Surveillance de l’invasion des cellules cancéreuses et de la cytotoxicité des lymphocytes T dans la culture 3D

Résumé

L’approche présentée évalue simultanément l’invasion de cellules cancéreuses dans les essais sphéroïdes 3D et la cytotoxicité de cellule T. Les sphéroïdes sont générés dans un jet de multi-microwell sans échafaudage. La co-culture et l’intégration dans la matrice de collagène de type I sont effectuées dans le même dispositif qui permet de surveiller l’invasion des cellules cancéreuses et la cytotoxicité médiée par cellules T.

Résumé

Des progrès significatifs ont été réalisés dans le traitement du cancer par immunothérapie, bien qu’un grand nombre de cancers restent résistants au traitement. Un nombre limité d’essais permettent une surveillance directe et des connaissances mécanistes sur les interactions entre les cellules tumorales et immunitaires, parmi lesquelles les lymphocytes T jouent un rôle important dans l’exécution de la réponse cytotoxique du système immunitaire adaptatif aux cellules cancéreuses. La plupart des tests sont basés sur la co-culture bidimensionnelle (2D) des cellules en raison de la facilité relative d’utilisation, mais avec une représentation limitée du phénotype de croissance invasive, l’une des caractéristiques des cellules cancéreuses. Les systèmes actuels de coculture tridimensionnelle (3D) nécessitent soit un équipement spécial, soit une surveillance distincte de l’invasion des cellules cancéreuses coculturées et des lymphocytes T en interaction.

Ici, nous décrivons une approche pour surveiller simultanément le comportement invasif en 3D des sphéroïdes de cellules cancéreuses et de cytotoxicité de cellule T dans la co-culture. La formation de sphéroïdes est entraînée par des interactions cellulaires améliorées dans les moulages de microwell agarose sans échafaudage avec des fonds en forme de U. La co-culture des lymphocytes T et l’invasion des cellules cancéreuses dans la matrice de collagène de type I sont effectuées dans les micro-puits des moulages d’agarose sans avoir besoin de transférer les cellules, maintenant ainsi un système de co-culture 3D intact tout au long de l’essai. La matrice de collagène peut être séparée de la fonte d’agarose, permettant la coloration d’immunofluorescence (IF) et pour l’imagerie confocale des cellules. En outre, les cellules peuvent être isolées pour une croissance ultérieure ou soumises à des analyses telles que l’expression des gènes ou le tri des cellules activées par fluorescence (FACS). Enfin, la co-culture 3D peut être analysée par immunohistorichemistry (IHC) après l’intégration et la sectionnement. Les modifications possibles de l’essai incluent des compositions modifiées de la matrice extracellulaire (ECM) ainsi que l’inclusion de différentes cellules stromales ou immunitaires avec les cellules cancéreuses.

Introduction

Malgré des améliorations significatives dans l’immunothérapie contre le cancer au cours de la dernière décennie, notre compréhension mécaniste de la sensibilité et la résistance aux traitements sont encore assez pauvres¹. Il est bien établi que les tumeurs affichent une hétérogénéité substantielle, et que les interactions dynamiques des cellules tumorales avec leur microenvironnement ainsi qu’avec les cellules immunitaires, la mort des cellules tumorales d’impact, le comportement invasif et la réponse aux traitements qui incluent l’immunothérapie^1,2,3. Comme un bras du système immunitaire adaptatif, les lymphocytes T exécutent la cytotoxicité cellulaire spécifique. L’analyse de la reconnaissance des lymphocytes T et la réponse aux cellules cancéreuses fournit des informations mécanistes sur la résistance et la sensibilité aux traitements modulateurs immunitaires.

La modélisation in vitro et la surveillance des interactions entre le cancer et les lymphocytes T dans un environnement approprié ont été difficiles et, jusqu’à présent, ont donné lieu à des idées mécanistes limitées. La plupart des essais cellulaires reposent sur un environnement bidimensionnel (2D), qui manque de caractéristiques clés essentielles pour la récapitulation de la physiologie in vivo in vivo en trois dimensions (3D) in vivo^4,5,6, à savoir les interactions cellulaires spatiales spatiales, le contact avec la matrice extracellulaire (ECM)⁷, la demande métabolique dynamique, l’hypoxie accrue due à la croissance de masse⁸, et les effets de la micro-environnement tumorale (TME)⁹. D’autre part, il y a encore un certain nombre de lacunes avec les systèmes de co-culture et d’essai tridimensionnels (3D) actuellement utilisés : (1) la nature chronophoïde de la génération et de la récolte^5,10, (2) le manque de contrôle sur la taille sphéroïde, la forme et la densité cellulaire^11,12, (3) les essais de type à faible débit, (4) l’exigence d’équipement spécial^13,14, (5) la nécessité de transférer la co-culture dans des environnements distincts pour différents essais^15,16,17. En particulier, le transfert d’un test de coculture entraîne souvent une perturbation des sphéroïdes et la perte de l’intégrité de la coculture. Cela s’applique en particulier pour les sphéroïdes « lâches » avec adhérence réduite de cellules-cellules. Par exemple, la plupart des essais d’invasion 3D exigent que les sphéroïdes soient récoltés après leur formation initiale, puis réesspensés dans ECM^14,15,16. Cette étape de resuspension entraîne une perte de contrôle sur la distance entre les sphéroïdes. Puisque la distance entre les sphéroïdes de tumeur affecte leur comportement invasif, cette perte de contrôle introduit la variance élevée d’entre-essais et réduit la reproductibilité. En outre, l’application des essais de fractionnement cellulaire par des étapes consécutives de centrifuge pour l’évaluation des cellules immunitaires sphéroïdes périphériques et tumorales est limitée aux populations de cellules tumorales qui génèrent des sphéroïdes plus stables¹⁷.

Concept et approche

Notre approche traite des lacunes mentionnées ci-dessus à l’aide d’un modèle de coculture sphéroïde 3D « Tout-en-un », qui ne nécessite pas le transfert de sphéroïdes pour les essais ultérieurs. Nous avons adapté un dispositif de formation sphéroïde (voir tableau des matériaux)pour générer un test pour surveiller simultanément le comportement invasif des cellules cancéreuses et la cytotoxicité des lymphocytes T co-cultivés. Cette méthode est conviviale, peu coûteuse et permet une manipulation rapide et facile dans un réglage 3D à débit relativement élevé. Selon le type d’appareil utilisé, jusqu’à 81 grands sphéroïdes de taille uniforme peuvent être générés en une seule étape de pipetage avec le contrôle de la taille sphéroïde individuelle en modifiant le nombre de cellules ensemencées. La formation de sphéroïdes est forcée par des interactions cellulaires améliorées dans des fontes multi-puits d’agarose sans échafaudage avec des fonds en forme de U. Nous avons adapté ce système 3D pour des études fonctionnelles dynamiques à base de cellules ainsi que des tests moléculaires et biochimiques de point d’évaluation qui incluent le tri des cellules activées par fluorescence (FACS), l’immunofluorescence (IF) ou l’immunohistorichimie (IHC) ainsi que l’analyse d’expression génique de la co-culture 3D intacte.

Pour les études fonctionnelles, l’intégration des sphéroïdes dans le collagène de type I dans les fontes agarose entraîne l’invasion des cellules cancéreuses à partir de sphéroïdes équidistants et permet de surveiller les caractéristiques essentielles spécifiques à la lignée cellulaire, telles que la migration cellulaire unique par rapport à la migration collective des cellules^18,19. En outre, la matrice de collagène est facilement séparée de la fonte d’agarose, résultant en un patch de 1\u20122 mm d’épaisseur contenant plusieurs sphéroïdes, qui peut être traitée pour la coloration et l’imagerie IF par microscopie confocale. Cela peut révéler l’invasion cellulaire distincte et les interactions cellule-matrice dans un dépistage à haut débit. En outre, les cellules de la matrice de collagène peuvent être isolées après la digestion de collagène et la dissociation de cellules simples pour la culture ou l’analyse suivante de cellules.

Pour l’analyse ihc des sphéroïdes, après fixation et sectionnage de la fonte d’agarose, les protéines ou d’autres molécules d’intérêt sont détectables tout en maintenant les positions géographiques des sphéroïdes. Dans l’approche décrite ici, les sphéroïdes sont directement incorporés dans le gel de traitement de l’agarose hydroxyéthyl dans la fonte d’agarose et le gel sert de « couvercle » pour retenir les sphéroïdes au fond des micro puits. Après l’incorporation de paraffine de la fonte agarose²⁰, sectionnage horizontal série est effectuée avec le bas de la fonte servant de point de départ.

Cette approche contraste avec la sectionnement classique de l’IHC des sphéroïdes qui nécessite la récolte des cellules avant l’incorporation dans le gel de traitement de l’agarose hydroxyéthyle²¹ et risque de perturber les sphéroïdes, perdant ainsi l’arrangement spatial des cellules. En outre, la fractionnement cellulaire par centrifugation pour évaluer si les cellules immunitaires infiltrées ou sont restées périphériques aux sphéroïdes de tumeur¹⁷ est évitée par l’incorporation directe.

En outre, la co-culture 3D peut être effectuée par la tumeur de mélange, les cellules stromales ou immunitaires, et étudiant ainsi le crosstalk de cellules tumorales ou récapitulant différents microenvironnements de tumeur pour analyser des interactions cellule-cellule comprenant des co-cultures avec des cellules endothéliales¹⁶.

Ce réglage de coculture sphéroïde 3D peut être utilisé pour effectuer la co-culture de différents types de cellules présents dans le microenvironnement tumoral et pour évaluer les effets des éléments modifiés d’ECM. Outre le collagène de type I, d’autres composants ECM (p. ex., matrigel, mélanges matrigel/collagène, fibronectine) peuvent être utilisés puisque l’invasion des cellules tumorales est affectée par l’abondance de différents substrats²². En outre, les micro puits de la fonte agarose conviennent à la formation sphéroïde des lignées cellulaires primaires et aux cellules à faible adhérence cellulaire.

Protocole

Une liste et une explication de certains mots fréquemment utilisés tout au long du protocole peuvent être trouvés dans le fichier supplémentaire 1.

1. Génération de sphéroïdes

1. Préparer et autoclave 2% agarose en 1x PBS (par exemple, 1 g d’agarose dans 50 mL de 1x PBS) et autoclave 35- et 81-microwell moules en caoutchouc.
   ATTENTION : Évitez d’utiliser de l’agarose à faible fusion pour produire les moulages d’agarose pour le traitement de l’IHC.
2. Préparer des moulages d’agarose
   REMARQUE : Les moulages de 35 microwells sont utilisés pour l’invasion, l’immunofluorescence (IF) et les tests d’isolement cellulaire. Les moulages de 81 microwells sont utilisés pour la cytotoxicité, l’immunohistorichimie (IHC), l’isolement cellulaire et les tests d’extraction de l’ARN.
   1. Après que l’agarose a été autoclaved, laissez l’agarose fondu refroidir à environ 60\u201270 °C. Dans un capot de culture cellulaire, utilisez la technique aseptique et la pipette 500 μL d’agarose fondue dans un moule en caoutchouc de 81 microwells par puits ou 330 μL dans un moule en caoutchouc de 35 microwells par puits.
      ATTENTION : Évitez de créer des bulles pendant le mélange ou la pipetage de l’agarose. Retirer les bulles en faisant cuire délicatement.
   2. Après que l’agarose est solidifiée, fléchissez soigneusement le moule en caoutchouc pour enlever le plâtre d’agarose de lui. Par la présente, placez les mains au-dessus de la plaque de puits appropriée et laissez la fonte agarose tomber à droite dans un puits de la plaque de puits.
      REMARQUE : Fléchissez le moule en caoutchouc à différentes positions afin d’éviter de trop fléchir. Il pourrait être utile de fléchir le moule en caoutchouc et pousser doucement à partir du fond en même temps.
   3. Pour équilibrer les fontes d’agarose, ajouter le milieu de culture cellulaire, composé de DMEM complété avec 10% de sérum bovin foetal (2,5 mL/bien pour la plaque de 12 puits et 1 mL/bien pour la plaque de 24 puits). Mettre la plaque de puits dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO₂₎et incuber pendant 1 h.
3. Pendant ce temps, préparer la culture cellulaire pour l’ensemencement.
   REMARQUE : Le nombre total d’ensemencements de cellules par fonte d’agarose doit être décidé par l’enquêteur. Pour les lignées cellulaires primaires du cancer du pancréas murine, 35 000 cellules/35 microwells moulées et 81 000 cellules/81 microwell cast (en moyenne 1000 cellules/sphéroïdes) sont ensemencées pour tous les essais suivants. Le diamètre moyen d’un sphéroïde est d’environ 150\u2012200 μm après 48 h.
4. Retirez d’abord le milieu de culture cellulaire entourant la fonte d’agarose avec une pipette P1000 en inclinant la plaque de puits. Retirez ensuite soigneusement le milieu dans la chambre d’ensemencement.
5. Ensemencer soigneusement la suspension de cellules tumorales préparées dans la chambre d’ensemencement cellulaire. Remettre soigneusement la plaque de puits dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO₂) pendant 15 min.
   REMARQUE : Au cours de cette étape, les cellules s’installeront dans les micro puits de la fonte des agaroses.
6. Ajouter un milieu supplémentaire à l’extérieur de la fonte agarose (2,5 mL/bien pour une plaque de 12 puits et 1 mL/bien pour une assiette de 24 puits).
7. Remettre la plaque de puits dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO₂) pendant 48 h.
   REMARQUE : Habituellement, il faut jusqu’à quelques heures pour que les cellules forment des sphéroïdes dans les microwells. En général, les sphéroïdes solides de cellules de tumeur sont formés après 24 h et sont stables après 48 h. Toutefois, cela peut varier d’une ligne cellulaire à l’autre. Si nécessaire, changer le milieu de culture cellulaire en inclinant soigneusement la plaque de puits avec les moulages d’agarose et en enlevant le milieu de culture cellulaire environnant avec une pipette P1000. Ajoutez ensuite soigneusement le milieu frais en le pipeting le long du mur du puits. Habituellement, il n’est pas nécessaire de changer les médias dans les moulages en raison de son petit volume et le risque d’enlever les sphéroïdes.

2. Co-culture avec les lymphocytes T

1. Resuspender le nombre requis de lymphocytes T dans 75 μL (fonte de 35 microwells) ou en 190 μL (81 microwell cast) du milieu approprié de culture de lymphocytes T (RPMI complété par 10 % de sérum bovin fœtal et 100 unités/mL de pénicilline/streptomycine).
2. Retirez d’abord le milieu de culture cellulaire entourant la fonte de l’agarose avec une pipette P1000 en inclinant la plaque de puits. Ensuite, retirez lentement et soigneusement le milieu à l’intérieur du plâtre en ciblant doucement un coin de la chambre d’ensemencement avec une pipette P200 tout en gardant la plaque bien inclinée avec l’autre main.
3. (Étape critique 1) Comme il ya un risque d’enlever les sphéroïdes, le contrôle de la perte de sphéroïdes en comparant le nombre de sphéroïdes dans les micro puits avant et après l’enlèvement du milieu en regardant sous le microscope au grossissement 10x.
4. Ensemencez soigneusement la suspension à cellules T dans la chambre d’ensemencement de l’agarose coulée en tenant la pipette P200 à environ 0,5 cm au-dessus de la fonte.
5. (Étape critique 2) Il y a un risque de rinçage des sphéroïdes tout en ajoutant les lymphocytes T. Par conséquent, il est essentiel d’ajouter les lymphocytes T très lentement et environ 0,5 cm au-dessus de la chambre d’ensemencement.
   REMARQUE : Une possibilité de diminuer le nombre de sphéroïdes rincés est de pointer la pipette vers un coin de la chambre d’ensemencement tout en ajoutant les lymphocytes T, ne risquant ainsi que les sphéroïdes dans ce coin à rincer.
6. Placez soigneusement la plaque de puits dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO₂) pendant 15 min.
7. Sortez la plaque bien de l’incubateur et ajoutez le milieu de culture cellulaire fraîche (RPMI complété par 10% de sérum bovin foetal et 100 unités/mL pénicilline/streptomycine) autour de l’agarose moulée en la canalisant lentement le long de la paroi du puits.
8. Remettre la plaque de puits dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 h.

3. Intégration de la co-culture 3D dans la matrice de collagène de type I

1. Préparer le collagène neutralisé de type I
   1. Diluer le collagène de stock avec le milieu de base sans sérum (RPMI) à une concentration de travail finale de 3 mg/mL. Pour chaque 100 μL de collagène dilué, ajouter 11 μL de 10x PBS et 1,2 μL 1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH).
   2. Garder sur la glace et incuber (neutraliser) pendant 1 h.
2. Retirez d’abord le milieu de culture cellulaire entourant la fonte de l’agarose avec une pipette P1000 en inclinant la plaque de puits. Ensuite, retirez lentement et soigneusement le milieu à l’intérieur du plâtre en ciblant doucement un coin de la chambre d’ensemencement avec une pipette P200 tout en gardant la plaque bien inclinée avec l’autre main.
   REMARQUE : Ici, il est essentiel d’enlever complètement le milieu de culture cellulaire entourant la fonte agarose.
3. Pipette soigneusement le collagène neutralisé que je mélange drop-sage dans la chambre d’ensemencement de l’agarose coulé en tenant la pipette P200 environ 0,5 cm au-dessus de la fonte.
4. Placez la plaque de puits immédiatement dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 4 min (35 microwell cast) ou 5 min (81-microwell cast).
   ATTENTION : (Étape critique 3) Il est essentiel de respecter strictement le temps d’incubation donné. Sinon, le comportement invasif pourrait ne pas être reproductible.
5. Inverser la plaque de puits et la laisser retournée dans l’incubateur pendant 1 h.
   REMARQUE : Les moulages resteront attachés au fond de la plaque de puits en raison de la tension de surface. Dans le cas où un milieu spécial de culture cellulaire avec une concentration sérique élevée (p. ex., RPMI complété par 20% de sérum bovin fœtal) est utilisé, une étape de lavage supplémentaire avec 1x PBS après avoir enlevé le milieu dans le puits pourrait être nécessaire pour augmenter la tension de surface.
6. Retirez le puits de l’incubateur et inversez-le. Ajouter le milieu de culture cellulaire fraîche (RPMI complété par 10% de sérum bovin fœtal et 100 unités/mL pénicilline/streptomycine) autour de l’agarose moulée en la piper lentement le long de la paroi du puits.
7. Remettre la plaque de puits dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 h.

4. Essai de cytotoxicité

1. Préparer 3 mL de 1x PBS avec 2% de sérum bovin fœtal par fonte agarose.
2. Après la co-culture pour 4 d, retirer le milieu de culture cellulaire entourant la fonte agarose avec une pipette P1000 en inclinant légèrement la plaque de puits avec l’autre main.
   REMARQUE : La période totale de coculture doit être décidée par l’enquêteur.
3. Distribuer 1 mL de 1x PBS + 2% FBS avec une pipette P1000 dans la chambre d’ensemencement pour déloger les sphéroïdes des microwells.
4. Répétez l’étape 4.3 deux fois avec le volume dans le puits et transférez-le dans un tube de 15 ml.
5. Centrifugez le tube à 300 x g pour 10 s à température ambiante (RT).
6. Retirez soigneusement le supernatant avec une pipette P1000.
7. Laver les cellules en ajoutant 1 mL de 1x PBS avec 2% FBS et centrifugeuse à 300 x g pendant 1 min à RT.
8. Répétez l’étape de lavage (étape 4.7).
9. Retirez le supernatant et ajoutez 1 mL de solution d’enzymes de dissociation cellulaire (voir tableau des matériaux).
10. Utilisez une pipette P200 et une pipette de haut en bas pour briser les grappes cellulaires.
11. Incuber les cellules pendant 20 min dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5% CO_2).
12. Répétez l’étape 4.10.
    REMARQUE : Prenez ~10 μL et les graines sur un plat de culture cellulaire pour observer (sous le microscope au grossissement de 10x) comment bien les sphéroïdes se sont dissociés dans les cellules simples. Si nécessaire, ajouter 5 min d’incubation supplémentaire.
13. Ajouter 4 ml de milieu de culture cellulaire complète (RPMI complété par 10% de sérum bovin fœtal et 100 unités/mL pénicilline/streptomycine) et mélanger en inversant le tube 3\u20124 fois.
14. Centrifugeuse à 400 x g pendant 4 min à RT.
15. Retirez le supernatant et resuspendez les cellules dans le tampon FACS pour la coloration d’Annelin V des cellules apoptotiques.
    NOTE: À partir de maintenant, toute coloration FACS et l’analyse cellulaire peuvent être effectuées.

5. Hydroxyéthyl agarose gel de traitement embedding pour sectionnage IHC

REMARQUE : Ici, il est essentiel d’éviter d’utiliser de l’agarose à faible fusion pour générer les fontes d’agarose.

1. À la fin de la co-culture, enlever le milieu de culture cellulaire entourant la fonte agarose avec une pipette P1000 d’abord en inclinant la plaque de puits. Ensuite, retirez lentement et soigneusement le milieu à l’intérieur du plâtre en ciblant doucement un coin de la chambre d’ensemencement avec une pipette P200 tout en gardant la plaque bien inclinée avec l’autre main.
2. Lentement pipette 10% formaline d’abord dans la chambre d’ensemencement en ciblant doucement un coin de la chambre d’ensemencement avec une pipette P200. Ajoutez ensuite 10% de formaline à l’extérieur de l’agarose coulé jusqu’à ce qu’il soit complètement couvert. Fixer la fonte agarose dans 10% formaline pour 1 d.
3. Retirez le formaline le lendemain.
4. Pipette soigneusement 210 μL (fonte de 81 microwells) ou 100 μL (fonte de 35 microwells) de gel de traitement d’agazose hydroxyéthyle préchauffé et liquéfié (voir tableau des matériaux)dans la chambre d’ensemencement de l’aga castrose en maintenant la pipette P200 à environ 0,5 cm au-dessus de la fonte.
5. Laissez le gel de traitement de l’agarose hydroxyéthyle solidifier pendant 10 min à RT.
6. Transférer le plâtre agarose à 1x PBS.
   REMARQUE : Pour un stockage plus long, incorporer la fonte dans 70 % d’éthanol pour prévenir la contamination.
7. Déshydrater les sections de gel à travers une série d’éthanol (1 h chacun : 70 % d’éthanol, 80 % d’éthanol, 95 % d’éthanol, 100 % d’éthanol [3x change chacun]). Puis dégager dans une solution de compensation 3x pour 1 h chacun (par exemple, les hydrocarbures aliphatiques [p. ex., Clearite], ou xylènes), et s’infiltrer avec de la paraffine fondue (3x pour 1 h chacun), soit manuellement, soit dans un transformateur de tissus. Incorporer la fonte dans la cire de paraffine pour la section ultérieure à 5 μm par section.
8. Retirer la cire en mettant des lames dans des xylènes, 3x pendant 3 min chacune, puis réhydrater les sections de tissu à travers une série d’alcools classés : 100% d’éthanol pour 2 min, 95% d’éthanol pour 1 min, 80% d’éthanol pour 30 s et 70% d’éthanol pour 30 s, puis placez-le dans l’eau.
9. Effectuer la récupération d’épitopes induits par la chaleur dans un vapeur de légumes à 100 °C pendant 20 min, suivie de 20 min de refroidissement dans une solution de citrate de sodium pH 6.0 de 10 mM et bloquer les peroxydases endogènes avec H₂O₂.
10. Bloquez les sections avec le sérum d’objectif normal et exposez-les à l’anticorps anti-CD8 (dilution 1/25) pendant la nuit.
11. Appliquer des anticorps secondaires conjugués anti-lapin-HRP (voir tableau des matériaux)et développer la coloration à l’aide de chromages 3,3'-Diaminobenzidine (DAB). Noyaux de contre-sol avec une solution d’hématoxyline Harris de 11 % (voir tableau des matériaux).

6. Surveillance et analyse de l’invasion sphéroïde en co-culture

NOTE : Le point temporel de l’invasion sphéroïde d’imagerie dans la matrice de collagène I doit être décidé par l’investigateur. Acquérir des images de culture cellulaire à l’aide d’un microscope inversé avec grossissement 10x. Le point de temps idéal dépend de la ligne cellulaire testée, ainsi que du composant ECM. Des lignées cellulaires plus invasives commenceront à se propager dans le collagène dans les quelques heures suivant l’ajout du collagène. Puisque les lymphocytes T de la co-culture peuvent empêcher une vue complète sur l’évacuation des sphéroïdes à des moments très précoces, généralement les images sont prises à 0 h (comme référence), 24 h et 48 h après l’ajout du collagène.

1. L’envahissement quantitate en comptant manuellement le nombre de « pointes » provenant du sphéroïde et/ou à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, par exemple, Image J.
   1. Analyser l’invasion comme le nombre de « pointes » du sphéroïde en comptant manuellement le nombre de « pointes » d’un sphéroïde.
      REMARQUE : Il doit être décidé par l’enquêteur que les protubéroïdes sont considérées comme des « pointes ». Un critère de décision pourrait être la longueur du « pic » mesuré à partir du bord du sphéroïde.
   2. Analyser l’invasion comme la zone d’invasion par rapport à la taille du sphéroïde.
      1. Utilisez l’outil de tirage à main libre (Image J) pour tracer la bordure de la zone totale (invasion + zone sphéroïde).
      2. Cliquez sur Analyser dans le menu supérieur, puis sur Mesurer pour afficher la mesure de zone.
      3. Tracez la bordure de la zone sphéroïde totale.
      4. Cliquez sur Analyser dans le menu supérieur, puis sur Mesurer pour afficher la mesure de zone.
      5. Copiez la liste de résultats mesurées dans une feuille de calcul et calculez l’invasion/sphéroïde total à l’aide de la formule : invasion totale = superficie totale/zone sphéroïde.

7. Coloration d’immunofluorescence

1. Préparez ce qui suit.
   1. Préparer 5,4 % de formaline (5 mL) à l’aide de 2,3 mL de 1x PBS et de 2,7 mL de formaline de 10 %.
   2. Préparer 0,5% Octoxynol (50 mL) en utilisant 50 mL de 1x PBS et 2,5 mL de 10% Octoxynol (magasin chez RT).
   3. Préparer IF Buffer (200 mL) à l’aide de 200 mL de 1x PBS, 200 mg d’albumine de sérum bovin (BSA), 4 mL d’octoxynol à 10%, 1 mL de 10% de polysorbate 20 (réchauffer jusqu’à RT avant utilisation; filtrer et stocker à 4 °C).
   4. Préparer la solution de blocage (5 mL) à l’aide de 5 mL IF Buffer et 500 μL de sérum de chèvre (réchauffer jusqu’à RT avant utilisation).
   5. Gardez les lames de chambre de 8 puits, les couvercles en verre et les supports de montage prêts.
2. Jour 0
   1. Fixer l’ensemble de la fonte agarose, y compris les sphéroïdes, du jour au lendemain dans 5,4% de formaline à RT dans une chambre humidifiée.
3. Jour 1
   1. Retirez le milieu de culture cellulaire entourant la fonte d’agarose avec une pipette P1000 en inclinant la plaque de puits.
   2. Transférez le patch de collagène dans une lame de chambre de 8 puits en saisissant un coin de la matrice de collagène dans la chambre d’ensemencement de la fonte d’agarose avec des pinces pointues lisses et pelez-la outre de l’agarose moulée dans un seul mouvement confiant.
      REMARQUE : Le patch de collagène doit être facilement séparé de la fonte d’agarose. Sinon, utilisez une pipette P1000 pour ajouter soigneusement le milieu de culture dans la zone de la chambre d’ensemencement ou inversez la fonte d’agarose et secouez doucement la plaque de puits pour déloger la matrice de collagène.
   3. Ajouter 250 μL de 0,5 % d’octoxynol (voir tableau des matériaux)par puits. Incuber pendant 1 h chez RT.
   4. Apirate l’Octoxynol et ajouter 250 μL de solution de blocage par puits. Bloc pour 1 h à RT.
   5. Pendant ce temps, diluer l’anticorps primaire (dilution pour l’anti-kératine 8: 1/500; Phalloidin 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) dans la solution de blocage, calculant pour 250 μL par puits.
   6. Ajouter l’anticorps primaire dans la solution de blocage et placer la lame de chambre dans une chambre humidifiée pour l’incubation de nuit à RT.
4. Jour 2
   1. Retirez l’anticorps primaire dans la solution de blocage en aspirant.
   2. Laver 3 fois en ajoutant 300 μL de tampon IF et laissez-le reposer pendant 5 min à RT.
      NOTE: Il suffit de le laisser reposer, il n’est pas nécessaire de le mettre sur un shaker.
   3. Diluer l’anticorps secondaire dans la solution de blocage (pour l’anti-kératine 8: anti-rat, dilution 1/500).
   4. Ajouter 250 μL d’anticorps secondaires dans la solution de blocage à chaque puits et incuber pendant 1 h à RT. A partir de maintenant, protégez les échantillons de la lumière.
   5. Retirez l’anticorps secondaire dans la solution de blocage en aspirant.
   6. Laver 3 fois avec 300 μL de tampon IF en ajoutant et laissez-le reposer pendant 5 min à RT.
   7. Rincer les échantillons avec 1x PBS et l’aspirate.
   8. Retirez soigneusement les parois de la glissière de chambre de sorte que seul la glissière de verre en bas reste.
   9. Ajouter au moins 200 μL de support de montage à un couvercle en verre et déposer lentement le couvercle sur l’échantillon.
      REMARQUE : Évitez de créer des bulles car cela aura un impact sur la qualité de l’image. Les bulles peuvent être évitées en plaçant doucement le couvercle sur le long bord de la glissière à un angle de 45° ou en abaissant lentement le couvercle de la glissière.
   10. Mettez les échantillons montés dans un endroit sombre et sec et laissez-les reposer toute la nuit. L’imagerie peut être effectuée le lendemain.
       NOTE: Le coverslip pourrait d’abord passer un peu une fois placé sur le patch de collagène. Laissez le glissement de verre reposer sur une zone uniforme pendant quelques minutes. Le couvercle aplatira l’échantillon de sorte qu’il n’y aura plus d’espace entre la glissière de verre et le couvercle au fil du temps.

8. Isolement des cellules de la matrice de collagène

1. Préparez ce qui suit.
   1. Préparer 1 mg/mL collagènease 4 dans un milieu de culture cellulaire contenant du sérum (magasin aliquoted collagènease 4 dilutions à -20 °C)
   2. Préparer 2,5% de BSA en 1x PBS et enrober tous les tubes et pointes de pipette avec elle (filtrez la solution BSA avant utilisation).
   3. Préwarmer la solution BSA et le milieu de culture cellulaire avant utilisation.
2. Préparer 2 mL de collagènease 4 solution (1 mg/mL) pour digérer un maximum de trois matrices de collagène de 35-microwell agarose casts.
3. Transférer jusqu’à trois matrices de collagène de 75 μL dans des coulées d’agarose de 35 microwells dans un tube de 15 mL pré-enduit de 2,5 % de BSA. Saisissez un coin de la matrice de collagène dans la chambre d’ensemencement de l’agarose moulé avec des pincettes pointues lisses pointe et pelez-le hors de l’agarose moulée dans un seul mouvement confiant.
4. Couper le bout d’un bout P1000 avec des ciseaux. Pré-enrober la pointe restante de 2,5% BSA et décomposer la matrice de collagène autant que possible en faisant des pipes de haut en bas. Incuber le tube pendant 15 min à 37 °C.
5. (Étape critique 4) À chaque 5 min, vérifiez si la matrice de collagène s’est dissoute. Pipette de haut en bas à nouveau avant de prendre 10 μL de l’échantillon et le semer sur un plat de culture cellulaire pour l’observer sous le microscope au grossissement 10x. Ajouter encore 5 min si nécessaire.
6. Remplissez le tube avec 10 ml de milieu de culture cellulaire préguerre (DMEM complété par 10% de sérum bovin fœtal). Mélanger délicatement en inversant le tube 3\u20124 fois.
7. Centrifugez le tube à 400 x g pendant 4 min à RT.
8. Retirer délicatement le supernatant et laisser 2 mL de volume.
9. (Étape critique 5) Laissez 2 ml après la première étape de centrifugation car il pourrait encore y avoir du collagène non dissolved au fond du tube transportant des cellules le long d’eux.
10. Effectuez deux étapes de lavage en ajoutant 10 mL de milieu de culture cellulaire contenant du sérum à chaque fois. Centrifugeuse à chaque fois à 400 x g pendant 4 min à RT.
11. Après la dernière étape de lavage, retirer autant de milieu que possible et laisser juste la pastille de cellule.
12. Resuspendez le granulé cellulaire dans 1 mL de solution d’enzymes de dissociation cellulaire (voir tableau des matériaux).
13. Utilisez une pipette P200 et une pipette de haut en bas pour briser les grappes cellulaires.
14. Incuber les cellules pendant 20 min dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5% CO_2).
15. Répétez l’étape 8.13.
    REMARQUE : Prenez ~10 μL et les graines sur un plat de culture cellulaire pour observer sous le microscope au grossissement de 10x pour voir comment bien les sphéroïdes se sont dissociés en cellules simples. Si nécessaire, ajouter 5 min d’incubation supplémentaire.
16. Ajouter 4 ml de milieu de culture cellulaire (DMEM complété par 10% de sérum bovin fœtal) et mélanger en inversant le tube 3\u20124 fois.
17. Centrifugeuse à 400 x g pendant 4 min à RT.
18. Retirer le supernatant. A partir de maintenant, la coloration FACS ou la culture cellulaire peuvent être effectuées.

9. Extraction de l’ARN à partir de la matrice de collagène

1. Préparer le guanidinium thiocyanate avec du phénol (voir tableau des matériaux),100% chloroforme, 70% éthanol sans RNase, kit d’extraction d’ARN(voir tableau des matériaux), tubes sans RNase de 1,5 mL, tubes sans RNase de 15 mL et ddH₂O sans RNase.
2. Transférer jusqu’à douze matrices de collagène de 190 μL de la fonte d’agarose de 81 microwells dans un tube de 15 mL. Saisissez un coin de la matrice de collagène dans la chambre d’ensemencement de l’agarose moulé avec des pincettes pointues lisses pointe et pelez-le hors de l’agarose moulée dans un seul mouvement confiant.
   REMARQUE : Les matrices peuvent également être congelées à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’extraction de l’ARN.
3. Ajouter 1 mL de guanidinium thiocyanate avec du phénol (voir tableau des matériaux)aux matrices de collagène dans le tube de 15 mL.
   REMARQUE : Le thiocyanate de guanidinium avec du phénol doit couvrir complètement les matrices de collagène.
4. Vortex les tubes pour 10\u201220 s.
5. Homogénéiser les matrices avec 20 aiguilles G et 5 seringues mL jusqu’à ce qu’elles soient complètement dissoutes.
6. Laissez les matrices reposer pendant 5 min à RT.
7. Ajouter 200 μL de chloroforme pur aux matrices et secouer vigoureusement le tube pendant 15 s.
8. Transférer immédiatement le mélange sur des tubes de 1,5 mL.
9. Laisser reposer le mélange pendant au moins 5 min à RT jusqu’à ce que les phases soient séparées.
10. Centrifuge les tubes de 1,5 mL à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
11. Remplissez un nouveau tube de 1,5 mL avec 500 μL d’éthanol à 70 %.
    REMARQUE : Dépendant du volume de la phase aqueuse après centrifugement (voir étape 9.12. La quantité d’éthanol à 70 % devrait être égale au volume de la phase aqueuse.
12. Transférer soigneusement la phase aqueuse supérieure des échantillons centrifuges dans le tube rempli d’éthanol à 70 % et mélanger soigneusement en faisant monter et descendre.
13. (Étape critique 6) Veillez à ne pas déranger les couches au fond du guanidinium thiocyanate avec la séparation du phénol tout en enlevant la phase supérieure, car cela contaminera l’ARN.
14. Ajouter l’échantillon à une colonne d’extraction d’ARN (inclus dans le kit d’extraction de l’ARN, voir Tableau des matériaux). À partir de maintenant, suivez le protocole du fabricant pour la purification de l’ARN à partir de cellules.

Résultats

Le modèle de co-culture 3D permet différents essais indiqués dans la figure 1A, qui peuvent être combinés ou modifiés au besoin. Dans notre configuration expérimentale établie, les cellules tumorales et T sont co-cultivées pendant 2 jours suivis de l’initiation du test d’invasion pour la sélection de cellules tumorales invasives et/ou résistantes (Figure 1B). Le jour 4, la quantitation de l’invasion est effectuée et les cellules « urvi » sont...

Discussion

La méthode présentée ici décrit la génération de sphéroïdes de tumeur 3D, qui permet la co-culture avec des cellules T, des essais fonctionnels et moléculaires à base de cellules, ainsi qu’une variété de possibilités de surveillance et d’analyse utilisant un seul dispositif. Le principal avantage de notre approche est qu’elle ne nécessite pas le transfert de la culture 3D à un test distinct et maintient l’intégrité de la culture 3D tout au long des tests.

Le flux de tr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Petri Dishes	Microtissues Inc	Z764019 & Z764051	referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides	Lab-Tek	154534
Agarose Type I, low EEO	Sigma-Aldrich	A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody	Agilent	K4003	ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg	Millipore	08-115
Collagenase Type 4, 1 g	Worthington	LS004188
DMEM, fetal bovine serum	ThermoFisher	11965092, 16000044	referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin	ThermoFisher	SH30-500D
HistoGel	ThermoFisher	HG-4000-012	referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst	Life Technologies	H1399	1/1000 dilution
Phalloidin 546	Invitrogen	486624	1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody	Cell Signaling	98941	1/25 dilution
rat anti-keratin 8	DSHB	TROMA-I AB_531826	1/500 dilution
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI	ThermoFisher	11875093	for T-cell culture medium
Triton X-100	BioRad	1610407	referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol	ThermoFisher	15596026	referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE	ThermoFisher	12604013	referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols