JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Роль недавно обнаруженных связанных с болезнью генов в патогенезах нейропсихиатрических расстройств остается неясной. Модифицированная двусторонняя в утробе матери техника электропорации позволяет передавать гены в больших популяциях нейронов и изучение причинно-следственного воздействия изменений экспрессии генов на социальное поведение.

Аннотация

По мере того как исследования ассоциации генома проливают свет на неоднородные генетические основы многих неврологических заболеваний, возрастает необходимость изучения вклада конкретных генов в развитие мозга и функции. Опираясь на мышиные модели для изучения роли конкретных генетических манипуляций не всегда возможно, поскольку трансгенные линии мыши являются довольно дорогостоящими и многие новые болезни связанных генов еще не имеют коммерчески доступных генетических линий. Кроме того, для создания линии мыши могут работать годы разработки и проверки. В утробе электропорации предлагает относительно быстрый и простой метод для манипулирования экспрессией генов в клеточном типе специфическим образом in vivo, что требует только разработки плазмидной ДНК для достижения конкретной генетической манипуляции. Двусторонняя в утробе матери электропорация может быть использована для целевой больших популяций лобной коры пирамидальных нейронов. Сочетание этого метода передачи генов с поведенческими подходами позволяет изучить влияние генетических манипуляций на функцию префронтальных сетей коры и социальное поведение несовершеннолетних и взрослых мышей.

Введение

Геномные исследования ассоциации (GWAS) привели к открытию новых генов-кандидатов, которыесвязаны с патологиями мозга 1,2,3,4. Эти исследования были особенно полезны в понимании разрушительных нейропсихиатрических расстройств, таких как шизофрения (ССЗ), где исследование новых генов послужило стартовой точкой для новых направлений исследований итерапевтического вмешательства 5,6. Гены, укрывающие риск для СКЗ, проявляют предвзятое выражение в префронтальной коре (ПФУ) во время пренатального и раннего послеродового развития, региона, вовлеченного в патологию нескольких нейропсихиатрическихрасстройств 7. Кроме того, мышиные модели психических расстройств проявляют аномальную активность всетях ПФК 6,8,9. Эти результаты свидетельствуют о том, что гены, связанные с СЗК, могут играть определенную роль в развитии этого региона. Дальнейшее исследование с использованием моделей животных требуется, чтобы понять вклад этих генов-кандидатов в создание связей в ПФУ и определить, имеют ли эти гены причинно-следственную роль в патогенеза нейропсихиатрических расстройств. Методы генетических манипуляций у мышей, которые позволяют изучать изменения экспрессии генов на конкретных нейронных схемах во время пренатального и раннего послеродового развития, являются перспективным методом понимания молекулярных механизмов, которые связывают изменения экспрессии генов с дисфункцией ПФУ.

Генетические линии мыши предлагают метод для изучения влияния конкретных генов на развитие мозга и функции. Однако, полагаясь на трансгенных мышей может быть ограничение, поскольку Есть не всегда коммерчески доступны линии для изучения влияния конкретных генов на развитие нейронных цепей. Кроме того, разработка пользовательских линий мыши может быть чрезвычайно дорогостоящей и трудоемкой. Использование перекрестных генетических стратегий манипуляции, которые сочетают трансгенных мышей с вирусными подходами произвел революциюв понимании мозга 10,11,12. Несмотря на значительный прогресс, вирусные стратегии приходят с определенными ограничениями в зависимости от типа вирусного вектора, в том числе ограничения в упаковочной емкости, которыемогут ограничить вирусное выражение 13 и токсичность клеток, связанных свирусным выражением 14. Кроме того, в большинстве экспериментальных условий, надежная экспрессия генов с использованием адено-ассоциированного вируса (AAVs) требует примерно от 2 до 4недель 15, что делает обычные вирусные стратегии неосуществимыми для манипулирования генами во время раннего послеродового развития.

В утробе электропорации (IUE) является альтернативным подходом, который позволяет быстро и недорогопередачи генов 16,17, что,в сочетании с флуоресцентной маркировки и фармакогенетических или оптогенетических подходов, обеспечивает мощную платформу для вскрытия функции нейронных цепей. Кроме того, с развитием CRISPR-Cas9 гены редактирования генома могут быть переэкспрессированы или точно изменены через клеточный тип конкретных нокдаун или нокаут конкретных генов или через модуляцию промоутеров18,19. Подходы к манипуляции с генами с использованием IUE особенно выгодны, когда влияние генов на нейронные цепи должно быть проверено во время узких оконразвития 20. IUE является универсальной техникой и переэкспрессии может быть легко достигнуто путем вставки гена в вектор выражения под конкретным промоутером. Дополнительный контроль экспрессии генов может быть достигнут путем вождения выражение с помощью промоутеров различных сильных сторон или с помощью неизгладимых промоутеров, способныхвременно контролировать экспрессию генов 21,22. Кроме того, IUE позволяет таргетирование клеток в пределах конкретных корковых слоев, типов клеток и областей мозга, что не всегда возможно с помощьюдругих подходов 5,17. Последние достижения в конфигурации IUE, основанные на использовании трех электродов, который генерирует более эффективное распределение электрического поля, расширили функциональный репертуар этого метода и позволили ученым ориентироваться на новые типы клеток и увеличить эффективность, точность и количество клеток, которые могут бытьнаправлены 23,24. Этот метод был недавно использован для определения причинной роли компонента дополнения 4A (C4A), гена, связанного с СКЗ, в функции PFC и раннегопознания 5.

Представлено здесь экспериментальный трубопровод, который сочетает в себе подходы передачи генов к целевой больших популяций возбуждающей нейронов в лобной коре, в том числе PFC, с поведенческими парадигмами, которые не только позволяют изучать изменения клеточного и окружного уровня, но и позволяет контролировать поведение на протяжении всего раннего послеродового развития и взрослой жизни. Первый описанный метод двустороннего трансфекта больших популяций слоя (L) 2/3 пирамидальных нейронов в лобных корковых областях. Далее, задачи по анализу социального поведения у несовершеннолетних и взрослых мышей изложены. Количество клеток может быть получено после завершения поведенческих задач для количественной оценки степени и расположения трансфекции клеток. Кроме того, количество трансфицированных клеток может быть коррелировано с поведенческими данными, чтобы определить, если большее количество трансфектированных клеток приводит к большим возмущениям в поведении.

протокол

Все экспериментальные протоколы были проведены в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения (NIH) для исследований на животных и были одобрены Бостонским университетом институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC).

1. Подготовка раствора ДНК

  1. Приобретете коммерческую плазмиду или субклон ген, представляющий интерес для плазмиды с желаемым промоутером. Здесь была использована плазмида, содержащая EGFP под руководством промоутера CAG (pCAG-EGFP).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите желаемого промоутера на основе уровня выражения необходимо. В целом, плазмиды под ПРОМОУТЕР CAG могут быть использованы для достижения высоких уровней трансгена в то время как клеточный тип конкретных промоутеров (например, синапсин для нейронов), как правило, менее активны. Экспериментатор должен эмпирически определить соответствующие уровни экспрессии для каждой плазмиды.
  2. Преобразование бактерий и расти запасы в бактериальных средств массовой информации с соответствующим антибиотиком.
    1. Удалите компетентные клетки (клетки DH5) из -80 градусов по Цельсию и оттаять на льду в течение 20 минут.
    2. Смешайте 100 пг -100 нг плазмидной ДНК с 30 МКЛ компетентных клеток. Инкубировать смесь на льду в течение 20 мин.
    3. Выполните тепловой удар, инкубируя в водяной бане 42 градусов по Цельсию в течение 45 с, а затем вернуть трубку обратно на лед в течение 2 минут.
    4. Добавьте 200 - 1000 л Л.С. Л. к преобразованным компетентным клеткам и расти в течение 45 мин при 37 градусах по Цельсию на трясущимся инкубаторе.
    5. Плита 200 МКЛ преобразованных клеток в пластину LB агара, содержащую соответствующий антибиотик и инкубировать пластины на ночь при 37 градусов по Цельсию.
    6. На следующий день инкубировать одну бактериальную колонию в 200 мл бульона LB с соответствующим антибиотиком при 37 градусов по Цельсию на встряхивания инкубатора на ночь.
  3. Очистите плазмидную ДНК с помощью комплекта maxiprep.
    1. Следуйте инструкциям, представленным в полученном комплекте maxiprep. Для elution шаг, не elute ДНК в буфер elution. Вместо этого, elute ДНК с использованием либо 200 йл стерильных 1x PBS или молекулярного класса воды.
    2. Убедитесь, что окончательная концентрация ДНК превышает 1 мкг/мл. Если плазмида, содержащая ген, представляющий интерес, не содержит гена репортера, то также подготовить плазмид для совместного трансфекта с молекулой репортера, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP), чтобы обеспечить визуализацию трансфектированных клеток.
  4. Подготовь решение ДНК для операции, разбавляя плазмидную ДНК в 1x PBS до 1 мкг/ЛЬ окончательной концентрации каждой плазмиды. Добавьте быстрый зеленый краситель в раствор ДНК в окончательную концентрацию 0,1%. Для двусторонних инъекций приготовьте 60 мкл раствора на плотину (примерно 10 щенков).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если плазмида не содержит гена репортера, со-электропорат с GFP. Скорость со-электропорации, как правило, 95% или выше. В наших руках на эффективность трансфекции не повлияла ко-трансфекция. Все электропотезированные плазмиды должны быть разбавлены до 1 мкг/л.

2. Заказ или разведение времени беременных мышей

  1. При заказе времени беременных мышей, приказать мышам прибыть на эмбриональный день (E) 13 или раньше, чтобы плотины достаточно времени, чтобы акклиматизироваться к жилью животных.  В этом протоколе, CD-1 outbred мышей используются для всех экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заказ на несколько дней вперед снизит стресс животных и приведет к более высокой выживаемости щенков.
  2. При разведении приусадено-беременных мышей, пара самок мышей с самцом на ночь, раз в неделю. Проверьте наличие вагинальной вилки на следующее утро (E0.5). Определите беременность путем мониторинга веса самок мышей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные штаммы мыши имеют различные увеличения веса во время беременности, так что определить типичный прирост веса для мыши штамма используется.
  3. Будь то заказ или разведение мышей, чтобы уменьшить стресс плотин, место гнездования площадку и мышь дом в клетке. Снижение стресса может помочь увеличить выживаемость щенков.

3. Проектирование и сборка трех зубцового электрода

  1. Используйте титановые листы 2-го класса толщиной 0,063 в качестве запасного материала для электродных контактов.
  2. Используя стандартные методы обработки или высокоточные ручные инструменты, сделайте электроды со следующими размерами: 20 мм х 5 мм с закругленным кончиком и рифленой спиной. Удалите любые шероховатости или заусенцы с помощью тонкой наждачной бумаги песка.
  3. Чтобы проволоки электрод контактов, оберните 22 G мель медной проволоки вокруг канавки электрода и обеспечить путем припоя. Защитите этот сустав с помощью тепловых трубок.
  4. Затем прикрепите подключенный электрод к автоклавируемым, непроводяющим типсам, используя дополнительные тепловысодержающие трубки, чтобы сделать два отрицательных электрода. Прикрепите один положительный электрод к автоклавируемому, непроводякому материалу (например, ручке зубной щетки с отпиленой головой). Fit открытый конец провода со стандартной банановой вилкой.

4. Подготовка к операции

  1. Принесите беременные плотины в область хирургии по крайней мере за 30 минут до операции, чтобы обеспечить снижение уровня стресса после транспортировки из животного объекта.
  2. Стерилизовать весь хирургический участок с помощью стерилизации гермицидных салфеток, а затем 70% этанола. Изменение перчатки до начала операции.
  3. Стерилизовать автоклавные инструменты в стеклянном стерилизаторе бисера.
  4. Передача стерильных 1x PBS (около 50 мл на плотину) до 50 мл конических трубок и поместите в трубку стойку в водяной бане с подогревом до 38-40 градусов по Цельсию. Проверьте стерильную соленую температуру с помощью термометра.
  5. Включите насос циркуляции нагрева воды так, чтобы он нагревался до 37 градусов по Цельсию до начала операции. Это позволит поддерживать температуру тела мыши в течение всего срока операции.
  6. Включите давление-инжектор и электропоратор и обеспечить надлежащую функцию до операции.
  7. Кратко закрутить плазмидный раствор ДНК (полученный в шаге 1.4) на столешницу центрифугу и поместить его на лед.
  8. Потяните стеклянные пипетки на пипетку шкив так, что кончик вытащил стекла пипетки составляет около 50 мкм в диаметре.
  9. Заполните пипеткой 20-40 МКЛ раствора ДНК (полученного в шаге 1.4).
  10. Настройка всех необходимых предметов для хирургии, включая лосьон для удаления волос, йод, 70% этанола, хлопковые свопы, мазь для глаз, швы, марлю и т.д.
  11. Подготовьте хирургический лист и заполните необходимую информацию, такую как удостоверение личности мыши и вес, дата операции, имя хирурга и т.д.

5. В хирургии электропорации матки

  1. Взвесьте мышь перед операцией и обратите внимание на это на листе операции.
  2. Обезболить беременную мышь (E16) путем вдыхания в индукционной камере с 4% (v/v) кислородно-изофлюрановой смесью. После того, как мышь была индуцирована, перейти к маске ингаляции и поддерживать изофлюран на 1-1,5% (V / V) и контролировать дыхание на протяжении всей операции. Убедитесь, что мышь полностью анестезируется, скорость дыхания должна быть 55-65 вдохов за минуту.
  3. Администрировать предоперационные анальгетики: бупренорфин (3,25 мг/кг; СК) и мелоксикам (1-5 мг/кг; SC) при максимальном объеме 10-30 мл/кг.
  4. Используйте крем для удаления волос или тщательно использовать бритву, чтобы удалить мех из живота. Стерилизовать живот путем мазка с povidone йода и 70% этанола и повторить это по крайней мере 3 раза. Создать стерильное поле вокруг живота с помощью стерильной марли, стерильные драпировки также могут быть использованы.
  5. Сделать разрез средней линии (3-4 см) в брюшной коже, будучи уверенным, чтобы поднять кожу с типсами, чтобы избежать резки через мышцы. Затем прорезать мышцы, снова заботиться, чтобы поднять мышцы, чтобы избежать резки жизненно важных органов.
  6. Аккуратно вытащите рога матки из плотины с помощью щачатых типсов и аккуратно поместите их на стерильное поле, убедившись, что рог матки поддерживается обивкой и не дергает слишком далеко от плотины. С этого момента, держать рог матки увлажненной на протяжении всей остальной части операции с предварительно разогретой стерильной 1x PBS.
  7. Позиция эмбриона с помощью миппов или пальцев. Аккуратно вставьте вытянутую стеклянную пипетку под углом 45 градусов по отношению к горизонтальной плоскости головы и вставьте в боковой желудочек, который можно визуально определить между средней линией мозга и глазом. Ввись около 2-3 йл в каждый боковой желудочек либо вставив пипетку в один, а затем другой желудочек (рекомендуется) или путем введения раствора ДНК в один желудочек, пока он не проходит в обоих боковой желудочков. Желудочек был успешно направлен, если форма полумесяца присутствует после инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик стеклянной пипетки может сломаться во время операции. Если это произойдет, замените стеклянную пипету, гарантируя, что рога матки будут увлажнены, пока готовится новая пипетка и заполняется раствором ДНК.
  8. Чтобы трансфициентные клетки двусторонне в лобной коре, положение двух отрицательных электродов по бокам головы эмбрионов только боковой и слегка caudal к боковым желудочкам и положение положительного электрода между глазами, как раз перед развивающейся морды.
  9. Убедитесь, что эмбрион щедро увлажняется. Нанесите четыре квадратных импульса (длительность пульса - 50 мс, амплитуду пульса - 36 В, межпульсовой интервал - 500 мс).
  10. Инъекции и электропорат всех эмбрионов, происходит один за другим, так что каждый эмбрион электропотери сразу после инъекции раствора ДНК. После того, как все эмбрионы были электропотери, тщательно вставьте рога матки обратно в брюшную полость. Во время этого шага, пальто брюшной полости в стерильных PBS (1x), чтобы помочь размещения рога матки.
  11. Заполните брюшную полость стерильной 1x PBS так, чтобы никакие воздушные карманы не оставались после зашвасывания завершена. Шов мышцы с абсорбируемыми швами и кожу с шелковыми неаспасаемыми швами.
  12. Разрешить плотины полностью восстановить в нагретой камере, по крайней мере 1 ч. В ближайшие 48 ч регулярно проверяйте плотины. Как плотина восстанавливается после анестезии и приходит в сознание, он начнет двигаться и взбивая.
  13. Администрирование послеоперационных анальгетиков, если плотины проявляют признаки боли, такие как balling их тела и дыхание быстро. Только управлять, если Есть признаки боли, поскольку инъекции SC может подчеркнуть плотины, но если вводить экспериментальной группы также управлять контрольной группы, или наоборот.

6. Анализ раннего социального поведения в задаче материнского взаимодействия

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из предыдущих публикаций5,25. Выполните эту задачу после того, как мыши родились от послеродового дня (P) 18-21.

  1. Материнское самонаведение в материнском взаимодействии I (MI1) задача.
    1. Убедитесь, что постельные принадлежности в клетке не меняются в течение недели до выполнения задачи.
    2. Получить или построить открытое поле (OF) арене, которые могут быть легко очищены (акрил рекомендуется) со следующими размерами: 50 х 50 х 30 см (длина ширины высоты). Условия освещения во время выполнения поведения могут варьироваться в зависимости от экспериментального вопроса и может влиять на уровни возбуждения и тревоги, как поведение. Запись поведенческих экспериментов под тусклым светом (примерно 20 люкс), расположенных над центром арены.
    3. За два дня до тестирования поведения, акклиматизировать плотину на арену, поместив его под чашку проволоки сетки (например, карандаш чашку) в углу арены в течение пяти минут в день.
    4. В день тестирования, который может быть от P18-21, прежде чем мыши были отувки, очистить арену тщательно с дезинфекции салфетки и 70% этанола.
    5. Настройка арены с двумя противоположными углами, как содержащие чистые постельные принадлежности и один угол, содержащий загрязненные постельные принадлежности гнезда из домашней клетки щенка.
    6. Позвольте каждому щенку исследовать арену в течение 3 минут, поместив каждого щенка в нейтральный, пустой угол в начале.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запись поведения с видеокамерой на 30 fps. Тщательно очистить арену между каждым щенком и заменить свежие постельные принадлежности. Альтернативный, какой угол свежий по сравнению с гнездом постельных принадлежностей в качестве контроля, чтобы избежать предпочтения углу из-за других причин (например, окружающий шум или свет). Если работает несколько пометов через P18-21 развития окна, запустить поведенческие эксперименты в то же время между днями. Кроме того, обеспечить, чтобы в течение данного дня, контроль и экспериментальные группы работают параллельно.
  2. Материнское социальное взаимодействие в задаче материнского взаимодействия II (MI2)
    1. Выполните эту задачу сразу после выполнения задачи MI1.
    2. Навеяте арену так, чтобы один уголок содержит пустую чашку проволочной сетки, а противоположный уголок содержит плотину под чашкой сетки. Если мыши в состоянии переместить чашку, весят чашку вниз с весом, который может быть приклеен к верхней части чашки, чтобы предотвратить движение. Положите загрязненные постельные принадлежности гнезда из домашней клетки в другом углу.
    3. Вывыполнения задачи MI2. Поместите щенка в пустой угол и запись поведения в течение пяти минут при 30 fps, что позволяет щенку исследовать. Вы запустите каждого щенка отдельно и тщательно очистить всю арену и проволоки сетки чашки между каждым щенком.

7. Анализ задачи социального поведения взрослых

  1. Запуск взрослого социального поведения в тех же мышей, которые были запущены в MI1 и MI2 задачи, как только они взрослые (P60-P70 или старше). Собранные здесь данные были сделаны в отдельной когорте.
  2. Ручка взрослых мышей в течение 3 дней подряд, чтобы привыкание к экспериментатору. Убедитесь, что только экспериментаторы, которые были ознакомлены с мышами запустить эксперименты поведения, в идеале имеют тот же человек запустить все задачи.
  3. Привычка мышей на арену OF в течение 3 дней в течение 5 минут каждый день.
  4. Поведение анализа в задаче распознавания новых объектов для измерения общего передвижения и интереса к роману объекта. Это позволит более значимое толкование социального поведения, если мыши имеют определенный дефицит в социальных взаимодействий.
    1. Поместите мышей на арену в течение 5 минут с новым объектом (маленькая пластиковая игрушка с гладкими, очищаемыми поверхностями) в одном углу арены. Очистите арену тщательно между мышами с 70% этанола.
    2. Для распознавания новых объектов поместите ранее выставленный «новый объект», который теперь знаком, в одном углу и поместите новый новый объект в противоположный угол. Для всех задач переключитесь углы между испытаниями в качестве управления.
    3. Для новых социальных взаимодействий, убедитесь, что новые мыши возраста, напряжения и пола совпадают и акклиматизированы к чашке проволоки сетки в течение 2 дней подряд в течение 5 минут каждый день. Для каждого испытания поместите новую мышь под чашку сетки проволоки и в противоположном углу поместите пустую чашку проволоки сетки. Пусть мыши исследовать арену в течение 5 минут во время записи поведения. Очистите арену и чашки сетки проволоки тщательно между каждым испытанием.

8. Анализ поведенческих данных

  1. Используйте DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) для выполнения основных отслеживания части тела). Подробные заметки о том, как установить и использовать DeepLabCut можно найти на своей странице GitHub. Также доступна пользовательская библиотека на основе питона 'dlc_utils' (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) для дальнейшего анализа данных после завершения отслеживания основных частей тела. Более подробную информацию о том, как использовать эту библиотеку, можно найти на странице GitHub.
    1. Установите DeepLabCut с помощью процесса установки анаконды. Установите GUI, способный процессор только версия DeepLabCut, а также GPU-версии для обучения сети.
    2. Следуйте инструкциям, доступным в ссылке ниже, чтобы создать проект для отслеживания частей тела. Брейфли, выберите образец кадров из набора данных и вручную отметите соответствующие части тела в этих отобранных кадрах. Обучить сеть DeepLabCut для прогнозирования частей тела и проверки того, что обученная сеть работает адекватно.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
    3. Для отслеживания положения тела и выявления простых взаимодействий в открытом поле, определить центроид животного, голову (оперативно определяется как средняя точка между ушами), левый и правый уши, а также морду и основание хвоста. Наличие нескольких частей тела отслеживается позволяет соответствующую замену, когда некоторые части тела отсутствуют в кадре из-за окклюзии.
    4. Помимо частей тела животных, отслеживать различные точки, связанные с окружающей средой: такие, как края поведения коробки. Они позволяют повторить оценку таких точек через несколько сеансов - даже если положение поведенческой установки немного меняется по отношению к камере между сессиями.
    5. После отслеживания частей тела из данных о поведении, позаботьтесь, чтобы фильтровать прогнозируемые места части тела на основе уверенности, связанной с прогнозом на каждом кадре видео. Низкие прогнозы доверия, как правило, связаны с окклюдными частями тела. Для таких прогнозов замените часть тела другой (если такая замена уместна) или используйте расположение других частей тела, чтобы предсказать, где может быть соответствующая часть тела. Для большинства открытых полевых применений центроид тела грызунов редко затмевается и может быть предсказан с высокой точностью и точностью.
    6. Используйте прогнозируемое расположение центроидов, а также расположение отслеживаемых точек в окружающей среде для оценки ряда особенностей поведения животного. Например, в открытых полевых данных для расчета скорости животного можно использовать производное от положения время.
  2. Чтобы избежать предвзятости, выполните все эксперименты "слепой" по отношению к экспериментальной группе, когда это возможно, особенно когда есть какой-либо субъективный элемент в оценке результатов. Тест на влияние половых различий на основные экспериментальные результаты путем объединения данных в мужские и женские группы. Все статистические тесты предназначены для проверки равного количества животных между группами.

9. Пост-специальный подсчет клеток для характеристики степени трансфекции клеток

  1. Определите количество клеток, трансфицированных на мышь, так как не все мыши будут иметь успешную трансфекцию и будут различия в количестве трансфицированных клеток. Один из методов достижения этой цели включает в себя подсчет числа трансфицированных нейронов в чередующихся короналовых секциях с последующим интерполяцией для оценки общего числа трансфицированных клеток. Для этого, изображение и рассчитывать любой другой корональной секции (50 мкм).
    1. Используйте транскардиальные перфузии с 4% PFA, чтобы исправить ткани, а затем вскрыть мозг. После криопротекторной операции разделите мозг в корональных секциях на 50 мкм.
    2. Для лобной коры, подсчитайте клетки в пределах 2,75 и 1,35 мм от Брегмы. Эти координаты содержат лобные корковые области и включают в себя часть соматосенсной коры (S1).  Используя этот метод, не наблюдалось трансфектных клеток в более хвостовых корковых регионах или подкорковых областях.
    3. Обязательно обозначайте левое из правого полушария, например, отмечая одно полушарие отверстием иглы во время сечения, и подсчитывайте клетки на двусторонней основе. Используйте автоматизированное программное обеспечение для подсчета ячеек или подсчитайте ячейки вручную, подтверждая наличие тела клетки с помощью DAPI.
  2. Как только количество ячеев получено, установите порог для включения. Например, только включить мышей, которые двусторонне электропотери в анализе. Для дальнейшего анализа соотносите количество клеток, трансфицированных с поведенческими реакциями, чтобы увидеть, есть ли связь. Этот метод будет направлен на несколько областей мозга, поэтому необходимо предоставить информацию о том, какие области мозга были генетически манипулировать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вполне возможно, что манипулирование определенными генами может изменить миграцию нейронов, спецификации и / или смерти. Убедитесь во время подсчета клеток, что анатомия мозга рассматривается и каждый трансфицированный нейрон находится в пределах слоя, который якобы был трансфицирован (т.е. L2/3). Грубые анатомические измерения, такие как толщина коры, также могут быть количественно оценены путем измерения расстояния от пиа до корковой L6.

Результаты

Успешная разработка и внедрение специально построенного электропоратора и трех зубцов-электродов.
Для IUEs, недорогой специально построенный электропоратор был построен на основе ранее описанногодизайна 27 (рисунок 1A и рисунок 2). ?...

Обсуждение

В этом случае описывается конвейер, сочетаемый в манипуляции новыми генами, представляющими интерес для больших популяций лобных корковых нейронов, с поведенческими анализами у мышей. Кроме того, этот трубопровод позволяет продольное исследование поведения у тех же мышей как во время...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствие конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим Лизу Креце за критически важную обратную связь и редактирование рукописи. Мы благодарим всех научных сотрудников в лаборатории Круз-Мартин, которые были бесценны в оказании помощи в перфузии и подсчета клеток мозга поведения. Мы благодарим Анджея Цветча за вклад в проектирование триполярного электрода, Тодда Блата и Ядро биологической визуализации Бостонского университета для использования конфокального микроскопа. Эта работа была поддержана NARSAD Молодой следователь Грант (AC-M, #27202), Брентон Р. Лутц премии (ALC), И. Олден Макки премии (ALC), NSF NRT UtB: Нейрофотоника Национальной исследовательской стипендии (ALC, #DGE1633516), и Бостонского университета undergraduate Research Opportunities Program (WWY). Спонсоры не играли никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
13mm Silk Black Braided SutureHavel'sSB77DSuture skin
Adson ForcepsF.S.T.11006-12IUE
C270 WebcamLogitechN/ARecord behavior
ElectroporatorCustom-builtN/ASee Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20prepsBio Basic Inc.BS466Pladmid preparation
Fast Green FCFSigmaF7252-5GDye for DNA solution
Fine scissors- sharpF.S.T.14060-09IUE
Fisherbrand Gauze SpongesFisher Scientific1376152IUE
Gaymar Heating/CoolingBraintreeTP-700Heating Pad
Glass pipette pullerSutter Instrument,P-97IUE
Glass pipettesSutter Instrument,BF150-117-10IUE
Hair Removal LotionNairN/AHair removal
Hartman HemostatsF.S.T.13002-10IUE
Open field maze- homemade acrylic arenaCustom-builtN/A50 × 50 × 30 cm length-width-height
pCAG-GFPAddgene11150Mammalian expression vector for expression of GFP
Picospritzer IIIParker HannifinN/Apressure injector
Retractor - 2 Pronged BluntF.S.T.17023-13IUE
Ring forcepsF.S.T.11103-09IUE
Sterilizer, dry beadSigmaZ378569sterelize surgical tools
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLYHavel'sHJ398Suture muscle
Water bathCole-ParmerEW-12105-84warming sterile saline

Ссылки

  1. Yang, Y., et al. Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations. Translational Psychiatry. 8 (1), 144 (2018).
  2. Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  3. Howard, D. M., et al. Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions. Nature Neuroscience. 22 (3), 343-352 (2019).
  4. Grove, J., et al. Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder. Nature Genetics. 51 (3), 431-444 (2019).
  5. Comer, A. L., et al. Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction. PLoS Biology. 18 (1), 3000604 (2020).
  6. Chini, M., et al. Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment. Neuron. 105 (1), 60-74 (2020).
  7. Clifton, N. E., et al. Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development. Translational Psychiatry. 9 (1), 74 (2019).
  8. Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness. European Journal of Neurosciences. 50 (6), 3072-3084 (2019).
  9. Batista-Brito, R., et al. Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits. Neuron. 95 (4), 884-895 (2017).
  10. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress. Neuron. 98 (2), 256-281 (2018).
  11. DeNardo, L., Luo, L. Genetic strategies to access activated neurons. Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).
  12. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).
  13. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Molecular Therapy. 18 (1), 80-86 (2010).
  14. Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses. Journal of Neurosciences. 35 (24), 8979-8985 (2015).
  15. Cruz-Martín, A., et al. A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex. Nature. 507 (7492), 358-361 (2014).
  16. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature Protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  17. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neurosciences. 30 (23), 7793-7803 (2010).
  18. Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering. Bioengineered. 7 (3), 166-174 (2016).
  19. Strecker, J., et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science. 365 (6448), 48-53 (2019).
  20. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice. PLoS One. 7 (2), 32446 (2012).
  21. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. 19, 120-125 (2009).
  22. Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37 (2011).
  23. Szczurkowska, J., et al. Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe. Nature Protocols. 11 (3), 399-412 (2016).
  24. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
  25. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosciences. 17 (3), 400-406 (2014).
  26. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neurosciences. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  27. Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Development Growth and Differentiation. 57 (5), 369-377 (2015).
  28. Li, Z., et al. Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia. Nature Genetics. 49 (11), 1576-1583 (2017).
  29. Ripke, S., et al. Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia. Nature Genetics. 45 (10), 1150-1159 (2013).
  30. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. Journal of Visualized Experiment. (90), e51518 (2014).
  31. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
  32. Soma, M., et al. Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. Journal of Comparative Neurology. 513 (1), 113-128 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены