Gewinnung primärer Osteozyten durch murine Schädelstockfraktionierung von GFP-exprimierenden Osteozyten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von neonatalen dmp1-Topas-Mausschädeln und die Isolierung von Osteozyten, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, durch Zellverdau und Fraktionierung sowie die Osteozytenpräparation für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS).

Zusammenfassung

Der Ostezyt, von dem man einst annahm, dass er ein passiver Bewohner des Knochens ist, da er hinter den Kulissen die Funktion hat, mechanische Belastungen zu erfassen, wird nun ins Rampenlicht gerückt und es hat sich gezeigt, dass er mehrere Hauptfunktionen hat, wie z. B. die aktive Modifikation der extrazellulären Matrix und die Bildung eines endokrinen Organs mit dem lakunokanalikulären System, das es umschließt, das Nachrichten an entfernte Orte sendet. Dank der Methoden, die es ermöglichten, den Osteozyten in vitro zu testen, von der Isolierung primärer Osteozyten bis hin zu osteozytenähnlichen Zelllinien, erfahren Osteozyten heute ein durchschlagendes Interesse und einen Wissensschub über Struktur und Funktion. Viele Aspekte der Osteozytenbiologie und der Wechselwirkung mit anderen molekularen Komponenten sind noch nicht entdeckt. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die effiziente Isolierung von primären Osteozyten aus dmp1-topas-neonatalen Mausschäumen, die das grün fluoreszierende Protein in Osteozyten exprimieren, durch Zellfraktionierung und anschließenden Erwerb von Kulturen primärer Osteozyten mittels FACS.

Einleitung

Osteozyten sind terminale differenzierte Zellen aus osteoblastischen Vorläuferzellen, die in ihre sezernierte Matrix eingebettet wurden¹. Sie sind die am häufigsten vorkommenden und langlebigsten Zellen unter den Knochenzellpopulationen. Sie befinden sich in Lakunen und haben eine charakteristische Sternmorphologie mit Dendriten, die sich durch Kanäle erstrecken, die als Canaliculi bezeichnet werden und ein ausgedehntes Netzwerk der Kommunikation und des Stoffwechselaustauschs mit ihrer Umgebung und der Knochenoberfläche bilden². Osteozyten choreografieren sowohl die Rolle von Osteoblasten als auch von Osteoklasten beim Knochenumbau, sie sind die primären mechanosensorischen Zellen, die die Anpassung an mechanische Belastungen gewährleisten³, sind an der Phosphathomöostase⁴ und der Knochenmatrixmineralisierung⁵ beteiligt und fungieren zusammen mit dem lakunokanalikulären System als endokrines Organ, das entfernte Gewebe signalisiert⁶.

Osteozyten befinden sich in einer mineralisierten Matrix, was die Zugänglichkeit einschränkt und ihre Isolierung erschwert, was die In-vitro-Untersuchung erschwert. Eine der ersten Isolierungsmethoden beschrieb isolierte Osteozyten aus Hühnerschädeln unter Verwendung eines osteozytenspezifischen monoklonalen Antikörpers (OB7.3)⁷ , von dem später bekannt wurde, dass es sich um die aviäre Variante von PHEX (PHosphate-regulierendes Gen mit Homologie zu Endopeptidasen auf dem X-Chromosom⁾ handelte8. Andere Forscher verwendeten die sequentielle Verdauung von langen Knochen von Ratte⁹ oder Maus 10, um osteozytenreiche Fraktionen zu erhalten, bei denen die Reinheit der Osteozyten bei etwa⁷⁰ % ^lag9. Zu den Einschränkungen dieses Verfahrens gehört die suboptimale Reinheit von Kulturen, die neben Osteozyten auch mit anderen Zelltypen kontaminiert sind, und dass Osteozyten möglicherweise von anderen Zellen in Kultur überwachsen werden könnten, da Osteozyten die Fähigkeit zur Teilung verloren haben. Diese Herausforderungen schränken die Nutzbarkeit langfristiger Kulturen ein.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden verschiedene Osteozytenzelllinien entwickelt. Die MLO-Y4-Zelllinie¹¹ und die MLO-A5-Zelllinie¹² sind insbesondere die am weitesten untersuchten Zelllinien, die für die Untersuchung der Osteozyten im Frühstadium nützlich sind. Sie sind jedoch weniger nützlich für die Untersuchung der Signalübertragung reifer Osteozyten, da sie geringe Mengen an Sclerostin und FGF23¹³ exprimieren, die beide reife Osteozytenmarker sind. Andere Zelllinien, darunter IDG-SW3 14 und Ocy454¹⁵, exprimieren hohe Konzentrationen von Sclerostin und FGF23 und sind nützlich für die Untersuchung des späten Osteozytenstadiums. Zelllinien erweisen sich als nützliche Forschungswerkzeuge; Dennoch sind sie nicht ohne Einschränkungen, da sie die Biologie der Primärzelle nicht vollständig repräsentieren. Unterschiedliche Zelllinien repräsentieren unterschiedliche Entwicklungsstadien des Osteozytenreifespektrums, und Zelllinien repräsentieren nicht die Heterogenität der primären Osteozyten^16,17.

Um Reinkulturen von primären Osteozyten zu erhalten, nutzten die Forscher das cre-Mausmodell, in dem der 8-kb-dmp1-Promotor verwendet wird, um die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in Osteozyten zu steuern^18,19. Zwei transgene Mäuse (pOB-Col 2.3-GFP-cyan und DMP1-GFP-topaz) von Paic et ^al.19 und dmp1-topaz-transgene Mäuse von Nakashima et ^al.20 wurden verwendet, um Osteozytenpopulationen zu erhalten. Dabei nutzten sie die sequentielle Verdauung und das FACS von Osteozyten, die GFP exprimieren, um Kulturen von primären Osteozyten zu erwerben^19,20. Es konnte gezeigt werden, dass die Richtung von cre in der 10-kb dmp1-Reportermaus Ai9, die das tdTomato-Protein aktiviert, in Osteozyten, Osteoblasten, Muskeln und Zellen im Knochenmark vorhanden ist. Der 8-kb dmp1-Promotor hatte das gleiche Expressionsmuster, aber nur ein Teil der Osteoblasten und Knochenmarkzellen exprimierte das Protein, was darauf hindeutet, dass der 8-kb dmp1-Promotor spezifischer ist²¹. Trotzdem sollten Ergebnisse, die mit dem 8-kb-dmp1-Promotor erzielt wurden, mit Vorsicht interpretiert werden, und Genexpressionsprofile sollten routinemäßig unter Verwendung von Osteozyten- vs. Osteoblasten-spezifischen Markern erstellt werden, um sicherzustellen, dass die erhaltene Population von ausreichend hoher Reinheit ist.

Die Osteoklastenmarker OSCAR und Dcstamp wurden in hämatopoetischen nicht depletierten vs. depletierten Osteozytenpopulationen gefunden, was die Autoren zu der Schlussfolgerung führte, dass Verdauen, die durch Fraktionierung von 8-kb dmp1-topas neonatalen Calvaria und GFP-Sortierung erhalten wurden, mit hämatopoetischen Zellen kontaminiert sind. Die Kontamination mit hämatopoetischen Zellen hätte durch eine Straffung des GFP-Sortiertors gemildert werden können, da GFP-positive hämatopoetische Zellen eine relativ geringere GFP-Intensität aufwiesen als GFP-positive mesenchymale Zellen (Osteozyten)²².

Die Methoden zur Untersuchung von Osteozyten in vitro haben zu der jüngsten Fülle an Informationen über die Osteozytenbiologie beigetragen. Die Isolierung von Osteozyten ist jedoch nach wie vor ein arbeitsintensives und langwieriges Verfahren mit geringen Zellausbeuten. Die beschriebene Methode des Knochenaufschlusses unter Verwendung von Kollagenase und EDTA, oft bis zur Fraktion 8²³, dauert mehrere Stunden, in denen die Lebensfähigkeit der Osteozyten beansprucht wird. Forscher haben berichtet, dass Fraktionen (2\u20125) für die Zellsortierung 20 verwendet wurden, und haben gezeigt, dass das Expressionsprofil von Genen, die mit Osteozyten assoziiert sind, im Vergleich zu denen von Osteoblasten den Erfolg der Isolierung reiner Osteozytenpopulationen bestätigt²⁰. In diesem Artikel beschreiben wir den Prozess der Gewinnung von Fraktionen (2\u20125) und vergleichen die Ausbeute an Osteozyten aus jeder Fraktion, beginnend mit Fraktion 1 bis 8, um die Rückgabe von Osteozyten in jeder Fraktion zu bestimmen. Wir beschreiben auch die Präparation von neugeborenen dmp1-Topas-Mausschädeln und die Schädelstockverdauung mit Kollagenase und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) sowie die Vorbereitung von Zellen für FACS.

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Protokoll

Alle Tierbehandlungen und die Tierpflege wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der Tohoku-Universität durchgeführt.

1. Sektion der neugeborenen dmp1-Topas-Maus Calvaria

1. Verwenden Sie für dieses Protokoll 6 bis 7 Tage alte Welpen von C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J-Mäusen. Euthanasieren Sie Mäuse mit 5% Isofluran-Inhalation und setzen Sie die Welpen dann in 70% Ethanol um.
2. Übertragen Sie den eingeschläferten Welpen in eine unbehandelte Kulturschale.
3. Fassen Sie mit Schere und Pinzette die Haut an der Schädelbasis und machen Sie einen Schnitt.
4. Schneiden Sie mit dem ersten Schnitt als Ausgangspunkt auf beiden seitlichen Seiten des Schädels vor den Ohren, entfernen Sie die Haut und legen Sie die Schädeldecke frei.
5. Halten Sie den Kopf vom Nasenrücken und schneiden Sie die Schädeldecke entlang der Lambdoidnaht. Schneiden Sie entlang der seitlichen Ränder der Scheitelknochen und verlängern Sie sie bis zum vorderen Teil.
6. Trennen Sie den Schädeldach vom darunter liegenden Hirngewebe.
   Anmerkungen: Um eine saubere knöcherne Schädeldecke mit minimalem Weichteilansatz zu gewährleisten, schneiden Sie nicht tief in den Knochen ein. Als Referenz sollte man in der Lage sein, den Schatten der Schere unter dem Knochen zu sehen.
7. Übertragen Sie den Schädeldeckel in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4 während des gesamten Protokolls). Stellen Sie sicher, dass der konkave Teil nach oben zeigt.

2. Fraktionierung der Schädeldecke von neugeborenen Mäusen

1. Übertragen Sie bis zu 5 Calvariae in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 5 ml 2 mg/ml Kollagenase-Lösung. Verwenden Sie frische Kollagenase-Lösung, die kurz vor der Anwendung zubereitet wird.
   1. Zur Herstellung einer frischen Kollagenaselösung wird Kollagenasepulver in den Isolationspuffer (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM Sorbitol,₃ mM_K2HPO4, 1 mM CaCl 2, 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 5 mg/ml Glukose und 25 mM HEPES) mit₂ mg/ml gegeben. Das Kollagenase-Pulver auf einem Magnetrührer auflösen.
   2. Lassen Sie die Kollagenaselösung durch eine 0,22 μm sterile Filtereinheit in ein 50-ml-Röhrchen laufen und bewahren Sie sie während des gesamten Protokolls auf Eis auf.
2. Inkubieren Sie den Schädeldach bei 37 °C für 20 Minuten auf einem Schüttler bei 300 U/min, um Fraktion 1 zu erhalten.
3. Verwerfen Sie den Aufschluss von Fraktion 1, waschen Sie die Schädeldecke mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und entsorgen Sie die Wäsche.
4. Inkubieren Sie den Schädeldach in 5 ml 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit 1 mg/ml BSA in PBS, PH 7,4 bei 37 °C für 15 min auf einem Schüttler bei 300 U/min.
5. Sammeln Sie den Aufschluss in einem konischen 50-ml-Röhrchen. Waschen Sie den Golgatha mit 5 ml PBS und fügen Sie die Waschlösung dem Aufschluss hinzu.
   Anmerkungen: Pipettieren Sie die Knochen an jedem Punkt des Sammelns und Waschens in ihrer Lösung, um die Zellen vom Knochen zu lösen und Dubletten und Zellaggregate zu verhindern.
6. Um Fraktion 2 zu erhalten, wird der Aufschluss bei 300 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet erneut in 8 ml α-Minimum Essential Medium (MEM), das 10 % fötales Kälberserum (FBS), 100 I.E./ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin enthält. Auf einer 10 cm Kulturschale aussäen. Fraktion 2 bei 37 °C unter 5 % CO₂ inkubieren.
7. Inkubieren Sie die Schädeldecke in 5 ml Kollagenaselösung bei 37 °C für 20 min auf einem Shaker bei 300 U/min.
8. Um Bruch 3 zu erfassen, wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 2.6. Fraktion 3 bei 37 °C unter 5 % CO₂ inkubieren.
   HINWEIS: An diesem Punkt werden die Knochen kleiner und sie werden in Fragmente zerlegt. Um sicherzustellen, dass keine Knochen versehentlich in die Verdauungen abgesaugt werden, was zu Zellverlust führt, verwenden Sie eine kleine Spitzenpipette zum Auffangen der Verdauungen (1000\u2012200 μL Pipettenspitzen).
9. Inkubieren Sie die Schädeldecke in 5 ml Kollagenaselösung bei 37 °C für 20 min auf einem Shaker bei 300 U/min.
10. Um Bruch 4 zu erfassen, wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 6. Fraktion 4 bei 37 °C unter 5% CO₂ inkubieren.
11. Inkubieren Sie den Schädeldeckel in 5 ml 5 mM EDTA mit 1 mg/ml BSA in PBS (pH 7,4) bei 37 °C für 15 Minuten auf einem Schüttler bei 300 U/min.
12. Um Bruch 5 zu erfassen, wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 20122.6. Fraktion 5 bei 37 °C unter 5 % CO₂ inkubieren. Osteozyten können noch am selben Tag für die Sortierung vorbereitet oder bis zu 24 Stunden vor der Sortierung kultiviert werden.

3. Vorbereitung von Osteozyten für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung

1. Aspirieren Sie das Medium jeder Zellfraktion und waschen Sie es vorsichtig zweimal mit 10 ml PBS.
2. Fügen Sie 5 ml 0,5%iges Trypsin-EDTA in PBS hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 °C. Fügen Sie 5 ml 10% FBS α-MEM hinzu und pipettieren, um die Zellen sanft zu lösen. Kombinieren Sie die Zellen in jeder Fraktion, indem Sie sie durch ein 40-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen sieben.
3. Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS und sammeln Sie sie, indem Sie sie durch ein 40-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen sieben. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min.
4. Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie dem Pellet 10 % FBS α-MEM hinzu. Stellen Sie die Zellkonzentration auf ca. 1 x 10⁷ Zellen/ml ein.
5. Filtern Sie die Zellen in einem 35 μm dicken Röhrchen mit Nylonnetzverschluss. Die Zellen sind nun bereit für FACS.
6. Verwenden Sie für dieses Protokoll eine Düse mit einer Größe von 100 μm. Die Sammelflüssigkeit sollte zu 10 % aus FBS α-MEM bestehen. Halten Sie die zu sortierende Probe unter Rühren und wenn möglich bei 4 °C.
7. Optimieren Sie vor dem Sortieren das Gating, um Artefakte und Zellen zu entfernen, indem Sie den SSC-Bereich (Side Scatter) und den FSC-Bereich (Forward Scatter) anpassen. Eliminieren Sie Dubletten, indem Sie SSC-Breite vs. SSC-Höhe und FSC-Fläche vs. FSC-Breite anpassen. GFP-negative Osteozyten sollten als Kontrolle verwendet werden, um die Parameter des Sortierinstruments einzustellen.
8. Nachdem die Zellentnahme abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 10 Minuten. Waschen Sie die Zellen mit PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min.
9. Suspendieren Sie die Zellen erneut und passen Sie die Anzahl mit 10 % FBS-α-MEM wie gewünscht an.

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Ergebnisse

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, den Prozess der Gewinnung von Kulturen primärer Osteozyten aus dmp1-topaz neonatalen Mausschädeln durch einen Fraktionierungsprozess unter Verwendung von Kollagenase zum Abbau der Kollagenmatrix und EDTA für die Calciumchelation zu demonstrieren, wonach die Zellen für FACS vorbereitet werden, um Osteozyten von anderen Zellpopulationen zu trennen.

Methoden zur Gewinnung primärer Osteozyten aus neonatalen Mausschäumen beschreiben häufig die Verwe...

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Diskussion

Der erste isolierte Osteozyten stammte aus einer Huhn-Calvaria⁷ , die mit Hilfe von (OB7.3) oder der avianten Variante von PHEX isoliert wurde. Diese Methode ist jedoch durch die Verfügbarkeit von praktikablen Antikörpern begrenzt, da Osteozyten-spezifische Antikörper hergestellt werden müssen, die auch speziesspezifisch sind. Die Forscher verwendeten eine andere Modifikation des sequenziellen enzymatischen Prozesses, um Osteozyten aus langen Knochen von Mäusen und Ratten zu gewinnen. Die ber...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSDiva software	BD Biosciences		Data aquisition and analysis
BD Falcon Tube	BD Biosciences	352235	12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, MO, USA
Collagenase	Wako, Osaka, Japan	034-22363	0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.
EDTA	Dojindo, Kumamoto, Japan		5mM EDTA prepared with 0.1% BSA
FACSAriaTM II	BD Biosciences
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest, Nuaillé, France
Isolation buffer			70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES
Millex Sterile Filter Unit	Merck Millipore, Ireland	SLGV033RS	0.22μm
Nylon cell strainer	FALCON, NY, USA		40μm
Trypsin-EDTA	Life Technologies, NY, USA		0.5% x10. diluted to x1 in PBS
α-MEM	Wako, Osaka, Japan		Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin