3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

Özet

Sunulan yaklaşım aynı anda 3D spheroid tahliller ve T-hücre sitotoksisite kanser hücresi invazyonu değerlendirir. Spheroids bir iskele-free agarose multi-microwell döküm oluşturulur. Eş-kültür ve tip I kollajen matris gömme kanser hücresi invazyonu ve T-hücre aracılı sitotoksisite izlemek için izin veren aynı cihaz içinde gerçekleştirilir.

Özet

Çok sayıda kanser tedaviye dirençli kalmasına rağmen, immünoterapi ile kanser tedavisinde önemli ilerleme kaydedilmiştir. Tahliller sınırlı sayıda tümör ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri doğrudan izleme ve mekanistik anlayışlar için izin, aralarında, T-hücreleri kanser hücrelerine adaptif bağışıklık sisteminin sitotoksik yanıt yürütülmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Çoğu tahliller kullanım bağıl kolaylığı nedeniyle hücrelerin iki boyutlu (2D) co-kültür dayanmaktadır ama invaziv büyüme fenotip sınırlı temsili ile, kanser hücrelerinin özelliklerinden biri. Mevcut üç boyutlu (3D) co-kültür sistemleri ya özel ekipman veya ortak kültürlü kanser hücrelerinin işgali ve t-hücreleri etkileşim için ayrı izleme gerektirir.

Burada eş-kültürde kanser hücresi küreseloidleri ve T-hücre sitotoksisitesi 3D invaziv davranışı izlemek için aynı anda bir yaklaşım açıklar. Speküoid oluşumu U şekilli dipleri ile iskele içermeyen agarose microwell dökümleri gelişmiş hücre-hücre etkileşimleri tarafından tahrik edilir. Tip I kollajen matris içine T-hücre co-kültür ve kanser hücresi invazyonu hücreleri aktarmak için gerek kalmadan agarose dökümmikrowells içinde gerçekleştirilir, böylece töz boyunca sağlam bir 3D co-kültür sistemi koruyarak. Kollajen matriks agarose döküm ayrılabilir, immünoresans için izin (IF) boyama ve hücrelerin konfokal görüntüleme için. Ayrıca, hücreler daha fazla büyüme için izole edilebilir veya gen ekspresyonu veya floresan aktif hücre sıralama (FACS) gibi analizlere tabi tutulabilir. Son olarak, 3D co-kültür katıştırma ve kesit sonra immünohistokimya (IHC) ile analiz edilebilir. Tgörünüşe olası değişiklikler ekstrasellüler matriks değiştirilmiş kompozisyonları içerir (ECM) yanı sıra kanser hücreleri ile farklı stromal veya bağışıklık hücrelerinin dahil.

Giriş

Son on yılda kanser immünoterapi önemli gelişmelere rağmen, duyarlılık ve tedavilere direnç bizim mekanistik anlayış hala oldukça kötü¹. Tümörlerin önemli heterojenite ler gösterdiği ve tümör hücrelerinin mikro çevrelerinin yanı sıra bağışıklık hücreleriyle olan dinamik etkileşimlerinin, etki tümör hücresi ölümü, invaziv davranış ve immünoterapi^1,2,3içeren tedavilere yanıt verdiği iyi belirlenmiştir. Adaptif bağışıklık sisteminin bir kolu olarak, T-hücreleri hücreye özgü sitotoksisite yürütmek. T-hücre tanıma ve kanser hücrelerine yanıt analizi direnç ve bağışıklık modülatör tedavilere duyarlılık içine mekanistik anlayışlar sağlar.

In vitro modelleme ve uygun bir ortamda kanser ve T-hücreleri arasındaki etkileşimleri izleme zorlu olmuştur ve şimdiye kadar, sınırlı mekanistik anlayışlar sonuçlandı. Çoğu hücre tabanlı tahliller iki boyutlu (2D) ortama güveniyor, bu üç boyutlu (3D) in vivo^{fizyolojisi4,5,6,}yani uzamsal hücre etkileşimleri, ekstrasellüler matriks ile temas (ECM)⁷, dinamik metabolik talep, kitle büyüme nedeniyle artan hipoksi^,ve tümör mikroçevre etkileri (TME) 9 özetlemek için kritik olan temel özellikleri^yoksundur9 . Öte yandan, şu anda kullanılan üç boyutlu (3D) co-kültür ve işgal araştırma sistemleri ile eksiklikleri bir dizi hala vardır: (1) küresel nesil ve hasat zaman alıcı doğa^5,10, (2) küresel boyutu üzerinde kontrol eksikliği, şekil ve hücre yoğunluğu^11,12, (3) düşük iş letimat türü tahliller, (4) özel ekipman 13 için gereksinim^13,14, (5) farklı tahliller için ayrı ortamlara ortak kültür aktarmak için ihtiyaç^15,16,17. Özellikle, bir ortak kültür titreşme aktarımı genellikle küresel bozulma ve co-kültür bütünlüğünün kaybına yol açar. Bu özellikle azaltılmış hücre-hücre adezyonu ile "gevşek" küreseller için geçerlidir. Örneğin, en 3D işgali tahlilleri küresel ilk oluşumundan sonra hasat ve daha sonra ECM^14,15,,16resuspended gerektirir. Bu resuspension adım küresel ler arasındaki mesafe üzerinde kontrol kaybına neden. Tümör spheroidleri arasındaki mesafe invaziv davranışlarını etkilediğiiçin, bu kontrol kaybı yüksek ara elekt varyans ayarı sağlar ve tekrarlanabilirliği azaltır. Ayrıca, periferik ve tümör sferoid infiltrasyon bağışıklık hücrelerinin değerlendirilmesi için ardışık santrifüj adımları ile hücre fraksiyonu tahlilleri uygulaması daha istikrarlı sferoidler oluşturmak tümör hücre popülasyonları ile sınırlıdır¹⁷.

Kavram ve yaklaşım

Yaklaşımımız, daha sonraki tahliller için küresel lerin transferini gerektirmeyen 3D spheroid ortak kültür modeli olan "Hepsi Bir Arada"— 3D spheroid eş kültür modelini kullanarak yukarıda belirtilen eksiklikleri gidermektedir. Kanser hücrelerinin invaziv davranışlarını ve eş kültürlü T hücrelerinin sitotoksisitesini eş zamanlı olarak izlemek için bir küresel oluşum cihazı (Bkz. Malzemeler Tablosu)uyarladık. Bu yöntem kullanıcı dostu, ucuz dur ve nispeten yüksek işlemli 3B ayarında hızlı ve kolay kullanım sağlar. Kullanılan cihazın türüne bağlı olarak, 81'e kadar büyük düzgün boyutlu sferoidler, tohumlanan hücre sayısını değiştirerek tek bir borulama adımında tek bir küresel boyut üzerinde kontrol ile oluşturulabilir. Sheroid oluşumu U şekilli dipleri ile iskele içermeyen agarose çok iyi dökümlerde gelişmiş hücre-hücre etkileşimleri tarafından zorlanır. Bu 3D sistemi dinamik hücre tabanlı fonksiyonel çalışmaların yanı sıra floresan aktif hücre ayrıştırma (FACS), immünororesans (IF) veya immünohistokimya (IHC) boyama ve bozulmamış 3B ortak kültürün gen ekspresyonu analizini içeren son nokta moleküler ve biyokimyasal tahliller için uyarladık.

Fonksiyonel çalışmalariçin, agarose içinde tip I kollajen katıştırma küresel ler eşit uzak küresel kanser hücrelerinin işgali ile sonuçlanır ve temel hücre hattı özgü özellikleri izleme izin verir, tek hücre vs kolektif hücre göçü gibi^18,19. Ayrıca, kollajen matris kolayca agarose döküm ayrılır, birden fazla spheroidler içeren bir 1\u20122 mm kalınlığında yama ile sonuçlanan, daha fazla if boyama ve konfokal mikroskopi ile görüntüleme için işlenebilir. Bu, yüksek işlemli bir taramada farklı hücre istilası ve hücre-matris etkileşimlerini ortaya çıkarabilir. Ayrıca, kollajen matris hücreleri kollajen sindirim ve sonraki hücre ekimi veya analizi için tek hücreli ayrışma sonra izole edilebilir.

Spheroidlerin IHC analiziiçin, agarose döküm fiksasyonu ve kesitinden sonra, proteinler veya diğer ilgi molekülleri spheroidlerin coğrafi konumlarını korurken tespit edilebilir. Burada açıklanan yaklaşımda, küreseloidler doğrudan agarose döküm içinde Hidroksietil agarose işleme jel gömülü ve jel mikrowells altındaki küreseloidler korumak için bir "kapak" olarak hizmet vermektedir. Agarose döküm parafin gömme sonra²⁰, seri yatay kesit başlangıç noktası olarak hizmet veren döküm alt ile yapılır.

Bu yaklaşım, Hidroksietil agarose işleme^{jeli 21'e} gömmeden önce hücrelerin hasatını gerektiren küresel lerin konvansiyonel IHC kesiti ile tezat oluşturur ve böylece hücrelerin uzamsal düzenini kaybederek küreseloidlerin bozulması riski taşır. Ayrıca, bağışıklık hücrelerinin infiltrasyon veya tümör sferoidler¹⁷ periferik kaldı olup olmadığını değerlendirmek için santrifüj ile hücre fraksiyonu doğrudan katıştırma ile önlenir.

Ayrıca, 3D co-kültür tümör, stromal veya bağışıklık hücreleri admixing ve böylece tümör hücre crosstalk çalışma veya endotel hücreleri ile co-kültürleri de dahil olmak üzere hücre-hücre etkileşimleri analiz etmek için farklı tümör mikroortamları recapitulating yapılabilir¹⁶.

Bu 3D küresel ortak kültür ayarı tümör mikroortamında bulunan farklı hücre tiplerinin ortak kültürünü gerçekleştirmek ve değiştirilmiş ECM elementlerinin etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. Tip I kollajen yanı sıra, diğer ECM bileşenleri (örneğin, matrigel, matrigel / kollajen karışımları, fibronektin), tümör hücre invazyonu farklı substratların bolluğu etkilenir beri kullanılabilir²². Ayrıca, agarose döküm mikrowellleri primer hücre hatlarının küresel oluşumu ve düşük hücre-hücre adezyonu olan hücreler için uygundur.

Protokol

Protokol boyunca sık kullanılan bazı sözcüklerin listesi ve açıklaması Ek Dosya 1'debulunabilir.

1. Küresel nesil

1. Hazırlamak ve otoklav 2% agarose 1x PBS (örneğin, 1 g agarose 50 mL 1x PBS) ve otoklav 35- ve 81-microwell kauçuk kalıplar.
   DİkKAT: IHC işleme için agarose dökümleri üretmek için düşük eriyen agarose kullanmaktan kaçının.
2. Agarose dökümleri hazırlayın
   NOT: 35-microwell dökümleri invazyon, immünoresans (IF) ve hücre izolasyonu tahlilleri için kullanılır. 81-microwell dökümler sitotoksisite, immünohistokimya (IHC), hücre izolasyonu ve RNA ekstraksiyon testleri için kullanılır.
   1. Agarose otoklavladıktan sonra erimiş agarose yaklaşık 60\u201270 °C'ye kadar soğumaya bırakın. Hücre kültürü başlığında, aseptik teknik ve pipet 500 μL erimiş agarose'u kuyu başına 81 mikrokuyu kauçuk kalıba veya kuyu başına 35 mikrokuyu kauçuk kalıbına 330°L'lik bir kalıp haline getirin.
      DİkKAT: Agarose'u karıştırırken veya borularken kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Yavaşça pipetting tarafından herhangi bir kabarcıklar çıkarın.
   2. Agarose katılaştırıladıktan sonra, kauçuk kalıbı dikkatlice esneterek agarose dökümünden çıkar. Bu vesileyle, uygun iyi plaka üzerinde ellerinizi yerleştirin ve agarose döküm iyi plaka bir kuyu içine doğru damla sağlar.
      NOT: Kauçuk kalıbı esnemekten kaçınmak için farklı konumlarda esnetin. Kauçuk kalıbı esnetip aynı anda alttan hafifçe itmek yararlı olabilir.
   3. Agarose dökümlerini dengelemek için, %10 fetal sığır serumu (12 kuyulu plaka için 2,5 mL/iyi ve 24 kuyulu plaka için 1 mL/iyi) ile desteklenen DMEM'den oluşan hücre kültürü ortamı ekleyin. İyi plakayı bir hücre kültürü kuluçka makinesine (37 °C, %5 CO₂₎koyun ve 1 saat kuluçkaya yatırın.
3. Bu arada, tohumlama için hücre kültürü hazırlamak.
   NOT: Agarose döküm başına toplam hücre tohumlama sayısı araştırmacı tarafından karar verilecektir. Murine primer pankreas kanseri hücre hatları için, 35.000 hücre/35-microwell döküm ve 81.000 hücre/81-microwell döküm (ortalama 1000 hücre / küresel) tüm aşağıdaki tahliller için tohumlu vardır. Bir küreseloidin ortalama çapı 48 saat sonra yaklaşık 150\u2012200 μm'dir.
4. Agarose dökümunu çevreleyen hücre kültürünü ilk olarak p1000 pipetiyle iyi plakayı yatırarak çıkarın. Daha sonra dikkatlice tohumlama odasında orta çıkarın.
5. Dikkatle hazırlanan tümör hücre süspansiyon damla-hücre tohumlama odasına tohum. İyi plakayı 15 dakika boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine (37 °C, %5 CO₂₎dikkatlice koyun.
   NOT: Bu adımda hücreler agarose döküm mikrowells içine yerleşecektir.
6. Agarose döküm (2.5 mL / iyi 12-iyi plaka ve 1 mL / iyi 24-well plaka için) dışında ek orta ekleyin.
7. 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine (37 °C, %5 CO₂₎iyi plakayı geri koyun.
   NOT: Genellikle hücrelerin mikrowelllerde küresel olarak oluşması birkaç saat kadar sürer. Genel olarak solid tümör hücreli küresel ler 24 saat sonra oluşur ve 48 saat sonra stabildir. Ancak, bu farklı hücre satırları arasında değişebilir. Gerekirse, agarose dökümleri ile iyi plakayı dikkatlice yatırarak ve p1000 pipetile çevredeki hücre kültürü ortamını kaldırarak hücre kültür ortamını değiştirin. Sonra dikkatle kuyunun duvar boyunca borulama tarafından taze orta ekleyin. Genellikle küçük hacim ve küresel kaldırma riski nedeniyle dökümleri içinde medya değiştirmek için gerekli değildir.

2. T-hücreleri ile ortak kültür

1. 75 μL (35-microwell cast) veya 190 μL (81-microwell cast) içinde gerekli T-hücrelerinin uygun T-hücre kültür ortamı (RPMI% 10 fetal sığır serum ve 100 adet/ mL penisilin / streptomisin ile desteklenmektedir) resuspend.
2. Agarose dökümunu çevreleyen hücre kültürünü ilk olarak p1000 pipetiyle iyi plakayı yatırarak çıkarın. Daha sonra, iyi plakayı diğer elinizle eğik tutarken, tohumlama odasının bir köşesini P200 pipetiyle hafifçe hedefleyerek döküm içindeki ortamı yavaşça çıkarın.
3. (Kritik adım 1) Küresel lerin giderilmesi riski olduğu için, mikrowells içindeki küreseloid lerin sayısını 10x büyütmede mikroskop altında görüntüleyerek ve çıkardıktan sonra karşılaştırarak küresel oidlerin kaybını kontrol edin.
4. Dikkatle t-hücre süspansiyon damla akıllıca agarose döküm tohumlama odasına yaklaşık 0,5 cm üzerinde P200 pipet tutarak tohum.
5. (Kritik adım 2) T-hücreleri eklerken küresel sifret dışarı floş riski vardır. Bu nedenle, T-hücrelerini çok yavaş ve tohumlama odasının yaklaşık 0,5 cm yukarısına eklemek çok önemlidir.
   NOT: Sifonlanmış küresel lerin sayısını azaltmanın bir olasılığı, pipetin t-hücrelerini eklerken tohumlama odasının bir köşesine işaret etmesidir, böylece sadece bu köşedeki küresellerin dışarı atılması riski vardır.
6. İyi plakayı 15 dakika boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine (37 °C, %5 CO₂₎dikkatlice yerleştirin.
7. Kuvözden iyi plakayı alın ve taze hücre kültürü ortamını (RPMI %10 fetal sığır serumu ve 100 adet/mL penisilin/streptomisin ile desteklenir) yavaşça kuyunun duvarı boyunca borulandırarak agarose'un etrafına ekleyin.
8. 48 saat boyuncahücre kültürü kuluçka içine iyi plaka geri koyun.

3. Tip I kollajen matris içine 3D co-kültür gömme

1. Nötralize tip I kollajen hazırlayın
   1. Serum serbest baz orta (RPMI) ile stok kollajeni 3 mg/mL'lik son çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Seyreltilmiş kollajenin her 100 μL'si için 11 μL 10x PBS ve 1,2 μL 1 M sodyum hidroksit (NaOH) ekleyin.
   2. 1 saat boyunca buz ve inkübat (nötralize) tutun.
2. Agarose dökümunu çevreleyen hücre kültürünü ilk olarak p1000 pipetiyle iyi plakayı yatırarak çıkarın. Daha sonra, iyi plaka diğer el ile eğik tutarken yavaşça bir P200 pipet ile tohumlama odasının bir köşesinde hedefleyerek döküm içinde orta çıkarın.
   NOT: Burada agarose döküm çevreleyen hücre kültürü ortamı tamamen kaldırmak için önemlidir.
3. Dikkatle nötralize kollajen Ben döküm yaklaşık 0,5 cm üzerinde P200 pipet tutarak agarose döküm tohumlama odasına damla-akıllıca karıştırın.
4. 4 dakika (35-microwell döküm) veya 5 dakika (81-microwell döküm) için hücre kültürü kuluçka içine hemen iyi plaka koyun.
   DİkKAT: (Kritik adım 3) Verilen kuluçka süresine sıkı sıkıya bağlı kalmak çok önemlidir. Aksi takdirde, invaziv davranış tekrarlanabilir olmayabilir.
5. Iyi plaka ters ve 1 saat için kuvöz de çevrilmiş bırakın.
   NOT: Dökümler yüzey gerilimi nedeniyle iyi plakanın altına bağlı kalacaktır. Yüksek serum konsantrasyonu olan özel hücre kültürü ortamının (örneğin, %20 fetal sığır serumu ile desteklenen RPMI) kullanılması durumunda, kuyudaki ortamı çıkardıktan sonra 1x PBS ile ek bir yıkama adımı yüzey gerilimini artırmak için gerekli olabilir.
6. Kuyu plakasını kuvözden çıkar ve ters çevir. Taze hücre kültürü orta ekleyin (RPMI ile takviye 10% fetal sığır serum ve 100 adet / mL penisilin / streptomisin) agarose döküm etrafında yavaş yavaş kuyunun duvar boyunca borulama tarafından.
7. Kuyu plakasını 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri koyun.

4. Sitotoksisite töz

1. Agarose döküm başına% 2 fetal sığır serumu ile 1x PBS 3 mL hazırlayın.
2. 4 d için ortak kültür sonra, diğer el ile biraz iyi plaka tilting tarafından bir P1000 pipet ile agarose döküm çevreleyen hücre kültürü orta kaldırın.
   NOT: Ortak kültürün toplam süresi araştırmacı tarafından belirlenecektir.
3. Mikrokuyulardan küresel leri çıkarmak için 1 mL 1x PBS + %2 FBS p1000 pipetle tohumlama odasına dağıtın.
4. 4.3 adımını kuyudaki hacimle iki kez tekrarlayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
5. Tüpü oda sıcaklığında (RT) 10 s'ye 300 x g'de santrifüj edin.
6. P1000 pipetli süpernatantı dikkatlice çıkarın.
7. Hücreleri 1 mL 1x PBS ile %2 FBS ve 300 x g'de 300 x g'lık santrifüj ekleyerek RT'de 1 dakika yıkayın.
8. Yıkama adımını tekrarlayın (adım 4.7).
9. Supernatant çıkarın ve hücre dissosyasyon enzimleri çözeltisi 1 mL ekleyin (Malzemeler Tablosubakınız).
10. Hücre kümelerini kırmak için p200 pipet ve pipet kullanın.
11. Hücre kültürü kuluçka makinesinde hücreleri 20 dakika kuluçkaya yatırın (37 °C, %5 CO_2).
12. Adımı 4.10'u tekrarlayın.
    NOT: ~10 μL'yi çıkarın ve bir hücre kültürü çanağının üzerine tohum atın ve (10x büyütmede mikroskop altında) küresel lerin tek hücrelerde ne kadar iyi ayrıştırdığını gözlemleyin. Gerekirse, daha fazla kuluçka 5 dk ekleyin.
13. 4 mL tam hücre kültürü ortamı (RPMI %10 fetal sığır serumu ve 100 ünite/mL penisilin/streptomisin ile desteklenir) ekleyin ve tüpü ters çevirerek karıştırın 3\u20124 kez.
14. RT 4 dk için 400 x g santrifüj.
15. Apoptotik hücrelerin Annexin V boyama için FACS tampon hücreleri askıya ve supernatant çıkarın.
    NOT: Buradan herhangi bir FACS boyama ve hücre analizi yapılabilir.

5. IHC kesitiçin hidroksitil agarose işleme jeli gömme

NOT: Burada agarose dökümleri üretmek için düşük eriyen agarose kullanmaktan kaçınmak önemlidir.

1. Ortak kültürün sonunda, iyi plakayı yatırarak önce p1000 pipetiyle agarose dökümünün etrafındaki hücre kültürünü çıkarın. Daha sonra, iyi plakayı diğer elinizle eğik tutarken, tohumlama odasının bir köşesini P200 pipetiyle hafifçe hedefleyerek döküm içindeki ortamı yavaşça çıkarın.
2. Yavaş yavaş pipet% 10 formalin tohumlama odasında ilk hafifçe p200 pipet ile tohumlama odasının bir köşesinde hedefleyerek. Daha sonra tamamen kapsanakadar agarose döküm dışında% 10 formalin ekleyin. 1 d için% 10 formalin agarose döküm düzeltin.
3. Ertesi gün formalini çıkarın.
4. Dikkatle pipet 210 μL (81-microwell döküm) veya 100 μL (35-microwell döküm) önceden ısıtılmış ve sıvılaştırılmış hidroksietil agarose işleme jeli (Malzemeler Tablosubakınız) damla akıllıca döküm yaklaşık 0,5 cm üzerinde P200 pipet tutarak agarose döküm tohumlama odasına akıllıca.
5. Hidroksitil agarose işleme jeli RT'de 10 dakika katılamasına izin verin.
6. Agarose döküm1x PBS aktarın.
   NOT: Daha uzun depolama için, kontaminasyonu önlemek için dökmeyi %70 etanolle gömün.
7. Jel bölümlerini bir etanol serisi ile dehydrate (1 saat her biri: 70% etanol, 80% etanol, 95% etanol, 100% etanol [3x her değiştirir]). Daha sonra her biri 1 saat için 3x'lik bir temizleme çözeltisinde (örn. aliphatic hidrokarbonlar [örn. Clearite] veya ksilenes) ve erimiş parafin (her biri için 1 saat için 3x), elle veya bir doku işleyicisinde sızın. Sonraki bölümleme için alçıyı her bölüm 5 μm'ye parafin balmumuna gömün.
8. Ksilenler slaytlar koyarak balmumu çıkarın, 3 dakika her için 3 x, sonra bir dereceli alkol serisi ile doku bölümleri rehydrate: 100% etanol 2 dakika için, 1 dakika için% 95 etanol, 30 s için% 80 etanol ve 30 s için% 70 etanol, sonra suda yer.
9. 100 °C'de bir sebze vapurunda 20 dakika boyunca ısıkaynaklı epitop alma gerçekleştirin, ardından 10 mM sodyum sitrat pH 6.0 çözeltisinde 20 dk soğuma ve H₂O₂ile endojen peroksidazları bloke edin.
10. Normal hedef serum ile bölümleri bloke ve anti-CD8 antikor (seyreltme 1/25) bir gecede maruz.
11. Anti-tavşan-HRP konjuge ikincil antikorlar uygulayın (Malzeme Tablosubakınız) ve 3,3'-Diaminobenzidin kullanarak boyama geliştirmek (DAB) kromatin. %11 Harris hematoksilin çözeltisi ile karşı leke çekirdekleri (Bkz. Malzeme Tablosu).

6. Ortak kültürde küresel istilanın izlenmesi ve analiz edilmesi

NOT: Kollajen I matrisine küresel oid invazyonunun görüntülenmesinin zaman noktası araştırmacı tarafından belirlenecektir. 10x büyütme ile ters bir mikroskop kullanarak hücre kültürü görüntüleri elde edin. İdeal zaman noktası, test edilen hücre çizgisine ve ECM bileşenine bağlıdır. Daha invaziv hücre hatları kollajen ekledikten sonra birkaç saat içinde kollajen içine yayılmaya başlayacak. Ortak kültürdeki T-hücreleri çok erken zaman noktalarında küresellerden çıkışın tam görünümünü engelleyebileceğinden, genellikle kollajen iekledikten sonra 0 saat (referans olarak), 24 saat ve 48 saat olarak görüntüler alınır.

1. Sferoidden çıkan "sivri" sayısını elle sayarak ve/veya görüntü analiz yazılımı kullanarak invazivliği ölçün, örneğin Image J.
   1. Bir küresel "sivri" sayısını el ile sayarak küresel "sivri" sayısı olarak işgali analiz.
      NOT: Fheroidlerden çıkan çıkıntıların "sivri" olarak kabul edildiğine araştırmacı tarafından karar verebilmekgerekir. Bir karar kriteri küresel kenarına ölçülen "başak" uzunluğu olabilir.
   2. İstilayı küresel boyutuna göre istila alanı olarak analiz edin.
      1. Toplam alanın (istila + küresel alan) kenarlığı izlemek için Freehand Draw Aracını (Resim J) kullanın.
      2. Üst menüde Analiz et'i tıklatın ve ardından alan ölçümlerini görüntülemek için Ölçü'yü tıklatın.
      3. Toplam küresel alanın sınırını takip edin.
      4. Üst menüde Analiz et'i tıklatın ve ardından alan ölçümlerini görüntülemek için Ölçü'yü tıklatın.
      5. Ölçülen sonuç listesini bir elektronik tabloya kopyalayın ve formülü kullanarak toplam istila/küresel liği hesaplayın: toplam invazyon = toplam alan/küresel alan.

7. İmmünofluoresans boyama

1. Aşağıdakileri hazırlayın.
   1. 2,3 mL 1x PBS ve 2,7 mL %10 formalin kullanarak %5,4 formalin (5 mL) hazırlayın.
   2. 1x PBS'in 50 mL'si ve %10 Octoxynol'un 2,5 mL'si (RT'de depo) kullanılarak %0,5 Okoksinol (50 mL) hazırlayın.
   3. 200 mL 1x PBS, 200 mg büyükbaş serum albumin (BSA), 4 mL %10 Okoksinol, 1 mL %10 polisorbat 20 (kullanmadan önce RT'ye kadar ısın; filtre ve 4 °C'de saklayın) kullanarak IF Tamponu (200 mL) hazırlayın.
   4. 5 mL IF Tampon ve 500 μL keçi serumu kullanarak blokaj çözeltisini (5 mL) hazırlayın (kullanmadan önce RT'ye kadar ısıtın).
   5. 8 kuyulu oda slaytlarını, cam kapakları ve montaj ortamını hazır tutun.
2. Gün 0
   1. Tüm agarose döküm sabit, küresel ler de dahil olmak üzere, bir gecede 5.4% formalin RT nemli bir odada.
3. 1. Gün
   1. Agarose dökümunu çevreleyen hücre kültürünü p1000 pipetiyle iyi plakayı yatırarak çıkarın.
   2. Kollajen yamasını, agarose dökümünün tohumlama odası içindeki kollajen matrisin bir köşesini şık sivri uçlu cımbızlarla kavrayarak 8 kuyulu bir odaya aktarın ve tek, kendinden emin bir hareketle agarose dökümünden soyun.
      NOT: Kollajen yama kolayca agarose döküm ayrılmalıdır. Aksi takdirde, dikkatle tohumlama odası alanında kültür ortamı eklemek veya agarose döküm ters ve yavaşça kollajen matris çıkarmak için iyi plaka sallamak için bir P1000 pipet kullanın.
   3. Kuyu başına %0,5 Octoxynol (Bkz. Malzeme Tablosu)250 μL ekleyin. RT'de 1 saat kuluçka.
   4. Octoxynol aspire ve kuyu başına engelleme çözeltisi 250 μL ekleyin. RT'de 1 saat boyunca blok.
   5. Bu arada, birincil antikor seyreltmek (anti-keratin için seyreltme 8: 1/500; Phalloidin 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) bloklama çözeltisi, iyi başına 250 μL için hesaplanması.
   6. Engelleme çözeltisinde birincil antikor ekleyin ve oda kaydırasını RT'de bir gecede kuluçka için nemli bir odaya yerleştirin.
4. 2. Gün
   1. Aspirating tarafından engelleme çözeltisi birincil antikor çıkarın.
   2. 300 μL IF Tampon ekleyerek 3 kez yıkayın ve RT'de 5 dakika boyunca oturun.
      NOT: Sadece oturalım, bir shaker üzerine koymak için gerek yoktur.
   3. Bloklama çözeltisinde sekonder antikor seyreltin (anti-keratin 8 için: anti-sıçan, seyreltme 1/500).
   4. Her kuyuya bloklama çözeltisine 250 μL ikincil antikor ekleyin ve RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın. Şu andan itibaren, örnekleri ışıktan koruyun.
   5. Aspirating tarafından engelleme çözeltisi ikincil antikor çıkarın.
   6. 300 μL IF Tampon ekleyerek 3 kez yıkayın ve RT'de 5 dakika boyunca oturun.
   7. Örnekleri 1x PBS ile durulayıp aspire edin.
   8. Oda kaydırağının duvarlarını dikkatlice çıkarın, böylece alttaki cam kaydırak kalır.
   9. Cam bir kapak kaymasına en az 200 μL montaj ortamı ekleyin ve kapağı numunenin üzerine yavaşça bırakın.
      NOT: Bu görüntü kalitesini etkileyecek gibi kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Kabarcıklar, kapağın kapağını sakaya niçin 45° açıyla hafifçe yerleştirerek veya slayttaki kapak kaymasını yavaşça indirerek önlenebilir.
   10. Monte edilmiş numuneleri karanlık ve kuru bir yere koyun ve bir gecede oturtun. Görüntüleme ertesi gün yapılabilir.
       NOT: Kapak, kollajen yasının üzerine yerleştirildikten sonra başlangıçta biraz kayabilir. Cam slayt birkaç dakika için eşit bir alanda oturup sağlar. Kapak, cam kaydırak ile coverslip arasında zaman içinde boşluk kalmayacak şekilde numuneyi düzleştirmekolacaktır.

8. Kollajen matrishücrelerin izolasyon

1. Aşağıdakileri hazırlayın.
   1. Serum içeren hücre kültürü ortasında 1 mg/mL kollajenaz 4 hazırlayın (-20 °C'de saklayın aliquoted kollajenaz 4 seyreltmeler)
   2. 1x PBS'de %2,5 BSA hazırlayın ve tüm tüpleri ve pipet uçlarını onunla kaplayın (kullanmadan önce BSA çözümünü filtreleyin).
   3. Kullanmadan önce BSA çözeltisini ve hücre kültürü ortamını önceden ısıtın.
2. 35 mikrokuyu agarose kalıbından maksimum üç kollajen matrisi sindirmek için 2 mL kollajenaz 4 çözeltisi (1 mg/mL) hazırlayın.
3. 35 mikrokuyu agarose dökümlerinden üç tane 75°L kollajen matrisi %2,5 BSA önceden kaplanmış 15 mL tüpe aktarın. Şık sivri uçlu cımbız ile agarose döküm tohumlama odası içinde kollajen matris bir köşe kavramak ve tek bir, kendinden emin hareket le agarose döküm soyma.
4. Makasla bir P1000 ucunun ucunu kesin. Kalan ucu %2,5 BSA ile ön katlayın ve kollajen matrisi yukarı ve aşağı borular oluşturarak mümkün olduğunca parçalayın. Tüpü 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
5. (Kritik adım 4) Her 5 dakikada bir kollajen matrisin inip çözülmediğini kontrol edin. Pipet, numunenin 10 μL'sini çıkarmadan önce tekrar yukarı ve aşağı, 10x büyütmede mikroskop altında gözlemlemek için hücre kültürü çanağının üzerine tohumlar. Gerekirse 5 dk daha ekleyin.
6. Tüpü önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamının 10 mL'si (DMEM %10 fetal büyükbaş serumile desteklenmiş) doldurun. Tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın 3\u20124 kez.
7. 400 x g'de tüpü RT'de 4 dk santrifüj edin.
8. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve 2 mL hacim bırakın.
9. (Kritik adım 5) İlk santrifüj adımından sonra 2 mL bırakın, çünkü hala tüplerin alt kısmında çözünmemiş kollajen olabilir.
10. Her seferinde 10 mL serum içeren hücre kültürü ortamı ekleyerek iki yıkama adımı gerçekleştirin. Rt 4 dakika için 400 x g her zaman santrifüj.
11. Son yıkama adımından sonra, mümkün olduğunca çok orta çıkarın ve sadece hücre pelet bırakın.
12. Hücre dissosyonu enzimleri çözeltisinin 1 mL'sinde hücre peletini yeniden askıya alın (Bkz. Malzeme Tablosu).
13. Hücre kümelerini kırmak için p200 pipet ve pipet kullanın.
14. Hücre kültürü kuluçka makinesinde hücreleri 20 dakika kuluçkaya yatırın (37 °C, %5 CO_2).
15. Adımı 8.13'te tekrarlayın.
    NOT: Spheroidlerin tek hücrelere ne kadar iyi ayrıştırDığını görmek için 10x büyütmede mikroskop altında gözlemlemek için ~10 μL'yi çıkarıp bir hücre kültürü çanağının üzerine tohum atın. Gerekirse, daha fazla kuluçka 5 dk ekleyin.
16. Hücre kültürü ortamının 4 mL'sini (%10 fetal sığır serumu ile desteklenen DMEM) ekleyin ve tüpü ters çevirerek karıştırın 3\u20124 kez.
17. RT 4 dk için 400 x g santrifüj.
18. Supernatant çıkarın. Buradan itibaren FACS boyama veya hücre kültürü yapılabilir.

9. Kollajen matrisinden RNA çıkarma

1. Fenol ile guanidinium tiyosiyanat hazırlayın (Malzemeler Tablosubakınız), 100% kloroform, 70% RNase-free etanol, RNA ekstraksiyon kiti (Malzemeler Tablosubakınız), RNase içermeyen 1.5 mL tüpler, RNase-free 15 mL tüpler ve RNase-free ddH₂O.
2. 81 mikrokuyu agarose'dan 12 190 μL'ye kadar kollajen matrisi 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Şık sivri uçlu cımbız ile agarose döküm tohumlama odası içinde kollajen matris bir köşe kavramak ve tek bir, kendinden emin hareket le agarose döküm soyma.
   NOT: Matrisler RNA ekstraksiyonu hazır olana kadar -80 °C'de de dondurulabilir.
3. 15 mL tüpteki kollajen matrislere fenol ile 1 mL guanidinium tiyosiyanat ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: Fenol ile guanidinium tiyosiyanat tamamen kollajen matrisler kapsayacak şekilde olmalıdır.
4. Girdap 10\u201220 s için tüpler.
5. Matrisleri 20 G iğne ve 5 mL şırınga ile tamamen eriyene kadar homojenize edin.
6. Matrisler RT 5 dakika oturup sağlar.
7. Matrislere 200 μL saf kloroform ekleyin ve tüpü 15 s boyunca şiddetle sallayın.
8. Karışımı hemen 1,5 mL tüplere aktarın.
9. Karışım, evreler ayrılana kadar RT'de en az 5 dakika otursun.
10. 1.5 mL'lik tüpleri 12.000 x g'de 15 dakika 4 °C'de santrifüj edin.
11. Yeni bir 1,5 mL'lik tüpü %70 etanol500 μL ile doldurun.
    NOT: Santrifüj sonrası sulu fazın hacmine bağlı olarak (bkz. adım 9.12. bu 500 μL olmayabilir. % 70 etanol miktarı sulu faz hacmine eşit olmalıdır.
12. Santrifüjlü numunelerin üst sulu fazını %70 etanol dolu tüpe dikkatlice aktarın ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın.
13. (Kritik adım 6) Üst fazı çıkarırken guanidinium tiyosiyanatın altındaki tabakaları fenol ayrımı ile rahatsız etmemeye dikkat edin, çünkü bu RNA'yı kirletecektir.
14. Örneği bir RNA çıkarma sütununa ekleyin (RNA ekstraksiyon kitine dahil edilmiştir, bkz. Malzeme Tablosu). Şu andan itibaren, hücrelerin RNA saflaştırılması için üreticinin protokolünü izleyin.

Sonuçlar

3B ortak kültür modeli, Şekil 1A'dagösterilen ve gerektiğinde birleştirilebilen veya değiştirilebilen farklı tahliller sağlar. Yerleşik deneysel kurulumumuzda tümör ve T-hücreleri 2 gün boyunca birlikte kültürlenir ve invaziv ve/veya dirençli tümör hücrelerinin seçimi için invaziv tayini başlatılması nı takip eder(Şekil 1B). 4. günde invazyonun nicelliği gerçekleştirilir ve "kurtulan" hücreler kollajen matrisinden izole edilir ve...

Tartışmalar

Burada sunulan yöntem, T-hücreleri, hücre bazlı fonksiyonel ve moleküler tahliller ile ortak kültür ve tek bir cihaz kullanarak izleme ve analiz olanakları çeşitli sağlar 3D tümör sfüzyon, açıklar. Yaklaşımımızın en büyük avantajı, 3B kültürünün ayrı bir tahlile aktarılmasını gerektirmemesi ve tahliller boyunca 3B kültürünün bütünlüğünü korumasıdır.

Burada sunulan iş akışı gerektiği gibi değiştirilebilir. Küresel formasyon, T-hücre ko-kült?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Petri Dishes	Microtissues Inc	Z764019 & Z764051	referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides	Lab-Tek	154534
Agarose Type I, low EEO	Sigma-Aldrich	A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody	Agilent	K4003	ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg	Millipore	08-115
Collagenase Type 4, 1 g	Worthington	LS004188
DMEM, fetal bovine serum	ThermoFisher	11965092, 16000044	referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin	ThermoFisher	SH30-500D
HistoGel	ThermoFisher	HG-4000-012	referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst	Life Technologies	H1399	1/1000 dilution
Phalloidin 546	Invitrogen	486624	1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody	Cell Signaling	98941	1/25 dilution
rat anti-keratin 8	DSHB	TROMA-I AB_531826	1/500 dilution
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI	ThermoFisher	11875093	for T-cell culture medium
Triton X-100	BioRad	1610407	referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol	ThermoFisher	15596026	referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE	ThermoFisher	12604013	referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols