JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

Özet

Memeli hücreleri sürekli kimyasallara maruz kalırlar, radyasyon, ve doğal olarak meydana gelen metabolik yan ürünler, DNA hakaret belirli türleri oluşturmak. Genotoksik ajanlar DNA omurgasına zarar verebilir, kırabilir veya tek tek bazların kimyasal doğasını değiştirebilir. DNA hakaretinin ardından DNA hasar yanıtı (DDR) yolları aktive edilir ve onarımda yer alan proteinler işe alınır. Hasarın türünü algılamada ve uygun onarım yanıtını etkinleştirmede çok sayıda faktör rol oynar. DDR faktörlerinin doğru bir şekilde etkinleştirilmesi ve işe alınmaması, kanser de dahil olmak üzere birçok insan patolojisinde yatan genomik istikrarsızlığa yol açabilir. DDR proteinleri çalışmaları genotoksik ilaç yanıtı ve ilaç direnci hücresel mekanizmaları içine anlayışlar sağlayabilir.

Proteinleri in vivo'dagörselleştirmenin iki ana yolu vardır: doğrudan gözlem, ilgi proteinini floresan proteinle etiketleyerek ve canlı görüntüleme ile takip ederek veya sabit numunelerde dolaylı immünofülans. Floresan etiketli proteinlerin görselleştirilmesi zaman içinde hassas izleme sağlarken, N- veya C-terminus doğrudan etiketleme protein lokalizasyonu veya fonksiyonu ile engelleyebilir. Proteinlerin değiştirilmemiş, endojen versiyonlarında gözlemi tercih edilir. DNA onarım proteinleri DNA hakaret işe olduğunda, onların konsantrasyonu yerel artar ve gruplar oluşturur, ya da "foci", belirli antikorlar kullanılarak dolaylı immünoresans ile görselleştirilmiş olabilir.

Protein foci'nin saptanması doğrudan etkileşimin kesin bir kanıtı olmasa da, hücrelerdeki proteinlerin birlikte lokalizasyonu hasar mahallinde yeniden grupladıklarını ve karmaşık oluşum için gerekli olayların dizisini bilgilendirebileceklerini gösterir. Bir proteinin vahşi tipini veya mutant versiyonlarını ifade eden hücrelerdeki fosi uzamsal örtüşmelerin dikkatli analizi, DNA onarım fonksiyonu için önemli olan fonksiyonel etki alanları hakkında değerli ipuçları sağlayabilir. Son olarak, proteinlerin birlikte lokalizasyonu, hücrelerde ko-immünopresipitasyon veya saflaştırılmış proteinler kullanılarak doğrudan aşağı çekilme ile doğrulanabilecek olası doğrudan etkileşimleri gösterir.

Giriş

İnsan hücreleri sürekli çeşitli kökenlerden DNA zararlı ajanlar çeşitli maruz kalırlar. Ekzojen kaynaklar çoğunlukla radyasyona maruz ilerler, kimyasallar (kemoterapötik ajanlar ve bazı antibiyotikler dahil) ve virüsler, ana endojen kaynaklar DNA replikasyonu ve oksidatif stres hataları içerir iken. Genotoksik maruziyetin doğrudan etkileri, strese ve maruz kalma dozuna bağlı olarak modifiye edilmiş bir bazdan potansiyel olarak öldürücü DNA çift iplikçik kırılamı (DSB) arasında değişebilir. Sonuçta, onarılmamış veya yanlış onarılmış DNA hasarı mutasyonların birikimine yol açabilir, genomik yeniden düzenlemeler, genom istikrarsızlık ve sonunda karsinogenez yol 1 .1 Memeli hücreleri DNA hasarı belirli türleri tanımak için karmaşık yollar gelişti2,3 ve zamanında onları onarmak, hücre döngüsü ilerlemesi ile senkronize.

İzole radyasyon (IR) DNA çift sarkıklık zarar ve çift iplikçik sonları oluşturur (DSBs), DNA hasarının en zararlı formlarından biri. MRN (MRE11, RAD50, NBS1) DNA sensörü olarak karmaşık fonksiyonları biter ve protein kiaz ataksi telanjiektazi mutasyona (ATM)4,5aktive . DNA biter tarafından ATM ilk aktivasyonu ardından, ATM önemli bir olay ile başlayan, mola yerinde DDR olaylar bir çağlayan tetikler, histon varyantı H2AXfosforilasyon 6. Kalıntı S139 üzerindeki H2AX fosforilasyon γH2AX içine aktive, DNA lezyonu etrafında megabazlar kadar bölgeleri kapsayan6,7,8,9. Bu olay DNA erişilebilirliğini artırır, işe alma ve diğer DNA onarım proteinleri birikimine yol 7. γH2AX bol ve özellikle DSB'leri çevreleyen indüklenen olduğundan, belirli antikorlar kullanılarak kolayca görselleştirilebilir ve genellikle DNA onarım alanında DSB'ler için bir taşıyıcı belirteç olarak kullanılır. Mola sinyali verildikten sonra hücreler DNA tamir yollarını aktive eder ve DNA hasarını işlerler. Protein MDC1 (DNA hasar kontrol noktası protein arabulucusu 1) doğrudan γH2AX10bağlanır , ATM11 ile etkileşime ve ayrıca NBS112,13. DSB'deki MRN kompleksinin konsantrasyonunun artırılmasına ve olumlu bir ATM geri besleme döngüsübaşlatılmasına katkıda bulunur. γH2AX, mola onarıldıktan sonra hızla çıkarılır ve dsb açıklığının izlenmesine izin verilir. Mikroskopinin ardından γH2AX'ın zaman içinde azalması, artık sonları ve DNA onarım veriminin dolaylı olarak ölçülmesini sağlar.

Ökaryotik hücreler DSB'leri çeşitli yollarla onarabilirler, iki ana hücre homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR) dir. NHEJ aslında genişletilmiş homoloji kullanmadan DNA çift iplikçikli biter ligates ve hücre döngüsü boyunca çalışır14,15. Hr S ve G2 aşamalarında baskın hale gelir, ve aksi takdirde bastırılmış, onarım için homolog bir şablon olarak bir kardeş kromatit gerektirir beri14,16. NHEJ ve İk arasındaki yol seçimi sadece kardeş kromatit fiziksel yakınlığına bağlıdır, ama aynı zamanda DNA sonu rezeksiyon genişletmekbağlıdır 17, Hangi NHEJ inhibe.

Homolojiye bağımlı DSB onarımı, 5' ipliğin kopma uçlarından nükleolitik bozulma ile başlatılarak 3' tek iplikçikli DNA (ssDNA) kuyrukları oluşturmak için, 5'-3' rezeksiyon olarak adlandırılan bir süreçtir. MRN kompleksi DNA sonu rezeksiyonu başlatır ve daha fazla rezeksiyon BLM / EXO1 (Bloom sendromu protein / ekonenaz 1) veya BLM / DNA2 (DNA replikasyonu ATP bağımlı helicase / nükleaz)18,19,20,21,22ile birlikte işlenir . DNA sonu rezeksiyonu CTIP (CtBP-etkileşen protein) mrn kompleksi ile doğrudan etkileşim yoluyla geliştirilmiştir23 ve BRCA1 işe (meme kanseri tip 1 duyarlılık proteini)24,25. Replikasyon proteinI A (RPA) derhal açığa çıkan ssDNA bağlanır ve daha sonra homolog arama ve iplikçik invazyonu katalizler bir nükleoprotein filament oluşturmak için rekombinaz protein RAD51 tarafından yerinden edilir26,27,28.

Rezeksiyon un başlatılması onarım yolu seçimi için kritik bir adımdır. Bir kez rezeksiyon başladı, DNA biter Ku70/Ku80 heterodimer (NHEJ yolu bileşeni) tarafından bağlayıcı için zayıf substratlar haline gelir ve hücreler HR17,,29,30kararlıdır . Ku70/Ku80 heterodimer DSB biter bağlanır, DNA-PKcs ve p53 Bağlayıcı Protein 1 (53BP1)29,,30işe. 53BP1 G1 rezeksiyon için bir bariyer olarak görür, böylece NHEJ teşvik ederken İk engelleme31,32, ama S fazında brca1 bağımlı bir şekilde kaldırılır, sonuç olarak rezeksiyon oluşmasına izin33,34. Bu nedenle, 53BP1 ve BRCA1 DSB onarımında karşıt roller oynarken, 53BP1 NHEJ kolaylaştırıcısı olurken BRCA1, hr aracılığıyla onarım molalarını sağlar.

Laboratuvarda, DSB oluşumu iyonlaştırıcı radyasyon (IR) ile indüklenebilir. Bu örnekte yüksek dozda 4 Gy, 1 Gy ve 2 Gy de bol proteinlerle fosi oluşumunun analizi için uygun miktarda DSB oluşturur. Kullanılan radyasyonun türü ve dozu DNA'da ve hücrede farklı lezyonlara yol açabilir dikkat etmek önemlidir: IR DSB'ler indükler iken, aynı zamanda tek iplikçik kırıkları veya baz modifikasyonu neden olabilir (ışınlama lineer enerji transferi bir referans için35,36 bakınız (LET) ve DNA hasarı türü). Radyasyona bağlı fok oluşumunun iyonlaştırıcı kinetikbelirlemek için (IRIF) oluşumu ve bunların temizliği, aktif DDR8,9,,37,38hasar ve ters onarım gösteren, fosi oluşumu iyonlaştırıcı radyasyon sonra farklı zaman noktalarında izlenebilir. Aktivasyon zamanlaması ve tüm büyük DNA hasarı proteinlerin temizlenmesi39bilinmektedir , ve birçok önemli olayların vekil işaretleri olarak araştırılmaktadır. Örneğin, ssDNA'ya yüksek afiniteye sahip olan pRPA, kırılma rezeksiyonunun taşıyıcı sı, MRN proteinleri (MRE11, RAD50, NBS1) ve eksonüekleaseler rezeksiyon verimliliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. RAD51, BRCA1, BRCA2 (meme kanseri tip 2 duyarlılık proteini) ve PALB2 (BRCA2'nin partneri ve lokalizatörü) HR verimliliğini değerlendirmek için izlenebilse de, Ku proteinlerinin varlığı veya 53BP1, NHEJ'nin belirteçleri olarak kullanılır (Şekil 1).

DNA onarım makinelerinin proteinleri birbirlerini süper komplekslerde biraraya getirerek biraraya getirdikçe, DNA-protein ve protein-protein etkileşimleri zaman içinde bireysel lokalizasyonlarını takip ederek ve proteinlerin eş lokalizasyonunu analiz ederek çıkarılabilir, hücre40,41,42'dekisinyalleri örtüşerek görselleştirilmiştir. Hücre hatlarında, belirli DNA onarım genlerinde nokta mutasyonlarının veya silmenin genom düzenlemesi yoluyla ya da plazmid tabanlı mutantların aşırı ekspresyonu yoluyla başlatılması, spesifik kalıntıların araştırılmasına ve DNA hasarının tanınmasındaki olası rollerinin (örneğin, γH2AX ile birlikte lokalizasyon) veya karmaşık montajın (başka bir veya birkaç proteinle birlikte lokalizasyon) yanı sıra DNA onarımı üzerindeki etkilerinin araştırılmasına olanak sağlar. Burada, dsbs oluşumunu ve çözünürlüğünü araştırmak için bir ortalama olarak dolaylı immünfloresans kullanın γH2AX foci zaman içinde takip ederek. Ayrıca DSB onarımönemli bir oyuncu tarafından foci oluşumu ve co-lokalizasyon analizi bir örnek satıyoruz: p53 Bağlayıcı Protein 1 (53BP1)32. Daha önce de belirtildiği gibi, 53BP1 DNA onarım yolu seçimi merkezi olarak kabul edilir. ΓH2AX ile birlikte 53BP1 birikimi ve birlikte lokalizasyonu hücre döngüsü fazı, DNA hasar birikimi ve DSB'leri onarmak için kullanılan yol hakkında değerli bilgiler sağlar. Dolaylı immünolokalizasyonun amacı, bu çalışmada olduğu gibi IR'yi takip ederek veya hücredeki çeşitli streslere maruz kaldıktan sonra, DNA çapraz bağlantısından çoğaltma çatalının tıkanması için hücre hatlarındaki DNA hasar onarımının etkinliğini değerlendirmektir (DNAzararlı ajanların listesi Tablo 1'de verilmiştir).

figure-introduction-9265
Şekil 1: DNA çift iplikçik kırıkları (DSB) onarım yolları.
DSB onarımı iki ana yolu içerir: Homolog Rekombinasyon (İk, sol) ve Non-Homolog End-Joining (NHEJ, sağ). Aradan sonra proteinler break (γH2AX) işaretlemek için aktive olsun, son rezeksiyon (MRN) katılmak, rezeke ssDNA (pRPA), rekombinasyon teşvik (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) veya rezeksiyon sınırlamak ve NHEJ (53BP1) teşvik. Diğer proteinler hasar onarımına katılırlar, ancak listelenen proteinler rutin olarak dolaylı immünfloresans tarafından takip edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

DNA zararlı maddeEtki mekanizmasıÖnerilen doz
γ-ışınları/X-ışınlarıRadyasyon
Bazı kontrolsüz hücresel etkilerle çift iplikli kırıkların oluşması		1-4 Gy
36.000 Ar iyonlarıRadyasyon
Çift iplikli sonları oluşumu		270 keV/μm
α parçacıklarıRadyasyon
Çift iplikli sonları oluşumu		116 keV/μm
BleomisinDNA sentezinin inhibitörü0.4-2 μg/mL
CamptothecinTopoisomerase Inhibitörü I10-200 nM
SisplatinAlkylating ajan
(intrastrand crosslinks indükleyen)		0,25-2 μM
DoksorubisinAra ajan
Topoisomerase Inhibitörü II		10-200 nM
EtoposideTopoisomerase Inhibitörü II10 μM
HidroksyureaDNA sentezinin inhibitörü
(ribonükleotid redüktaz tarafından)		10-200 μM
Metil metansülfonatAlkylating ajan0,25-2 mM
Mitomisin CAlkylating ajan0,25-2 μM
Ultraviyole (UV) ışıkTimidin dimers oluşumu
(DNA zincirinin bozulmasını üreten)		50-100 mJ/cm2

Tablo 1: Genotoksik ajanlar. DNA'ya zarar veren ajanlar, etki mekanizmaları ve önerilen çalışma konsantrasyonuna dayalı hasar örnekleri.

Protokol

1. HeLa hücre kültürü

  1. 16-18 saat boyunca 50 °C'de 1 M HCl'lik yuvarlak cam kapaklar ön muamele. DDH2O ile durulayın ve %100 EtOH'ta saklayın.
  2. Hücre kültürü ortamını hazırlayın: DMEM ortamına %10 (v/v) FBS ekleyin.
  3. 37 °C'de 18 mm yuvarlak cam kapak kaymaları ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 CO2 ile steril 12 kuyulu tabakta 4,0 x 104 hücre/kuyu büyüyün. Hücreleri %80 biraraya (yaklaşık 24 saat) büyütün.

2. Radyasyon ile hücre tedavisi (IR)

  1. Çift iplikçikli sonları oluşumunu sağlamak için hücreleri 4 Gy γ-ışınlama (kontrol: ışınlama yok, t=0) maruz bırakın. Gama Hücresi -40'ta bu işlem 4,54 dk'ya karşılık gelir ve dakikada 0,815 Gy'dir.
  2. Uygun zaman uzunluğu için nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C ve %5 CO2'de kuluçka hücreleri (burada seçilen zaman noktaları t=1, 2, 4, 16 saat).

3. Nükleer çıkarma ve hücre fiksasyonu

  1. Stok çözeltileri hazırlayın: 0,2 M BORULAR (pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M sakaroz, 1 M MgCl2, 0.1 M EGTA (pH 8.0).
  2. Nükleer ekstraksiyon tamponu (NEB) hazırlayın: 10 mM BORULAR (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM sakkaroz, 3 mM MgCl2,1 mM EGTA (pH 8.0) ve %0.5 (v/v) Triton X-100 ddH2O. Karıştırın tamamen çözülene kadar karıştırın.
  3. Hazırlamak 4% (v / v) paraformaldehit (PFA): 30 mL PBS 10 mL % 16 PFA sulu çözelti sçözünür. Tamamen eriyene kadar karıştırın.
  4. Uygun zaman noktasında (t=0, 1, 2, 4, 16 saat), hücreleri 1 mL PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi tamamen kaldırın.
  5. Hücre çekirdeği ekstraksiyonu için her kuyuya 200°L NEB ekleyin (sitoplazma bozulur, sadece çekirdek kalır)(Şekil 2). Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatırın ve tamamen çıkarın.
    NOT: 2 dakikayı geçmeyin.

figure-protocol-1984
Şekil 2: Nükleer çıkarma.
(Sol) ve sonrası (sağ) nükleer çıkarma dan önce hücrelerin temsili görüntüler. Sitoplazma sindirilmelidir ancak nükleer yapı çıkarma sonrası bozulmadan kalmalıdır (sağda). (A) 20x büyütme; ölçek çubuğu = 20 μm ve (B) 40x büyütme; ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın. PBS'yi tamamen kaldırın. Dikkatle PBS ekleyin, hücreler bu adımda çok kırılgandır.
  2. Hücre fiksasyonu için her kuyuya %4 (v/v) PFA 200 μL ekleyin. 4 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın. PfA'yı tamamen çıkarın.
  3. 1 mL PBS ekleyin.
    NOT: Hücreler 4 °C'de PBS'de saklanabilir.

4. İmmünofluoresan boyama

  1. Engelleme çözeltisini hazırlayın: PBS'de %5 BSA (w/v) çözünve %0,3 (v/v) Triton X-100 ekleyin. Tamamen eriyene kadar karıştırın.
  2. Seyreltme tamponu hazırlayın: PBS'de %1 BSA (w/v) çözünve %0,3 (v/v) Triton X-100 ekleyin. Tamamen eriyene kadar karıştırın.
  3. Engelleme için, her kuyuya 200 μL engelleme çözümü ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat veya 4 °C'de 16-18 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Keçi antikoru kullanılacaksa, bloke çözeltisine %5 keçi serumu ekleyin.
  4. Seyreltme tamponunda birincil antikor seyreltin (1:500; antikorlar listesi için Tablo 2'ye bakınız) ve girdap iyice karıştırılıncaya kadar.
    NOT: Keçi antikorkullanılırsa, seyreltme tamponuna %1 keçi serumu ekleyin.
  5. Bir nem/kuluçka kutusunda, bir parça parafilm yapıştırın. 10 μL primer antikor ekleyin (tek bir damla). Kapağın bir kenarını damla ile hizalayın ve sıvının boyunca yayılması için parafilmin üzerine yavaşça indirin (mümkünse kabarcıklardan kaçının). Oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya yat.
  6. PBS'de 1 dakika boyunca üç kez kapakları yıkayın.
  7. Seyreltme tamponundaki sekonder antikor (son konsantrasyon: 2 μg/mL) ve girdap iyi karıştırılına kadar seyreltin.
  8. Primer antikorlar için açıklandığı şekilde 10 μL sekonder antikor uygulayın. Oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya yat.
    NOT: Işıktan koruyun.
AntikorŞirketBaşvuruKaynak
53BP1Hücre Sinyalizasyonu4937Tavşan
Anti-Fare IgG H & L (Alexa Flor 647)Abcamab150103Eşek
Anti-fosfo-Histon H2A. X (Ser139), klon JBW301Millipore05-636Fare
Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 488)Abcamab150081Keçi

Tablo 2: Kullanılan antikorlar. Bu çalışmada kullanılan antikorların listesi.

  1. PBS'de 1 dakika boyunca üç kez kapakları yıkayın.
  2. 1 dakika boyunca H2O ile kapakları yıkayın.
  3. DAPI ile karşı leke DNA: uygulayın 10 μL 300 nM DAPI (antikorlar için açıklandığı gibi), oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka ve sonra gliserol bazlı montaj ortamı ile cam slayt üzerine monte. Alternatif olarak, bir slayt üzerine DAPI içeren ticari antifade montaj ortamı bir damla (10 μL) ekleyin ve bir coverslip uygulayın. Kapak kapağını hafifçe bastırın ve kağıt havlu ile etrafındaki fazla sıvıyı çıkarın.
  4. Mühür şeffaf oje ile kapakları ve 20 dakika kuru bırakın.
  5. Slaytları 4 °C'de saklayın.

5. Görüntü edinimi

  1. 60x objektif lens üzerine daldırma yağı bir damla yerleştirin. Göz parçası ile çekirdekleri bulmak için DAPI kullanın.
    1. XYZ görüntü edinimi, açık satın alma yazılımı ve belirli parametreler için: Tarayıcı türü: Galvano; Tarayıcı modu: Gidiş-dönüş; Görüntü boyutu: 512×512; PMT modu: VBF; PMT ortalaması: çerçeve (4 kez); PMT sıralı tbm: satır.
    2. Boyayı ve dedektörleri seçin:
      Kanal (CH1), Boya (DAPI), Dedektör (SD1)
      Kanal (CH2), Boya (Alexa Fluor 488), Dedektör (HSD3)
      Kanal (CH3), Boya (Alexa Fluor 647), Dedektör (HSD4)
    3. "Z"de A.B.'yi seçin.
  2. Canlı görüntüyü ayarlayın. Canlı penceredeki Canlı düğmesine basın.
    1. Odak ve set lazer yoğunluğu (%), duyarlılık (HV), kazanç ve "PMT" araç penceresinde ofset.
      1. Parlaklık ve beyazlatma için lazer yoğunluğunu (%): ayarlayın. Lazer yoğunluğu ne kadar yüksekse sinyal o kadar güçlü olur, ama numune fotobleach olur.
      2. Duyarlılığı (HV): gürültü seviyesini ayarlayın. HV ne kadar yüksekse, sinyal o kadar güçlü olur, ancak görüntü çok yüksekse gürültülü olur.
        NOT: Voltajı her zaman sabit tutun.
      3. Ofset: arka plan düzeyini ayarlayın.
    2. Z yığınları için Başlangıç/Bitiş (15 dilim) seçeneğini belirleyin.
  3. Satın almayı başlatın.
    1. Görüntüleri kaydetmek için klasörü seçin. Görüntüyü elde etmeye başlamak için LSM Başlat düğmesine basın. Görüntü edinimini tamamlamak için Seri Bitti düğmesine basın.

6. Veri analizi

  1. Görüntü analizi için analiz yazılımını açın.
    1. Toplu İşlem aracı penceresine basın, çözümlemek için görüntüleri seçin ve çıktı klasörünü seçin.
    2. Analiz aracı penceresine basın ve Projeksiyon'u seçin (maksimum yoğunluk projeksiyonu 15 dilimden görüntüler).
    3. Giriş/Çıkış ayarıaltında oluşturulan toplu işlemi seçin.
    4. Görüntülerin işlenmesi için İşleme tuşuna basın.
    5. Görüntüleri .tiff dosyaları olarak dışa aktarın.
  2. Nükleer fok kantisi için CellProfiler'ı açın.
    1. ΓH2AX ve 53BP1 foci quantification boru hattını açın (bkz. Ek bilgiler).
    2. Tablo yazılımı kullanarak verileri grafik.
  3. Eş yerelleştirme analizi için CellProfiler'ı açın.
    1. Ortak Yerelleştirme ardışık hattını açın (bkz. Ek bilgiler). Bir elektronik tablo dosyası oluşturulur ve tercih edilen konuma kaydedilir. Ancak, grafiklerin kendileri otomatik olarak kaydedilmez. Sonuçların kaydedilmesi için pencerelerin anlık görüntüsünü alması önerilir.
    2. Tablo yazılımı kullanarak verileri grafik.

Sonuçlar

2. günde veya 24 saat sonrası kapaklarda tohumlama hücreleri, hücreler bir bölünme geçirmiştir ve% 80 confluent vardır. DNA onarım proteinlerinde belirli düşme ler veya mutasyonlar iki katına çıkarma süresini artırabilir veya hücreleri genotoksik tedaviye duyarlı hale getirebilir ve tohumlama yoğunluğunun yanı sıra tedavi dozları da buna göre ayarlanmalıdır. En iyi çalışma koşullarını belirlemek için, DNA hasar yanıtının zamanlaması zamanla γH2AX'ın Batı'da blotlama ile belirleneb...

Tartışmalar

DNA hasar onarımının mikroskobik ile zamanlaması ve etkinliğinin analizi, DNA onarım makinelerinin normal hücrelerde ve kanser gibi insan patolojilerinde nasıl çalıştığını anlamak için gerekli olmuştur.

Onların fosforile sürümünde aktive proteinlerin tespitine olanak sağlayan spesifik antikorların geliştirilmesi (γH2AX, pRPA, pRAD50 ve diğerleri gibi10,23,39,

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma San Antonio Area Foundation'ın bir bağışı ile desteklenmiştir. Mays Kanser Merkezi NCI kanser merkezi destek çekirdek hibe P30 CA054174 tarafından desteklenir. Stephen Holloway'e reaktifleri ve Sung laboratuvarına alan ve mikroskopi kapasitesi sağladığı için yardımları için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solutionElectron Microscopy Sciences15710Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA3059Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips)NeuvitroNC0308920Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate]Gibco11965118Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)Research Products InternationalE57060Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS)Life Technologies104370028The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2)Research Products InternationalM24000Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)Research Products InternationalP40150Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPIInvitrogenS36973300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl)Research Products InternationalS23020Nuclear extraction buffer.
SucroseResearch Products InternationalS24060Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope SlidesFisherbrand1255015Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wellsCostar3513Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100AmericanBioAB02025Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol RedGibco12604021Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol RedGibco15400054TrypLE can be used instead.

Referanslar

  1. Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600 (2015).
  2. Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N. Emerging Roles of RAD52 in Genome Maintenance. Cancers (Basel). 11 (7), (2019).
  3. Oh, J., Symington, L. S. Role of the Mre11 Complex in Preserving Genome Integrity. Genes (Basel). 9 (12), (2018).
  4. Uziel, T., et al. Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage. The EMBO Journal. 22 (20), 5612-5621 (2003).
  5. Lee, J. H., Paull, T. T. ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex. Science. 308 (5721), 551-554 (2005).
  6. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273, 5858-5868 (1998).
  7. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Research. 36 (17), 5678-5694 (2008).
  8. Martin, O. A., Pilch, D. R., Redon, C., Bonner, W. M. Histone H2AX in DNA damage repair. Cancer Biology & Therapy. 2 (3), 233-235 (2003).
  9. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-916 (1999).
  10. Stucki, M., et al. MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks. Cell. 123 (7), 1213-1226 (2005).
  11. Lou, Z., et al. MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM-dependent DNA damage signals. Molecular Cell. 21 (2), 187-200 (2006).
  12. Chapman, J. R., Jackson, S. P. Phospho-dependent interaction between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage. EMBO Reports. 9 (8), 795-801 (2008).
  13. Melander, F., et al. Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin. Journal of Cell Biology. 181 (2), 213-226 (2008).
  14. Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nature Review. Molecular Cell Biology. 9 (4), 297-308 (2008).
  15. Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).
  16. Mehta, A., Haber, J. E. Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (9), 016428 (2014).
  17. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
  18. Huertas, P. DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 11-16 (2010).
  19. Nimonkar, A. V., et al. BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair. Genes & Development. 25 (4), 350-362 (2011).
  20. Garcia, V., Phelps, S. E. L., Gray, S., Neale, M. J. Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1. Nature. 479 (7372), 241-244 (2011).
  21. Sturzenegger, A., et al. DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 27314-27326 (2014).
  22. Daley, J. M., Niu, H., Miller, A. S., Sung, P. Biochemical mechanism of DSB end resection and its regulation. DNA Repair. 32, 66-74 (2015).
  23. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  24. Chen, L., Nievera, C. J., Lee, A. Y. L., Wu, X. Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1-CtIP-MRN is important for DNA double-strand break repair. Journal of Biological Chemistry. 283, 7713-7720 (2008).
  25. Yun, M. H., Hiom, K. CtIP-BRCA1 modulates the choice of DNA double-strand break repair pathway throughout the cell cycle. Nature. 459 (7245), 460-463 (2009).
  26. Sung, P., Klein, H. Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nature Review. Molecular Cell Biology. 7, 739-750 (2006).
  27. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanisms of eukaryotic homologous recombination. Annual Review of Biochemistry. 77, 229-257 (2008).
  28. Jasin, M., Rothstein, R. Repair of strand breaks by homologous recombination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (11), 012740 (2013).
  29. Dynan, W. S., Yoo, S. Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids. Nucleic Acids Research. 26 (7), 1551-1559 (1998).
  30. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  31. Cejka, P. DNA end resection: nucleases team up with the right partners to initiate homologous recombination. Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 22931-22938 (2015).
  32. Mirman, Z., de Lange, T. 53BP1: a DSB escort. Genes & Development. 34, 7-23 (2020).
  33. Cao, L., et al. A selective requirement for 53BP1 in the biological response to genomic instability induces by BRCA1 deficiency. Molecular Cell. 35 (4), 534-541 (2009).
  34. Zimmermann, M., de Lange, T. 53BP1: Pro choice in DNA repair. Trends in Cell Biology. 24 (2), 108-117 (2014).
  35. Mavragani, I. V., Nikitaki, Z., Kalospyros, S. A., Georgakilas, A. G. Ionizing Radiation and Complex DNA Damage: From Prediction to Detection Challenges and Biological Significance. Cancers (Basel). 11 (11), (2019).
  36. Nikitaki, Z., et al. Measurement of complex DNA damage induction and repair in human cellular systems after exposure to ionizing radiations of varying linear energy transfer (LET). Free Radical Research. 50, 64-78 (2016).
  37. Redon, C., et al. Histone H2A variants H2AX and H2AZ. Current Opinion in Genetics & Development. 12 (2), 162-169 (2002).
  38. Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA Repair. 3 (8-9), 959-967 (2004).
  39. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
  40. Sy, S. M. H., Huen, M. S. Y., Chen, J. PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7155-7160 (2009).
  41. Buisson, R., Masson, J. Y. PALB2 self-interaction controls homologous recombination. Nucleic Acids Research. 40 (20), 10312-10323 (2012).
  42. Belotserkovskaya, R., et al. PALB2 chromatin recruitment restores homologous recombination in BRCA1-deficient cells depleted of 53BP1. Nature Communications. 11 (1), 819 (2020).
  43. Betts, J. A., et al. Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage. American Journal of Human Genetics. 101 (2), 255-266 (2017).
  44. Dray, E., et al. Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (9), 3560-3565 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 160mm nofloresansco lokalizasyonn kleer fosinlama kaynakl fociDNA hasar onar m

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır