GFP eksprese eden osteositlerin murin kalvarial fraksiyonasyonu yoluyla primer osteositlerin elde edilmesi

Özet

Bu protokol, floresan aktive hücre sıralama (FACS) için osteosit hazırlığına ek olarak, yenidoğan dmp1-topaz fare kalvarisinin diseksiyonunu ve yeşil floresan proteinini hücre sindirimi ve fraksiyonasyonu yoluyla eksprese eden osteositlerin izolasyonunu açıklar.

Özet

Bir zamanlar mekanik yüklemeyi algılamanın sahne arkası işlevi göz önüne alındığında kemiğin pasif bir sakini olduğu düşünülen osteosit, şimdi spot ışığına çıkarılmıştır ve hücre dışı matrisi aktif olarak modifiye etmek ve uzak bölgelere mesaj gönderen lakunokanaliküler sistemle endokrin bir organ oluşturmak gibi birçok önemli fonksiyona sahip olduğu gösterilmiştir. Osteositi in vitro olarak primer osteositlerin izole edilmesinden osteosit benzeri hücre hatlarına kadar test etmeyi mümkün kılan yöntemler sayesinde, osteositler şimdi yankılanan bir ilgi ve yapı ve işlev hakkında bilgi artışı yaşamaktadır. Osteosit biyolojisinin birçok yönü ve diğer moleküler bileşenlerle etkileşimi henüz keşfedilmemiştir. Bu protokolde, osteositlerdeki yeşil floresan proteinini eksprese eden dmp1-topaz yenidoğan fare kalvarisinden primer osteositlerin hücre fraksiyonasyonu yoluyla ve daha sonra FACS ile primer osteosit kültürlerinin elde edilmesi yoluyla etkili izolasyonunu ayrıntılı olarak açıklayacağız.

Giriş

Osteositler, salgılanan matriks^1'e gömülmüş osteoblastik progenitörlerden terminal olarak farklılaşmış hücrelerdir. Kemik hücresi popülasyonları arasında en bol ve en uzun yaşayan hücrelerdir. Lakunalar içinde bulunurlar ve kanalikül adı verilen kanallar boyunca uzanan dendritlerle karakteristik bir yıldız morfolojisine sahiptirler ve çevrelerindeki çevre ve kemik yüzeyi² ile geniş bir iletişim ve metabolik değişim ağı oluştururlar. Osteositler hem osteoblastların hem de osteoklastların kemik yeniden şekillenmesindeki rollerini koreografi yaparlar, mekanik yükleme^3'e adaptasyon sağlayan birincil mekanosensoriyel hücrelerdir, fosfat homeostazı⁴ ve kemik matriks mineralizasyonunda^rol alırlar 5 ve lakunokanaliküler sistemle birlikte uzak dokuları işaret eden endokrin bir organ görevi görürler⁶.

Osteositler, erişilebilirliği sınırlayan ve izolasyonlarını zorlaştıran, böylece in vitro araştırmayı engelleyen mineralize bir matris içinde yer almaktadır. İlk izolasyon yöntemlerinden biri, daha sonra PHEX'in kuş varyantı olarak bilinen osteosit spesifik bir monoklonal antikor (OB7.3)⁷ kullanarak tavuk kalvarisinden izole osteositleri tanımlamıştır (X kromozomundaki Endopeptidazlara homoloji ile PHosfat düzenleyici gen)⁸. Diğer araştırmacılar, osteosit saflığının yaklaşık% 70 olduğu bildirilen osteosit bakımından zengin fraksiyonlar elde etmek için sıçan⁹ veya fare¹⁰ uzun kemiklerinin sıralı sindirimini ^{kullandılar9}. Bu prosedürün sınırlamaları, osteositlerin yanı sıra diğer hücre tipleriyle kontamine olmuş kültürlerin optimal olmayan saflığını ve osteositlerin bölünme yeteneğini kaybettiği için osteositlerin kültürdeki diğer hücreler tarafından potansiyel olarak büyüyebileceğini içerir. Bu zorluklar uzun vadeli kültürlerin kullanılabilirliğini kısıtlamaktadır.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için farklı osteosit hücre hatları geliştirilmiştir. MLO-Y4 hücre hattı¹¹ ve MLO-A5 hücre hattı¹², özellikle erken evre osteositlerin incelenmesi için yararlı olan en yaygın olarak çalışılan hücre hatlarıdır; Bununla birlikte, her ikisi de olgun osteosit belirteçleri olan düşük sklerostin ve FGF23¹³ seviyelerini ifade ettikleri için olgun osteosit sinyallemesini incelemek için daha az faydalıdırlar. IDG-SW3¹⁴ ve Ocy454¹⁵ dahil olmak üzere diğer hücre hatları, yüksek seviyelerde sklerostin ve FGF23 eksprese eder ve geç osteosit evresinin incelenmesinde yararlıdır. Hücre hatlarının yararlı araştırma araçları olduğu kanıtlanmıştır; Bununla birlikte, birincil hücrenin biyolojisini tam olarak temsil etmedikleri için sınırlama olmaksızın gelmezler. Farklı hücre hatları, osteosit olgunluk spektrumunun farklı gelişim aşamalarını temsil eder ve hücre hatları, primer osteositlerin heterojenliğini temsil edemez^16,17.

Primer osteositlerin saf kültürlerini elde etmek için araştırmacılar, osteositlerde yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonunu yönlendirmek için 8-kb dmp1 promotörünün kullanıldığı cre fare modelinden yararlandılar^18,19. Paic ve ^ark.19 tarafından çift transgenik fareler (pOB-Col 2.3- GFP-camgöbeği ve DMP1-GFP-topaz) ve Nakashima ve ^ark.20 tarafından dmp1-topaz transgenik fareler osteosit popülasyonları elde etmek için kullanılmıştır. Primer osteositlerin kültürlerini elde etmek için GFP'yi ifade eden osteositlerin sıralı sindirim ve FACS'sini kullandılar^19,20. TdDomates proteinini aktive eden 10 kb dmp1 muhabir fare Ai9'daki cre yönünün, osteositlerde, osteoblastlarda, kaslarda ve kemik iliğindeki hücrelerde mevcut olduğu gösterilmiştir. 8-kb dmp1 promotörü aynı ekspresyon modeline sahipti, ancak osteoblastların ve kemik iliği hücrelerinin sadece bir kısmı proteini ifade etti, bu da 8-kb dmp1 promotörünün daha spesifik²¹ olduğunu gösteriyor. Buna rağmen, 8-kb dmp1 promotörü kullanılarak elde edilen sonuçlar dikkatle yorumlanmalı ve elde edilen popülasyonun yeterince yüksek saflıkta olmasını sağlamak için osteosit ve osteoblasta özgü belirteçler kullanılarak gen ekspresyon profilleri rutin olarak gerçekleştirilmelidir.

Osteoklast belirteçleri OSCAR ve Dcstamp, hematopoetik tükenmemiş ve tükenmiş osteosit popülasyonlarında bulundu, bu bulgu yazarları 8-kb dmp1-topaz yenidoğan kalvarisinin fraksiyonasyonundan ve GFP ayıklamasından elde edilen sindirimlerin hematopoetik hücrelerle kontamine olduğu sonucuna götürdü. GFP-pozitif hematopoetik hücreler GFP-pozitif mezenkimal hücrelerden (osteositler)²² oldukça düşük GFP yoğunluğuna sahip olduklarından, GFP sıralama kapısının sıkılaştırılmasıyla hematopoetik hücrelerle kontaminasyon azaltılabilirdi.

Osteositleri in vitro olarak incelemek için kullanılan yöntemler, osteosit biyolojisi hakkındaki son zamanlardaki bilgi zenginliğine katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, osteosit izolasyonu, düşük hücre verimi ile emek yoğun ve uzun süren bir prosedür olmaya devam etmektedir. Kollajenaz ve EDTA kullanılarak sıklıkla fraksiyon 8^23'e kadar tarif edilen kemik sindirim yöntemi, osteosit canlılığının vergilendirildiği birkaç saat sürer. Araştırmacılar, hücre sıralaması 20 için fraksiyonlar (2\u20125) kullandıklarını bildirmişlerdir ve osteositlerle ilişkili genlerin osteoblastlarınkilere karşı ekspresyon profilinin, saf osteosit popülasyonlarının izole edilmesinin başarısını doğruladığını göstermiştir²⁰. Bu makalede, fraksiyon elde etme sürecini (2\u20125) açıklayacağız ve her fraksiyondaki osteositlerin geri dönüşünü belirlemek için fraksiyon 1 ila 8 ile başlayan her fraksiyondan osteositlerin verimini karşılaştırıyoruz. Ayrıca, yenidoğan dmp1-topaz fare kalvarisinin diseksiyonunu ve kollajenaz ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kullanılarak kalvaryal sindirimin yanı sıra FACS için hücrelerin hazırlanmasını da tanımladık.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri ve hayvan bakımı, Tohoku Üniversitesi kural ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Yenidoğan dmp1-topaz fare calvaria'nın diseksiyonu

1. Bu protokol için, C57BL / 6-Tg (Dmp1-Topaz) 1Ikal / J farelerinin 6\u20127 günlük yavrularını kullanın. Fareleri% 5 izofluran inhalasyonu ile ötenazi yapın ve daha sonra yavruları% 70 etanol'e aktarın.
2. Ötanazi yapılan yavruyu tedavi edilmemiş bir kültür kabına aktarın.
3. Makas ve cımbız kullanarak, kafatasının tabanındaki cildi tutun ve bir kesi yapın.
4. İlk insizyonu başlangıç noktası olarak kullanarak, kafatasının her iki lateral tarafını kulakların önünde kesin, cildi çıkarın ve kalvariyi açığa çıkarın.
5. Kafayı burun köprüsünden tutun ve lambdoid sütür boyunca kalvariyi kesin. Parietal kemiklerin yanal kenarları boyunca kesin ve ön kısmı içerecek şekilde genişletin.
6. Kalvariyi altta yatan beyin dokusundan ayırın.
   NOT: Minimal yumuşak doku ekine sahip temiz bir kemikli kalvari sağlamak için kemiğin derinliklerine kesilmemelidir; referans olarak, kemiğin altındaki makasın gölgesini görebilmelidir.
7. Kalvariyi fosfat tamponlu saline aktarın (protokol boyunca PBS, pH 7.4). İçbükey kısmın yukarı baktığından emin olun.

2. Yenidoğan fare kalvarisinin fraksiyonasyonu

1. 5 mL 2 mg/mL kollajenaz çözeltisi içeren 50 mL'lik bir konik tüpe 5 kalvariye kadar aktarın. Kullanımdan hemen önce hazırlanan taze kollajenaz çözeltisini kullanın.
   1. Taze bir kollajenaz çözeltisi hazırlamak için, 2 mg / mL'de izolasyon tamponuna (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM sorbitol,₃ mM K 2 HPO₄, 1 mM CaCl₂, 1 mg / mL sığır serum albümini (BSA), 5 mg / mL glikoz ve 25 mM HEPES) kollajenaz tozu ekleyin. Kollajenaz tozunu manyetik bir karıştırıcı üzerinde çözün.
   2. Kollajenaz çözeltisini 0,22 μm'lik steril bir filtre ünitesinden 50 mL'lik bir tüpe çalıştırın ve protokol boyunca buz üzerinde tutun.
2. Kesir 1'i elde etmek için kalvariyi 37 ° C'de 20 dakika boyunca 300 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
3. Fraksiyon 1'in sindirimini atın, kalvariyi 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve yıkamayı atın.
4. PBS'de 1 mg/mL BSA içeren 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 15 dakika boyunca 37 °C'de PH 7.4 içeren 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içindeki kalvariyi inkübe edin.
5. Sindirimi 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın. Kalvariyi 5 mL PBS ile yıkayın ve yıkama solüsyonunu sindirime ekleyin.
   NOT: Sindirimin toplanması ve yıkanmasının her noktasında, hücreleri kemikten ayırmak ve çiftleri ve hücre agregalarını önlemek için kemikleri çözeltilerinde pipetleyin.
6. Fraksiyon 2'yi elde etmek için, sindirimi 5 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'de santrifüj edin. Süpernatanı atın, peleti% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 IU / mL penisilin G ve 100 μg / mL streptomisin içeren 8 mL α-Minimum Esansiyel Ortamda (MEM) tekrar askıya alın. 10 cm'lik bir kültür kabına tohumlayın. Fraksiyon 2'yi 37 ° C'de% 5 CO₂ altında inkübe edin.
7. Kalvariyi 37 ° C'de 5 mL kollajenaz çözeltisi içinde 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 20 dakika boyunca inkübe edin.
8. Kesir 3'ü toplamak için 2.5\u20122.6 adımlarını yineleyin. Fraksiyon 3'ü 37 °C'de %5 CO₂ altında inkübe edin.
   NOT: Bu noktada kemikler küçülecek ve parçalara ayrılacaktır. Hiçbir kemiğin yanlışlıkla sindirimlere aspire edilmemesini ve bu da süreçte hücre kaybına yol açmamasını sağlamak için, özetleri toplamak için küçük bir uç pipeti kullanın (1000\u2012200 μL pipet uçları).
9. Kalvariyi 37 ° C'de 5 mL kollajenaz çözeltisi içinde 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 20 dakika boyunca inkübe edin.
10. Kesir 4'ü toplamak için 2.5\u20122.6 adımlarını yineleyin. Fraksiyon 4'ü 37 °C'de %5 CO₂ altında inkübe edin.
11. Kalvariyi, PBS'de (pH 7.4) 1 mg/mL BSA içeren 5 mL 5 mM EDTA'da, 37 °C'de 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 15 dakika boyunca inkübe edin.
12. Kesir 5'i toplamak için 2.5\u20122.6 adımlarını yineleyin. Fraksiyon 5'i 37 °C'de %5 CO₂ altında inkübe edin. Osteositler aynı gün sıralama için hazırlanabilir veya sıralamadan önce 24 saate kadar kültürlenebilir.

3. Floresan aktive hücre sıralaması için osteositlerin hazırlanması

1. Her hücre fraksiyonunun ortamını aspire edin ve iki kez 10 mL PBS ile nazikçe yıkayın.
2. PBS'ye 5 mL% 0.5 Tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri nazikçe ayırmak için 5 mL% 10 FBS α-MEM ve pipet ekleyin. Her fraksiyondaki hücreleri, 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne eleyerek birleştirin.
3. Hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne elenerek toplayın. Hücreleri 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
4. Süpernatantı aspire edin ve pelete% 10 FBS α-MEM ekleyin. Hücre konsantrasyonunu yaklaşık 1 x 10⁷ hücre/mL'ye ayarlayın.
5. Hücreleri 35 μm naylon ağ kapaklı bir tüpte filtreleyin. Hücreler artık FACS için hazırdır.
6. Bu protokol için 100 μm boyutunda bir nozul kullanın. Toplama sıvısı %10 FBS α-MEM'den oluşmalıdır. Numuneyi karıştırma sırasında ve mümkünse sıralama boyunca 4 °C'de tutun.
7. Sıralamadan önce, yan saçılma (SSC) alanını ve ileri saçılma (FSC) alanını ayarlayarak yapıları ve hücreleri kaldırmak için geçidi en iyi duruma getirin. SSC genişliğini SSC-Yüksekliğine ve FSC alanını FSC-genişliğine göre ayarlayarak çiftleri ortadan kaldırın. GFP-negatif osteositler, sıralama cihazının parametrelerini ayarlamak için bir kontrol olarak kullanılmalıdır.
8. Hücre toplama işlemi tamamlandıktan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'de santrifüj edin. PBS ile hücreleri yıkayın. Hücreleri 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
9. Hücreleri yeniden askıya alın ve %10 FBS α-MEM kullanarak sayıyı istediğiniz gibi ayarlayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu protokolün amacı, kalsiyum şelasyonu için kollajen matriksini ve EDTA'yı parçalamak için kollajenaz kullanan bir fraksiyonasyon işlemi yoluyla dmp1-topaz yenidoğan fare kalvarisinden primer osteosit kültürlerinin elde edilmesi sürecini göstermektir, bundan sonra hücreler FACS'ın osteositleri diğer hücre popülasyonlarından ayırması için hazırlanır.

Yenidoğan fare kalvarisinden primer osteositler elde etme yöntemleri genellikle^23'ü sıralamak...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

İlk izole osteosit, (OB7.3) veya PHEX'in kuş düşmanı varyantı kullanılarak izole edilen bir tavuk calvaria 7'dendi; Bununla birlikte, bu yöntem, uygulanabilir antikorların mevcudiyeti ile sınırlıdır, çünkü aynı zamanda türe özgü olan osteosit spesifik antikorların üretilmesi gerekir. Araştırmacılar, fare ve sıçan uzun kemiklerinden osteositler elde etmek için sıralı enzimatik işlemin farklı bir modifikasyonunu kullandılar; Bu kültürlerin bildirilen saflığı yak...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSDiva software	BD Biosciences		Data aquisition and analysis
BD Falcon Tube	BD Biosciences	352235	12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, MO, USA
Collagenase	Wako, Osaka, Japan	034-22363	0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.
EDTA	Dojindo, Kumamoto, Japan		5mM EDTA prepared with 0.1% BSA
FACSAriaTM II	BD Biosciences
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest, Nuaillé, France
Isolation buffer			70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES
Millex Sterile Filter Unit	Merck Millipore, Ireland	SLGV033RS	0.22μm
Nylon cell strainer	FALCON, NY, USA		40μm
Trypsin-EDTA	Life Technologies, NY, USA		0.5% x10. diluted to x1 in PBS
α-MEM	Wako, Osaka, Japan		Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin