kilo alımını belirleyin.
3. İster fareleri sipariş edin ister yetiştirin, barajların stresini azaltmak için kafese bir yuvalama pedi ve fare evi yerleştirin. Stresi azaltmak yavruların hayatta kalma oranını artırmaya yardımcı olabilir.

3. Üç prong elektrotunun tasarımı ve montajı

1. Elektrot kontakları için stok malzemesi olarak 0.063 kalınlığında 2 titanyum levha kullanın.
2. Standart işleme tekniklerini veya hassas el aletlerini kullanarak, aşağıdaki boyutlara sahip elektrotlar yapın: yuvarlak uçlu ve yivli sırtlı 20 mm x 5 mm. İnce kum zımpara kağıdı kullanarak pürüzlü kenarları veya çapakları çıkarın.
3. Elektrot kontaklarını tellemek için, 22 G telli bakır teli elektrodun oluklarının etrafına sarın ve lehimleme ile sabitleyin. Isı shrink boru kullanarak bu eklem korumak.
4. Ardından, bağlı elektrodu iki negatif elektrot yapmak için ek bir ısı shrink tüpü kullanarak otoklavlanabilir, iletken olmayan tokmaklara takın. Tek pozitif elektrodu otoklavlanabilir, iletken olmayan bir malzemeye (kafası kesilmiş diş fırçası sapı gibi) takın. Telin açık ucunun içine standart bir muz fişi takın.

4. Ameliyata hazırlık

1. Hayvan tesisinden taşındıktan sonra stres seviyelerinin düşmesine izin vermek için ameliyattan en az 30 dakika önce ameliyat bölgesine hamile barajları getirin.
2. Mikrop öldürücü mendilleri ve ardından% 70 etanol kullanarak tüm ameliyat bölgesini sterilize edin. Ameliyata başlamadan önce eldivenleri değiştirin.
3. Otomatik kapatılmış aletleri cam boncuk sterilizatörde sterilize edin.
4. Steril 1x PBS'yi (baraj başına yaklaşık 50 mL) 50 mL konik tüplere aktarın ve 38-40 °C'ye ısıtılan su banyosunda bir tüp rafı içine yerleştirin. Steril salin sıcaklığını bir termometre ile kontrol edin.
5. Su ısıtma sirkülasyon pompasını, ameliyat başlamadan önce 37 °C'ye ısıtılana kadar açın. Bu, ameliyat süresince farenin vücut sıcaklığını koruyacaktır.
6. Basınç enjektör ve elektroporatörü açın ve ameliyattan önce uygun işlevi sağlayın.
7. Plazmid DNA çözeltisini (adım 1.4'te elde edilir) bir masa üstü santrifüjüne kısaca çevirin ve buza yerleştirin.
8. Cam pipetleri pipet çekme üzerine çekin, böylece çekilen cam pipet ucu yaklaşık 50 μm çapındadır.
9. Pipetleri 20-40 μL DNA çözeltisi ile doldurun (adım 1.4'te elde edilir).
10. Saç çıkarma losyonu, iyot, %70 etanol, pamuk takası, göz merhem, dikiş, gazlı bez vb.
11. Bir ameliyat kağıdı hazırlayın ve fare kimliği ve ağırlığı, ameliyat tarihi, cerrah adı vb.

5. Rahim elektroporasyon cerrahisinde

1. Ameliyattan önce fareyi tartın ve bunu ameliyat kağıdına not edin.
2. %4 (v/v) oksijen-izofluran karışımı ile bir indüksiyon odasında solunarak hamile bir fareyi (E16) uyuşturun. Fare indüklendikten sonra, bir maske solumasına geçin ve izofluranları% 1-1,5'te (v / v) koruyun ve ameliyat boyunca nefes almayı izleyin. Farenin tamamen uyuşturuldığını kontrol edin, nefes hızı dakikada ~ 55-65 nefes olmalıdır.
3. Preoperatif analjezikler sür: buprenorfin (3.25 mg/kg; SC) ve meloksikam (1–5 mg/kg; SC) maksimum 10-30 ml/kg hacimde.
4. Epilasyon kremi kullanın veya kürkü karından çıkarmak için dikkatlice bir jilet kullanın. Povidone-iyot ve% 70 etanol ile sürünerek karnı sterilize edin ve bunu en az 3 kez tekrarlayın. Steril bir gazlı bez kullanarak karın çevresinde steril bir alan oluşturun, steril perdeleme de kullanılabilir.
5. Karın derisinde bir orta çizgi kesisi (3-4 cm) yapın, kasın kesilmesini önlemek için cildi asalarla kaldırdığından emin olun. Daha sonra kası kesin, yine hayati organları kesmemek için kası kaldırmaya özen gösteriyor.
6. Rahim boynuzlarını halkalı tokmaları kullanarak barajdan dikkatlice çekin ve steril alana hafifçe yerleştirin, rahim boynuzunun dolgu ile desteklendiğinden ve barajdan çok uzağa çekme olmadığından emin olun. Bu noktadan sonra, uterus boynuzu önceden ısıtılmış steril 1x PBS ile ameliyatın geri kalanı boyunca nemlendirin.
7. Bir embriyoya forseps veya parmak kullanarak yerleştirin. Çekilen cam pipet, başın yatay düzlemine göre 45 derecelik bir açıyla dikkatlice yerleştirin ve beynin orta çizgisi ile göz arasında görsel olarak tanımlanabilen lateral ventrikül içine yerleştirin. Pipetleri önce birine sonra diğer ventrikülün içine sokarak (önerilen) veya DNA çözeltisini her iki lateral ventriküle geçene kadar bir ventrikülün içine enjekte ederek her bir lateral ventrikülün içine yaklaşık 2-3 μL enjekte edin. Enjeksiyondan sonra bir hilal şekli varsa ventrikül başarıyla hedeflenmiştir.
   NOT: Cam pipetin ucu ameliyat sırasında kırılabilir. Bu durumda, yeni bir pipet hazırlanırken ve DNA çözeltisi ile doldurulurken rahim boynuzlarının nemlendirilmesini sağlayarak cam pipeti değiştirin.
8. Hücreleri frontal kortekste ikiye ayrı olarak transfect etmek için, embriyoların yanlarındaki iki negatif elektrodu sadece yanal ve hafif kaudal olarak yanal ventriküllere yerleştirin ve pozitif elektrodu gözler arasında, gelişmekte olan somurtma yerinin hemen önüne yerleştirin.
9. Embriyonun cömertçe nemlendirilmesini sağlayın. Dört kare darbe uygulayın (darbe süresi = 50 ms süre, darbe genliği = 36 V, geçiş aralığı = 500 ms).
10. Tüm embriyoları enjekte edin ve elektroporat ederek tek tek gider, böylece her embriyo DNA çözeltisi enjeksiyonundan hemen sonra elektroporlanır. Tüm embriyolar elektropore edildikten sonra, rahim boynuzlarını dikkatlice karın boşluğuna geri yerleştirin. Bu adım sırasında, rahim boynuzu yerleştirilmesine yardımcı olmak için karın boşluğunu steril PBS (1x) ile kaplayın.
11. Dikiş tamamlandıktan sonra hava ceplerinin kalmaması için karın boşluğunu steril 1x PBS ile doldurun. Kası emilebilir dikişlerle, cildi ise ipek emilemez dikişlerle dikin.
12. Barajın ısıtmalı bir odada en az 1 saat boyunca tamamen iyileşmesine izin verin. Sonraki 48 saat içinde, barajları düzenli olarak kontrol edin. Baraj anesteziden kurtulup kendine geldikçe hareket etmeye ve çırpmaya başlayacaktır.
13. Barajlar vücutlarını havaya kaldırıp hızlı nefes almak gibi ağrı belirtileri gösteriyorsa ameliyat sonrası analjezikler uygular. Sadece SC enjeksiyonları barajları strese sokabileceğinden ağrı belirtileri varsa, ancak deney grubuna uygulanırsa kontrol grubuna da uygulanırsa veya tam tersi.

6. Anne etkileşimi görevinde erken sosyal davranışın testedilme

NOT: Bu protokol önceki yayınlardan uyarlanmıştır^5,25. Fareler doğum sonrası (P) 18-21'den doğduktan sonra bu görevi gerçekleştirin.

1. Anne etkileşimi I (MI1) görevinde anne homing davranışı.
   1. Görev gerçekleştirilmeden önceki hafta kafes yataklarının değiştirilmediğinden emin olun.
   2. Aşağıdaki boyutlarda kolayca temizlenebilen (akrilik önerilir) bir açık alan (OF) arenası elde edin veya inşa edin: 50 x 50 x 30 cm (uzunluk-genişlik-yükseklik). Davranışların performansı sırasında aydınlatma koşulları deneysel soruya bağlı olarak değişebilir ve uyarılma ve anksiyete benzeri davranış seviyelerini etkileyebilir. Arenanın merkezine yerleştirilmiş loş bir ışık (yaklaşık 20 lüks) altında davranış deneyleri kaydedin.
   3. Davranış testinden önceki iki gün boyunca, barajı günde beş dakika boyunca arenanın bir köşesindeki bir ağ tel kabının (kalem fincanı gibi) altına yerleştirerek arenaya alıştırın.
   4. P18-21'den olabilen test gününde, fareler kesilmeden önce, arenayı sterilize edici mendiller ve% 70 etanol ile iyice temizleyin.
   5. Arenayı hem temiz yataklar içeren iki karşıt köşe hem de yavrunun ev kafesinden kirli yuva yatakları içeren bir köşe ile kurun.
   6. Her yavrunun arenayı 3 dakika boyunca keşfetmesine izin verin, her yavruyu başlangıçta nötr, boş köşeye yerleştirin.
      NOT: Davranışı 30 fps'de bir video kamera ile kaydedin. Her yavru arasındaki arenayı iyice temizleyin ve taze yatak takımını değiştirin. Alternatif olarak, diğer nedenlerden (örneğin, ortam gürültüsü veya ışık) dolayı köşe tercihini önlemek için bir kontrol olarak taze ve yuva yatak takımıdır. P18-21 geliştirme penceresinde birden fazla çöp çalıştırıyorsanız, davranış deneylerini günler arasında aynı anda çalıştırın. Ayrıca belirli bir gün boyunca kontrol ve deneysel grupların paralel olarak çalıştırılıp çalıştırılamamasına da emin olun.
2. Anne etkileşimi II (MI2) görevinde anne sosyal etkileşimi
   1. Mi1 görevinden hemen sonra bu görevi gerçekleştirin.
   2. Arenayı, bir köşe boş bir tel örgü kabı ve karşı köşe bir ağ tel kabının altındaki barajı olacak şekilde ayarlayın. Fareler fincanı hareket ettirebiliyorsa, hareketi önlemek için bardağın üstüne bantlanabilecek bir ağırlıkla tartın. Ev kafesinden kirli yuva yataklarını başka bir köşeye koyun.
   3. MI2 görevini çalıştırın. Yavruyu boş köşeye yerleştirin ve 30 fps'de beş dakika boyunca davranışı kaydedin ve yavrunun keşfetmesini sağlar. Her yavruyu ayrı ayrı çalıştırın ve her yavru arasında tüm arenayı ve tel örgü bardakları iyice temizleyin.

7. Yetişkin sosyal davranış görevinin tahlilleri

1. Yetişkin olduklarında MI1 ve MI2 görevinde çalıştırılan farelerde yetişkin sosyal davranışlarını çalıştırın (P60-P70 veya üstü). Burada toplanan veriler ayrı bir kohortta yapıldı.
2. Deneyciye alışkanlık sağlamak için yetişkin fareleri art arda 3 gün boyunca idare edin. Yalnızca farelere aşina olan deneycilerin davranış deneyleri çalıştırdığından emin olun, ideal olarak tüm görevleri aynı kişinin çalıştırmasını sağlayın.
3. Fareleri her gün 5 dakika boyunca 3 gün boyunca OF arenasına alışın.
4. Yeni bir nesne tanıma görevinde, yeni bir nesneye olan genel hareket ve ilgiyi ölçmek için davranışı test edin. Bu, farelerin sosyal etkileşimlerde belirli bir açığı varsa, sosyal davranışın daha anlamlı bir şekilde yorumlanmasına izin verecektir.
   1. Fareleri arenanın bir köşesine yeni bir nesne (pürüzsüz, temizlenebilir yüzeylere sahip küçük plastik oyuncak) ile 5 dakika boyunca arenaya yerleştirin. %70 etanol ile fareler arasındaki arenayı iyice temizleyin.
   2. Yeni nesne tanıma için, artık tanıdık olan daha önce açığa çıkan 'roman nesnesini' bir köşeye yerleştirin ve karşı köşeye yeni bir roman nesnesi yerleştirin. Tüm görevler için, denemeler arasındaki köşeleri bir denetim olarak değiştirin.
   3. Yeni sosyal etkileşim için, yeni farelerin yaş, zorlanma ve cinsiyetle eşleştiklerine ve her gün 5 dakika boyunca 2 gün boyunca örgü tel kabına alıştıklarından emin olun. Her deneme için, bir ağ tel kabının altına yeni bir fare yerleştirin ve karşı köşeye boş bir ağ tel kabı yerleştirin. Farelerin davranışları kaydederken arenayı 5 dakika keşfetmesine izin verin. Arenayı temizleyin ve her deneme arasında tel bardakları iyice mesh edin.

8. Davranışsal verilerin analizi

1. Temel gövde parçası izlemeyi gerçekleştirmek için DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) kullanın. DeepLabCut'ın nasıl yükleneceği ve kullanılacağı hakkında ayrıntılı notları GitHub sayfasında bulabilirsiniz. Temel gövde parçaları izleme tamamlandıktan sonra verilerin daha fazla analizi için özel bir python tabanlı kütüphane 'dlc_utils' (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) de mevcuttur. Bu kitaplığın nasıl kullanılacağı hakkında daha fazla ayrıntı GitHub sayfasında bulunabilir.
   1. Anakonda yükleme işlemini kullanarak DeepLabCut'ı yükleyin. Ağı eğitmek için DeepLabCut'ın yalnızca CPU özellikli bir sürümünü ve GPU özellikli sürümünü yükleyin.
   2. Vücut parçalarını izlemek için bir proje oluşturmak için aşağıdaki bağlantıda bulunan talimatları izleyin. Breifly, veri kümenizden bir kare örneği seçin ve bu örneklenmiş çerçevelerdeki ilgili gövde parçalarını manuel olarak işaretleyin. Vücut parçalarını tahmin etmek ve eğitilen ağın yeterli performans gösterdiğini doğrulamak için DeepLabCut ağını eğitin.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
   3. Vücut pozisyonunu izlemek ve açık bir alanda basit etkileşimleri tanımlamak amacıyla, hayvanın centroidini, başı (operasyonel olarak kulaklar arasındaki orta nokta olarak tanımlanır), sol ve sağ kulakları, somurtma ve kuyruğun tabanını tanımlayın. Birden fazla vücut parçasının izlenmesi, tıkanıklık nedeniyle çerçevede bazı vücut parçaları eksik olduğunda uygun ikame sağlar.
   4. Hayvan vücut parçalarının yanı sıra, çevreyle ilgili çeşitli noktaları izleyin: davranış kutularının kenarları gibi. Bunlar, davranışsal kurulumun konumu oturumlar arasında kameraya göre biraz değişse bile, bu tür noktaların birden çok oturumda tekrarlanabilir tahmin edilmesine izin verir.
   5. Davranış verilerinden gövde parçalarını takip ettikten sonra, videonun her karesindeki tahminle ilişkili güvene göre tahmin edilen gövde parçası konumlarını filtrelemeye dikkat edin. Düşük güven tahminleri genellikle tıkalı vücut parçaları ile ilişkilidir. Bu tür tahminler için, belirli bir vücut parçasını başka bir vücut parçasıyla değiştirin (bu tür bir ikame uygunsa) veya ilgili vücut parçasının nerede olabileceğini tahmin etmek için diğer vücut parçalarının konumlarını kullanın. Çoğu açık alan uygulaması için, kemirgenlerin vücudunun centroidi nadiren tıkanır ve yüksek doğruluk ve hassasiyetle tahmin edilebilir.
   6. Hayvanın davranışının bir dizi özelliğini tahmin etmek için merkezroidin tahmin edilen konumunu ve izlenen noktaların konumunu kullanın. Örneğin, açık alan verilerinde, pozisyonun zaman türevi hayvanın hızını hesaplamak için kullanılabilir.
2. Önyargıyı önlemek için, özellikle sonuçların değerlendirilmesinde herhangi bir öznel unsur olduğunda, mümkün olduğunda deney grubuna göre tüm deneyleri "kör" olarak gerçekleştirin. Verilerin erkek ve kadın gruplarına birleştirilmesiyle cinsiyet farklılıklarının ana deneysel sonuçlar üzerindeki etkisini test edin. Tüm istatistiksel testler, gruplar arasında eşit sayıda hayvanı test etmek için tasarlanmıştır.

9. Hücre transfeksiyonunun kapsamını karakterize etmek için geçici hücre sayımı sonrası

1. Fare başına transfected hücre sayısını belirleyin, çünkü tüm fareler başarılı bir transfeksiyona sahip olmayacak ve transfected hücrelerin sayısında değişiklik olacaktır. Bunu başarmak için bir yöntem, alternatif koronal bölümlerdeki transfected nöronların sayısını saymayı ve ardından toplam transfected hücre sayısını tahmin etmek için bir enterpolasyonu içerir. Bunun için, diğer tüm koronal bölümleri (50 μm) görüntüleyin ve sayın.
   1. Dokuyu düzeltmek ve sonra beyni parçalamak için% 4 PFA ile transkardiyal perfüzyonlar kullanın. Kriyoproteksiyondan sonra, beyni 50 μm'de koronal bölümlere bölümler.
   2. Frontal korteks için, Bregma'dan +2.75 ve + 1.35 mm içindeki hücreleri sayın. Bu koordinatlar frontal kortikal alanlar içerir ve somatosensör korteksin (S1) bir kısmını içerir.  Bu yöntem kullanılarak, daha kaudal kortikal bölgelerde veya subkortikal alanlarda gözlenen transkla enfekte hücre yoktu.
   3. Kesitleme sırasında bir yarımküreyi iğne deliğiyle işaretlemek ve hücreleri iki taraflı saymak gibi sağ yarımküreden sola işaretlemeyi unutmayın. DAPI kullanarak bir hücre gövdesinin varlığını doğrulayan otomatik bir hücre sayma yazılımı kullanın veya hücreleri el ile sayın.
2. Hücre sayıları alındıktan sonra, ekleme için bir eşik ayarlayın. Örneğin, sadece analizde iki taraflı elektroporlu fareleri içerir. Daha fazla analiz için, bir ilişki olup olmadığını görmek için davranışsal yanıtlarla transkine olmuş hücre sayısını ilişkilendirin. Bu teknik birden fazla beyin bölgesini hedef alacaktır, bu nedenle hangi beyin bölgelerinin genetik olarak manipüle edildiği hakkında bilgi vermek gerekir.
   NOT: Bazı genlerin manipüle ederek nöronal göçü, spesifikasyonu ve/veya ölümü değiştirmesi mümkündür. Hücre sayımı sırasında beyin anatomisinin incelendiğinden ve her transfected nöronun sözde transfected olan tabaka içinde olduğundan emin olun (yani L2/3). Kortikal kalınlık gibi brüt anatomik ölçümler de pia'dan kortikal L6'ya olan mesafe ölçülerek ölçülebilir.

Sonuçlar

Özel yapım bir elektroporatör ve üç uç elektrotunun başarılı gelişimi ve uygulanması.
İEÜ'ler için, daha önce tanımlanmış bir tasarım^27'ye (Şekil 1A ve Şekil2) dayanan ucuz bir özel yapım elektroporatör inşa edildi. Uçlarına bağlı²negatif elektrotlu plastik tokmaklar kullanılarak^{23 ,}24 prong elektrodu yapıldı ve pozitif elektrot ...

Tartışmalar

Burada, frontal kortikal nöronların büyük popülasyonlarında ilgi çekici yeni genlerin manipülasyonu ile farelerdeki davranışsal tahlilleri birleştiren bir boru hattı açıklanmaktadır. Ayrıca, bu boru hattı hem erken doğum sonrası gelişim sırasında hem de yetişkinlikte aynı farelerdeki davranışların uzunlamasına incelenmesine izin verir. Bu teknik, zaman ve masraflar açısından maliyetli olabilecek genetik hayvan modellerine güvenme ihtiyacını atlar. Bu protokolün gücü, son GWAS'ın yeni...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
13mm Silk Black Braided Suture	Havel's	SB77D	Suture skin
Adson Forceps	F.S.T.	11006-12	IUE
C270 Webcam	Logitech	N/A	Record behavior
Electroporator	Custom-built	N/A	See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps	Bio Basic Inc.	BS466	Pladmid preparation
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G	Dye for DNA solution
Fine scissors- sharp	F.S.T.	14060-09	IUE
Fisherbrand Gauze Sponges	Fisher Scientific	1376152	IUE
Gaymar Heating/Cooling	Braintree	TP-700	Heating Pad
Glass pipette puller	Sutter Instrument,	P-97	IUE
Glass pipettes	Sutter Instrument,	BF150-117-10	IUE
Hair Removal Lotion	Nair	N/A	Hair removal
Hartman Hemostats	F.S.T.	13002-10	IUE
Open field maze- homemade acrylic arena	Custom-built	N/A	50 × 50 × 30 cm length-width-height
pCAG-GFP	Addgene	11150	Mammalian expression vector for expression of GFP
Picospritzer III	Parker Hannifin	N/A	pressure injector
Retractor - 2 Pronged Blunt	F.S.T.	17023-13	IUE
Ring forceps	F.S.T.	11103-09	IUE
Sterilizer, dry bead	Sigma	Z378569	sterelize surgical tools
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY	Havel's	HJ398	Suture muscle
Water bath	Cole-Parmer	EW-12105-84	warming sterile saline