JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Özgürce davranan sıçanlarda akut ve kronik deneysel tik ekspresyon modelleri üretmek için protokoller sunuyoruz. Modeller striatal kanül implantasyonu ve sonraki GABAA antagonist uygulamasına dayanmaktadır. Akut model geçici enjeksiyonlar kullanırken, kronik model deri altı implante edilmiş bir mini-ozmotik pompa aracılığıyla uzun süreli infüzyonlar kullanır.

Özet

Motor tikler Tourette sendromunun ve diğer tik bozukluklarının temel belirtileri olan ani, hızlı, tekrarlayan hareketlerdir. Tik kuşağının patofizyolojisi bazal gangliyonun anormal inhibisyonu ile ilişkilidir, özellikle birincil giriş yapısı olan striatum. Hem kemirgenlerin hem de insan olmayan primatların hayvan modellerinde, gabaA antagonistlerinin, bikükülin ve pikrotoksin gibi yerel uygulamaları, striatumun motor kısımlarına yerel disinhibisyona neden olur ve motor tiklerin ifade edilir.

Burada sıçanlarda akut ve kronik motor tik modelleri sunuyoruz. Akut modelde, dorsal striatuma yerleştirilen bir kanül yoluyla biküküllin mikroenjections, bir saate kadar kısa süreler süren tiklerin ekspresyonunu ortaya çıkarır. Kronik model, tik ekspresyonunun birkaç gün hatta hafta dönemlerine uzatılmasını sağlayan, bir alt kese altı mini ozmotik pompa aracılığıyla biküküllin sürekli infüzyonunu kullanan bir alternatiftir.

Modeller, kortiko-bazal gangliyon yolu boyunca tik kuşağının davranışsal ve sinirsel mekanizmalarının incelenmesini sağlar. Modeller, enjeksiyon kolaylarına ek olarak ek kayıt ve stimülasyon cihazlarının implantasyonunu destekler, böylece elektrik ve optik stimülasyon ve elektrofizyolojik kayıtlar gibi çok çeşitli kullanımlara izin verir. Her yöntemin farklı avantajları ve eksiklikleri vardır: akut model, hareketin kinematik özelliklerinin ve buna karşılık gelen elektrofizyolojik değişikliklerin tik ekspresyonu öncesi, sırasında ve sonrasında karşılaştırılması ve kısa süreli modülatörlerin tic ekspresyonu üzerindeki etkilerinin karşılaştırılmasına olanak tanır. Bu akut modelin kurulması kolaydır; ancak, kısa bir süre ile sınırlıdır. Kronik model, daha karmaşık olmakla birlikte, uzun süreler boyunca tik dinamiği ve davranışsal etkilerin tik ekspresyolu üzerinde incelenmesini mümkün kılar. Bu nedenle, ampirik sorgu türü, bu iki tamamlayıcı tic ifade modeli arasındaki seçimi yönlendirir.

Giriş

Tikler Tourette sendromunun (TS) ve diğer tik bozukluklarının belirleyici belirtisidir. Tikler ani, hızlı, tekrarlayan hareketler (motor tikler) veya vokalizasyonlar (vokal tikleri)1olarak tanımlanır. Tic ifadesi genellikle zamansal (frekans)2 ve uzamsal (yoğunluk, vücut konumu)3 özelliğinde birden çok zaman ölçeğinde (saat, gün, ay ve yıl) dalgalanır. Bu değişiklikler, çevresel özellikler 4,5 , davranış durumları6,7ve gönüllü ve geçici bastırma8gibi farklı faktörlerden etkilenir.

Motor tikleri yöneten nöronal mekanizma hala tam olarak anlaşılamasa da, giderek artan sayıda teorik ve deneysel çalışma doğasına dair yeni kanıtlar sağlamıştır9. Şu anda, tic kuşağının patofizyolojisinin kortiko-bazal gangliyon (CBG) döngüsünü içerdiği düşünülmektedir ve özellikle striatumun anormal inhibisyonu ile ilişkilidir, birincil bazal gangliyon giriş çekirdeği10,11,12. Kemirgenler ve primatlarda yapılan önceki çalışmalar, striatumun bikükülin ve picrotoksin 13 ,14 , 15 , 16,17,18gibi farklı GABAA antagonistlerinin lokal uygulaması ile sınır dışı edilebileceğini göstermiştir. Bu farmakolojik müdahale, enjeksiyonun kontrallateral tarafında geçici motor tik ekspresyonuna yol açar, böylece yüz ve yapı geçerliliği olan tik bozukluklarının sağlam bir akut modelini oluşturur. Akut modelin indüklenmesi kolaydır ve elektriksel ve optik stimülasyon gibi kısa süreli modülasyonun etkilerinin elektrofizyolojik ve kinematik kayıtlarla eşzamanlı olarak tik ekspresyonu öncesinde, sırasında ve sonrasında incelenmesini mümkün kılar. Ancak akut model enjeksiyonu takip eden kısa süre ile sınırlıdır. Akut modele dayanarak, son zamanlarda sıçanlarda, deri altı implante edilmiş bir mini-ozmotik pompa19aracılığıyla striatum için biküküllin uzun süreli, sabit oranlı infüzyonunu kullanan kronik bir tik üretimi modeli önerdik. Bu model, tic ifade süresini birden çok güne/haftaya genişletir. Biküküllin'in uzun bir süre boyunca sürekli salınması, farmakolojik tedaviler ve davranışsal durumlar gibi çeşitli faktörlerin tik ekspresyonu üzerindeki etkilerinin incelenmesini sağlar.

Burada, sıçanlarda akut ve kronik tik ekspresyon modellerini üretmek için protokoller sunuyoruz. Özel araştırma sorusunun bir fonksiyonu olarak, protokoller tek taraflı ve bilateral implantasyon, tiklerin yeri (striatumun somatotopik organizasyonuna göre)18 ve implant-canül açısı (ek implante cihazların konumuna bağlı olarak) dahil olmak üzere parametrelerin ince ayarını sağlar. Kronik modelde kullanılan yöntem kısmen ticari ürünlere dayanmaktadır, ancak tic modeline uyacak kritik ayarlamalarla. Bu makalede, bu tic modellerini özel olarak uyarlamak için gereken ayarlamalar ayrıntılı olarak ayrıntılı olarak yer alıyor.

Protokol

Tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve denetlenmiş ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi ve Araştırmada Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı için Bar-Ilan Üniversitesi Yönergeleri'ne bağlı kalınmıştır. Bu protokol, Sağlık Bakanlığı Laboratuvar Hayvanlarında Deneyler Ulusal Komitesi tarafından onaylandı.

NOT: Bu protokolde 3-10 aylık, 280-350 g yaş arası dişi Long-Evans sıçanları (akut ve kronik modeller) ve dişi Sprague Dawley sıçanları (akut model) kullanılmaktadır. Bu modellerin diğer suşlarda, ağırlıklarda veya yaşlarda uygulanması farklı reaksiyonlar için dikkatlice test edilmelidir.

1. Akut model

  1. Ameliyat öncesi hazırlık
    1. İmplant-canül hazırlığı
      NOT: İmplant-canül, striatum içine lokal bikükülin enjeksiyonları sağlar.
      1. İmplant kanül elde etmek için paslanmaz çelik, 25 G (OD 0.02'', ID 0.015'') hipo-tüp kesin (Şekil 1, cihaz #1). Düz kenarlara ulaşmak için bir döner alet kullanın. Küllerin uzunluğu implantasyon hedef derinliğine, damar implantasyon açısına ve son çimentolu kapak yüksekliğine bağlıdır. Doku hasarını önlemek için implantasyon hedef derinliğinin son enjeksiyon hedefinden 2 mm (0,079'' daha yüksek olması gerekir.
        NOT: Yerleştirilen en yüksek nesne kapak yüksekliğini belirler.
      2. İmplant kanül kenarlarını kumlayın ve pürüzsüzleştirin, beyne ek mekanik sürtünmeyi önleyin. İç engelleri gidermek için içine 30 G (0,01'') iğne yerleştirin.
    2. Kukla hazırlama
      NOT: Kukla, implante edilen canül içine yerleştirilen çıkarılabilir bir iç teldir. Kukla, implante edilen kanülü mühürler, böylece tıkanıklığını önler.
      1. Bir döner aletle 0.013'' teli keserek bir kukla yapın. Kukla implant-canül uzunluğundan 3 mm (0.118'') daha uzun olmalıdır(Şekil 1, cihaz #2).
      2. Kuklayı sonuna ulaşana kadar implant-canül içine yerleştirin. Fazla teli kanüle sıkıştırarak bükün. Bükülmüş kısım, kuklanın implante kanülden düşmesini önlemek ve sıçanın çıkarmasını önlemek için implant-kanül ile yıkanmalıdır.
    3. Enjektör hazırlığı
      NOT: Esnek bir tüp ve enjeksiyon-kanından oluşan enjektör (Şekil 1, cihaz #3), striatum içine doğrudan bikükülin enjeksiyonu sağlar.
      1. 70 cm (27.559'') esnek polimer mikrobore tüpü kesin (OD 0.06'', ID 0.02'') (Şekil 1, cihaz #3.1).
        NOT: Esnek tüpün uzunluğu, deneysel kafes ile infüzyon pompası makine konumu arasındaki mesafe ile tanımlanır. Sıçanın içine dolanmasını önlemek için enjeksiyon döneminde sıçanın serbest dolaşımını sağlayacak kadar uzun olmalıdır, ancak çok uzun olmamalıdır (bkz. Şekil 3A).
      2. Enjeksiyon kanül elde etmek için paslanmaz çelik, 30 G (OD 0.012'', ID 0.007''') hipo-tüp kesin (Şekil 1, cihaz #3.2). Düz kenarlara ulaşmak için bir döner alet kullanın. İmplant kanülünden 5 mm (0,197'') daha uzun: son enjeksiyon hedefine ulaşmak için beyin içindeki implante kanülden 2 mm (0,079'') daha uzun ve esnek tüpe yerleştirmek için 3 mm (0,118'') ölçülmelidir.
      3. Enjeksiyon kanüllerinin ucunu kumlayın ve pürüzsüzleştirin, beyne ek mekanik sürtünmeyi önleyin. Engelsiz olduğunu doğrulamak için 0.005'' çapında bir tel takın.
      4. Enjeksiyon-kanın 3 mm'lik (0.118'') bir enjektör elde etmek için esnek tüpe yerleştirin ve eklemi aralarında yapıştırın. Siyanoakrilat (CA) tutkal ve CA hızlandırıcı kullanın.
      5. Enjektöre steril su ile doldurulmuş 25 G iğneli (0.018'') bir şırınga takın ve yıkayın. Bu, enjeksiyon-canülden çıkan akış yönünün düz ve zahmetsiz olmasını sağlar. En önemlisi, akış düz değilse, herhangi bir tıkanıklığı gidermek ve enjeksiyon kanül deliğini büyütmek ve akışı yeniden doğrulamak için 30 G (OD 0.01'') iğne ucunu kullanın.
    4. Ül tutucu preparat
      NOT: Kavun tutucu stereotaksik kola bağlanır ve implantasyon sırasında implant damarını tutar. Ül tutucu, birbirine yapıştırılanül tutucu taban ve canül tutucu kurşundan oluşur(Şekil 1, cihaz #4). İmplantasyon sırasında, kavun tutucu taban stereotaksik kola ve kavun tutucu kurşun implant-canüle bağlanır.
      1. Kanül tutucu taban: 10 cm (3.947'') paslanmaz çelik, 22 G (OD 0.028'', kimlik 0.017'') hipo-tüp kesin(Şekil 1, cihaz #4.1).
      2. Ül tutucu kurşun: 0.013'' teli istenen implant-canülden 3 mm (0.118'') daha uzun bir uzunluğa kesin (Şekil 1, cihaz #4.2).
      3. Kanolan tutucu kurşunu, ca tutkal ve CA hızlandırıcı kullanarak, kanolan tutucu tabanına yerleştirin ve eklemi aralarında yapıştırın. İmplantasyon sırasında doku hasarını önlemek için kurşun implant-canülden 1 mm (0.039'' daha kısa olmalıdır.
    5. Bikükülin preparatı: biküküllin metiyoditini fizyolojik salin veya yapay beyin omurilik sıvısında (ACSF) 1 μg/ μL'lik son konsantrasyonda çözün. Çözünmüş bikükülliyi 1 mL şırınna bölün, alüminyum folyo ile örtün ve ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de dondurun. Gerektiğinde, kullanmadan önce şırınnayı çözün.
  2. ameliyat
    1. Sıçanı tasarlanmış bir odaya yerleştirerek ilk anesteziyi başlatın ve 0,5-1 L / dk oranında bir oksijenle karıştırılmış% 4-5 izofluran verin. Daha sonra sıçan intramüsküler (IM veya IP) Ketamin ve Klazine (sırasıyla 100 ve 10 mg/ kg) karışımı enjekte edin.
    2. Elektrikli bir makas kullanarak farenin kafasını tıraş edin.
    3. Farenin kulaklara lidokin jeli koyun. Kornea kurumasını ve travmayı önlemek için farenin gözlerine petrol jölesi koyun.
    4. Sıçanı kulak çubukları ve diş çubuğu kullanarak stereotaktik çerçevede sabitleyin.
    5. Bölgeyi sterilize etmek için sıçanın kafa derisini povidone iyot ve ardından alkol mendili ile sürün. Deri altı (SC) olarak % 0,5 - 1 lidokin çözeltisi ile istenen kesi hattı boyunca sızın. Neşter bıçağı kullanarak, kafa derisi boyunca bir kesi yapın.
    6. Cerrahi bölgeyi açmak için fasyayı kenarlara doğru çekin.
    7. Kafatasını pamuklu çubuklar kullanarak steril salin ile temizleyin. Kanama durumunda, kan kılcal damarını dağlamak için bir kouterizer kullanın. Bu adım zaman içinde kapak stabilitesi için çok önemlidir.
    8. Fasyayı cerrahi bölgeyi büyütmek için dört kavisli hemostat (iki ön, iki posterior) ile kenetleyin.
    9. Bregma ve lambda koordinatlarını ölçün. İki noktanın dorsoventral (DV) koordinatlarını 100 μm aralığında olacak şekilde seviyelendirme yapın.
    10. Stereotaksik cihazı kullanarak, ilgi alanlarının ve implante edilecek ankraj vidalarının koordinatlarını ölçün ve işaretleyin. Ön ayak bölgesindeki tik indüksiyonu için düz implantasyonlu canül koordinatları şunlardır: AP: +1 ila +1.5, mL: ±2.5, DV: 3; hindlimb alanı: AP: -0.4 ila -0.5, mL: ±3.5, DV:318,20.
      NOT: Kanüllerin düz implantesini önleyen birden fazla cihazın implantasyonu durumunda, kanül implantasyon açısını ve koordinatlarını buna göre değiştirin (ön ayar koordinatları: AP: +2.7, mL: ±2.5, DV: 3, açı 15° önden posteriora).
    11. Mikroskop altında kafatasında delikler açın. 1/4-1/2 bit boyutunda karbür yuvarlak burslu bir diş matkap makinesi kullanın. Beyin hasarı risklerini en aza indirmek için matkap hızını delme becerilerine göre ayarlayın ve herhangi bir mekanik basınçtan kaçının. Beyin görünene kadar yaklaşık 1 mm boyunca delin. Pamuklu çubukla herhangi bir kanı emin ve steril salinle yıkayın.
      NOT: Ankraj vidaları kapağı stabilize etmeye yarar. Vidaların hem yarımkürelerde hem de ön-arka eksen boyunca bulunduğundan emin olun.
    12. Canül implantasyonu
      1. Çapa vidalarını deliklere vidala. Paslanmaz çelik #0 x 1/8 boyutlu vidalar kullanın.
        NOT: Ankraj vidalarının sayısı, yerleştirilen cihazların toplam sayısına bağlıdır. Zemin vidaları (örneğin elektrik kayıtları veya elektriksel stimülasyonlar için) beyin yüzeyine ulaşmalıdır.
      2. Kavun tutucuyu stereotaksik kola takın.
      3. İmplant-canül'u kalıp tutucusuna kaydırın. İmplant kanüllerini beyne ulaşana kadar yavaşça deliğin üzerine yerleştirin.
      4. Beyin yüzeyinden başlayarak DV koordinatlarını ölçün. İmplant kanüllerini implantasyon hedefine kadar dirakle. Delikten çıkan herhangi bir kanı pamuklu çubukla emer, steril salinle yıkayın ve iyice kurulayın.
      5. Yerleştirilen canülleri jel tutkal kullanarak kafatasına yapıştırın. Kuruyana kadar bekleyin.
      6. Kafatasına takmak için implante edilmiş canül boyunca diş çimentosu uygulayın. Sahte yerleştirmeyi etkinleştirmek için üst ucundan 2 mm (0,079'') uzatın. Kuruyana kadar bekleyin.
        NOT: Konserve tutucuya çimento koymayın.
      7. İmplant edilen canülü yerinde bırakarak, kalıp tutucuyu kaldırın.
      8. Kuklayı implante edilmiş canüle yerleştirin.
      9. Kayıt dizileri, optik lifler, stimülasyon elektrotları vb. Tüm implantları kaplaarak kafatasının geri kalanına diş çimentosu uygulayın.
      10. 3 mL oda sıcaklığında Ringer çözeltisi ve carprofen 5 mg/kg SC21enjekte edin.
      11. Sıçanı kendine gelene kadar izleyin (hayvan diktir, hava yolunu kontrol eder ve aspirasyon tehlikesi yoktur). Fareyi tamamen iyileşmek için ev kafesine geri koyun.
  3. Mikroinjections
    NOT: Enjeksiyon sırasında, biküküllin akışının sağlam olduğunu doğrulamak çok önemlidir. Bu, enjektörde küçük bir hava kabarcığı oluşmasına izin vererek ve hareketini izleyerek yapılabilir. Enjektörün kalan hacmi salin ile doldurulabilir, böylece bikükülin boşa harcanmaz.
    1. Enjektörü 25 G iğneli biküküllin şırıngasına takın (OD 0.018''). Enjektörün ~1/3-1/2'sini doldurun ve şırınd'ı çıkararak küçük bir hava kabarcığı oluşmasını sağlar.
    2. Enjektörü 25 G iğne ile steril salin dolu bir şırıngaya takın (OD 0.018''). Enjektörü biküküllin sona ulaşana ve içinden küçük bir damla çıkana kadar doldurun.
    3. 10 μL hassasiyetli cam mikrosirenin pistonunun sökün.
    4. Hassas cam mikrosyringe kısa esnek bir polimer tüpü (~3 cm, 1.181'') kesin ve takın.
    5. Kısa esnek tüpün diğer ucunun steril suyla dolu 1 mL şırınga, 25 G iğne (OD 0.018'') ile bağlayın.
    6. Kısa esnek tüpten hassas cam mikrosyringe su çıkana kadar su enjekte edin. Kısa esnek tüpü çıkarın.
    7. Pistonu hassas cam mikrosyringe üzerindeki ~7 μL işaretine ulaşana kadar yeniden takın.
    8. Hassas cam mikrosyringe'i infüzyon pompa makinesindeki hedeflenen yuvaya yerleştirin.
    9. Enjektörü hassas cam mikrosireye takın ve ayarları 0,35 μL/ dk hıza ve toplam 0,35 μL hacme yapılandırır.
    10. Enjektör ucunun altına kağıt mendil koyun. Enjektördeki hava kabarcığı konumunu işaretleyin, infüzyon pompa makinesini çalıştırın ve bikükülin damlasının göründüğünü doğrulayın. Enjeksiyondan sonra, hava kabarcığı konumunu tekrar işaretleyin.
      NOT: İki işaret arasındaki fark, deneysel enjeksiyon sırasında istenen farka karşılık gelir.
    11. Sıçanı deneysel kafese koyun ve kuklayı çıkarın.
    12. Enjektörü implante edilmiş kanın içine ucundan yerleştirin (bkz. Şekil 3A).
    13. infüzyon pompa makinesini çalıştırın. Hava baloncuğunun hareket ettiğini doğrulayın. Tic başlatma ve sonlandırma sürelerini takip etmek için kronometreyi başlatın.
    14. Enjeksiyonu takip etti bir dakika sonra enjektörü çıkarın ve kuklayı yavaşça yeniden takın.
      NOT: Enjeksiyondan sonra kuklanın yerleştirilmesi bikükülliyi enjeksiyon hedefine iter.
  4. Enjeksiyon sonrası
    1. Enjektörü hassas cam mikrosyringe ile çıkarın.
    2. Kalan çözeltiyi hava dolu bir şırınna kullanarak enjektörden yıkayın. Enjektörü steril suyla temizleyin ve ardından enjektörden hava enjekte ederek boşaltın.
    3. Hassas cam mikrosyringe infüzyon pompa makinesinden çıkarın ve steril su ile temizleyin.

2. Kronik model

  1. Ameliyat öncesi hazırlık
    1. Ül kılavuz hazırlığı
      NOT: Kanül kılavuzu infüzyon tüpünün bir parçasıdır ve implantasyon sırasında infüzyon kanülünü kanül tutucuya takmak için kullanılır.
      1. Kanül kılavuzu elde etmek için 12 mm (0,472'') paslanmaz çelik, 25 G (OD 0,02'', ID 0,015'') hipo-tüp kesin (Şekil 2, cihaz #1). Düz kenarlara ulaşmak için bir döner alet kullanın.
      2. Adım 1.1.4'te açıklandığı gibi birül tutucu hazırlayın. Düzgün bir şekilde takıldığından emin olmak için cannula tutucuyu cannula kılavuzuna yerleştirin ve çıkarın.
    2. infüzyon-kanül hazırlığı
      NOT: infüzyon kanülü de infüzyon tüpünün bir parçasıdır. Striatumun son hedefine yerleştirilir ve biküküllin odak infüzyonuna izin verir.
      1. İnfüzyon kanül elde etmek için paslanmaz çelik, 30 G (OD 0.012'', ID 0.007''' hipo-tüp kesin. Düz kenarlara ulaşmak için bir döner alet kullanın. Toplam infüzyon-kanül uzunluğu, istenen implantasyon derinliğinin toplamı artı bir güvenlik faktörüdür (~1-2 mm, 0.039'-0.079''), infüzyon-kanül bükülmüş kısım (2 mm, 0.079''), kanül kılavuzu (3 mm, 0.118'') ve yatay kısım (4 mm, 0.157'') ile örtünme(Şekil 2, cihaz #2).
        NOT: Akut modelin aksine implantasyon derinliği son infüzyon hedefine eşittir.
      2. infüzyon kanüline 0.005'' çapında bir tel yerleştirin ve bunları hedeflenen konumda bir L şekline bükün. Dikey kısım istenen implantasyon derinliği artı 4-5 mm (0.157'-0.197'') ve yatay kısım 4 mm (0.157'') uzunluğundadır.
        NOT: İç telin takılması, bükme sırasında kanüllerin tıkanmasını önler.
    3. Esnek kateter-boru hazırlığı
      NOT: Aynı zamanda infüzyon tüpünün bir bileşenidir. infüzyon kanülünü bir boru adaptörü ile mini ozmotik pompaya bağlar.
      1. 8 cm (3.149'') polietilen (PE)-10 boru (ID 0.011'', OD 0.025'') kesin (Şekil 2, cihaz #3).
        NOT: Kateterin uzunluğu, implantasyon hedefi ile pompa konumu arasındaki mesafeye göre belirlenir ve sıçanın başının ve boynunun serbest dolaşımını sağlar (bkz. Şekil 3B).
    4. infüzyon tüpünün montajı
      NOT: infüzyon tüpü bikükülini mini ozmotik pompadan beyne iletir. Kanül kılavuzu, infüzyon-kanül, esnek kateter-boru, boru adaptörü ve akış moderatörü(Şekil 2)oluşur.
      1. İç teli infüzyon kanülden çıkarın. Kenarlarının her iki tarafta da açık ve temiz olduğundan emin olmak için mikroskop altındaki kanı inceleyin; değilse, açmak için 30 G (OD 0.01'') iğne kullanın.
      2. Kanül kılavuzunu, CA tutkal ve CA hızlandırıcı kullanarak, bükülen parçanın yakınında, 3 mm (0,118'') örtüşme üzerine, infüzyon kanüllerinin dikey bölümüne yapıştırın.
      3. infüzyon kanüllerinin yatay kısmını esnek kateter tüpüne yerleştirin. Çakışma en az 2 mm (0,079'' olmalıdır.
      4. Pompa akış moderatörünün yarı saydam kapağını dışarı çıkar. Bu, kısa paslanmaz çelikül tüpünü ortaya çıkardı(Şekil 2, cihaz #5.1).
        NOT: Akış moderatörü mini ozmotik pompa kitinin bir parçasıdır. Yarı saydam bir kapak, kısa bir kanül parçası, beyaz bir flanş ve uzun bir kanül parçasından oluşur. Uzun cannula parçası mini-ozmotik pompaya yerleştirilir ve kısa cannula kısmı kateter tüpüne boru adaptörü ile bağlanır.
      5. Boru adaptörünü(Şekil 2, cihaz #4) % 70 alkole batırın. Malzemenin şişmesine izin vermek için birkaç dakika bekleyin.
      6. Boru adaptörünü, beyaz flanşına dokunana kadar akış moderatörünün kısa ampul kısmına takın(Şekil 2, cihaz #5.2). Boru adaptörü havada küçülerek sıkı bir sızdırmaz bağlantı oluşturur.
      7. Esnek kateter boruyu, akış moderatörünün kısa cannula kısmına dokunana kadar boru adaptörünün açık ucuna yerleştirin.
      8. Uzunül kısmını(Şekil 2, cihaz #5.3) bir klips standı kullanarak tutun ve tüm bağlantıları yapıştırın. Bağlantılar boru adaptörü ve beyaz flanş, boru adaptörü ve esnek kateter-boru ve son olarak esnek kateter tüpü ve infüzyon-kanüllerin yatay kısmı arasındadır. Tutkal tamamen kuruyana kadar birkaç saat bekleyin (tutkal tipine bağlı olarak).
        NOT: Bağlantıların gevşemesini önlemek için PE uyumlu yapıştırıcı kullanın.
      9. 27 G (0.014'') künt iğneli bir şırınga kullanarak infüzyon tüpünün uzun kanül kısmından steril su enjekte edin. Suyun infüzyon kanülü boyunca sorunsuz bir şekilde aktığını doğrulayın. Suyu boşaltmak için infüzyon tüpünden hava enjekte edin.
    5. Mini ozmotik pompanın astarı
      NOT: Astarlama, pompanın implantasyondan hemen sonra infüzyona başlamasını sağlayan bir başlangıç prosedürüdür.
      1. Isıtma banyosunu vücut sıcaklığında (~37 °C) suyla doldurun. Küçük bir kabı steril salinle doldurun ve ısıtma banyosuna yerleştirin.
      2. Mini ozmotik pompayı bir kağıt mendille sarın ve bir klips tutucu standı kullanarak açıklığı yukarı bakacak şekilde dikey olarak sabitlayın.
      3. Pompayı 27 G (0.014'') künt iğne ile şırınga kullanarak ACSF ile doldurun. Şırındıcı çıkarırken, havanın girmesini önlemek için ACSF'yi enjekte etmeye devam edin. Pompanın diyaframında bir ACSF kabarcığı görünecektir.
        NOT: İlk ACSF infüzyonu, sıçanın tikler indüklenene kadar ameliyattan tamamen kurtulmasını sağlar. İsteğe bağlı olarak, bikükülin dolu pompa, aşağıdaki pompa değişimini önlemek için birincil ameliyat sırasında implante edilebilir, ancak en uygun19değildir.
      4. bir şırınga, 27 G (0.014'') künt iğneyi infüzyon tüpünün uzun kanül kısmına takın ve içinden ACSF enjekte edin. Şırınnayı çıkarırken, havanın girmesini önlemek için ACSF'yi enjekte etmeye devam edin. Uzunül kısmında bir ACSF kabarcığı görünecektir.
      5. Uzun canül parçasını pompaya yerleştirin, kabarcıktan kabarmaya. infüzyon kanüllerinin ucunda bir ACSF kabarcığı görünmelidir.
      6. Pompayı kabın içine yerleştirin. İnfüzyon tüpüne bağlı pompayı, pompa implantasyonundan önce en az 4-6 saat (~37 °C'de) astarla. Sadece pompanın salinle temas uzağından emin olun.
    6. Pompa implantasyon ameliyatı
      1. Anestezi protokolüne göre sıçanı uyuşturun. Bkz. adım 1.2.1.
      2. Farenin başını ve sırtını, kürek kemiğine hafifçe arka tarafta bir elektrikli makas kullanarak tıraş edin.
      3. 1.2.3-1.2.11 adımlarında açıklandığı gibi cerrahide temel adımları uygulayın. Kesi, kafa derisi boyunca oksipital kemiğe kadar olmalıdır.
      4. Otoklavda büyük bir hemostat (~14 cm uzunluğunda, 5.512'') sterilize edin. Hemostat'ı kesiden geçirin ve orta kapaklı çizgiden cildin altında dönüşümlü olarak açıp kapatarak sıçanın sırtında deri altı bir cep oluşturun.
        NOT: Cep pompayı içerecek kadar büyük olmalı ve hafifçe hareket etmesine izin vermelidir.
    7. Mini ozmotik pompa ve infüzyon tüpü implantasyonu
      1. Kavun tutucuyu stereotaksik kola takın ve implantasyon için istenen konuma yerleştirin.
      2. Pompayı ısıtma banyosundan çıkarın ve bir kağıt mendille kaplı farenin sırtına yerleştirin.
      3. Kanül tutucu üzerinde infüzyon tüpünün kanül kılavuzunu kaydırın.
      4. Pompayı bir hemostatla tutun ve hafifçe deri altı cebine yerleştirin.
      5. Çapa vidalarını takın.
        NOT: Pompayı taktıktan sonra, cep açıklığının tıkanmasını önlemek için ve canül yer değiştirmesini önlemek için canül implantasyonundan önce ankraj vidalarını yerleştirin.
      6. İnfüzyon kanüllerini hedefe yerleştir ve jel tutkal kullanarak kafatasına yapıştır. Kuruyana kadar bekleyin. Ön ayak tik indüksiyonu için koordinatlar şunlardır: AP: +1 ila +1.5, mL: ±2.5, DV: 5.
      7. Kafatasına sabitlemek için infüzyon kanül boyunca diş çimentosu uygulayın. Kuruyana kadar bekleyin.
      8. İmplant edilen canülleri yerinde bırakarak kalıp tutucuyu kaldırın.
      9. Diğer tüm cihazları tak. Kafatasının geri kalanına tüm implantları kaplayan diş çimentosu uygulayın. Sıçanın serbest dolaşımını sağlamak için deri altı cebinde yeterince esnek kateter tüpü bırakın.
        NOT: Kafatası ile cep açıklığı arasında açık alan olmadığından ve kateterin bükülmediğinden emin olun.
      10. 1.2.12.10-1.2.12.11 adımlarında ayrıntılı olarak belirtildiği gibi ameliyatı sonlandırın.
  2. Pompa değiştirme ameliyatı
    NOT: Her mini ozmotik pompa tipinin önceden belirlenmiş bir teslimat infüzyon süresi vardır. Bu nedenle pompa değiştirme ameliyatı son kullanma tarihinden önce yapılmalıdır.
    1. Ameliyat öncesi hazırlık
      1. 2.1.5.1-2.1.5.2 adımlarını yineleyin.
      2. Pompayı 27 G (0.014'') künt iğne ile şırınga kullanarak biküküllinle doldurun. Şırınnayı çıkarırken, havanın girmesini önlemek için bikükülin enjekte etmeye devam edin.
      3. Akış moderatörünü (yarı saydam kapağına takılı) pompanın içine yerleştirin.
      4. Pompayı kabın içine yerleştirin. Pompayı, pompa değişiminden önce en az 4-6 saat (~37 °C'de) astarla.
    2. ameliyat
      1. Sıçanı uyuşturun (bkz. adım 1.2.1.1) ve elektrikli bir makas kullanarak sırtını tıraş edin.
      2. Sıçanın sırtını povidone iyotla ve sonra bölgeyi sterilize etmek için bir alkol mendiliyle sürün. %0,5-1 lidokin çözeltisi (SC) ile istenen kesi hattı boyunca sızın.
      3. İmplantlı pompanın üzerindeki deride bir kesi yapın. Cebi oda sıcaklığı acsf ile yıkayın ve gazlı bez pedleri ile kurulayın. Kesiğin yakınındaki alanı kaplamak için otomatik kapatılmış tek kullanımlık perdeler kullanın.
      4. ACSF dolu pompayı bir hemostat kullanarak akış moderatöründen ayırın ve atın.
      5. Bikükülin dolu pompayı ısıtma banyosundan çıkarın. Akış moderatörünü ikikülli dolu pompadan ayırın ve atın.
      6. Bikükülin dolu pompayı implante edilmiş akış moderatörüne hafifçe takın. Çevredeki cilde dokunmaktan kaçının.
        NOT: Hava kabarcıklarını önlemek için 2.2.2.4-2.2.2.6 adımları hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Bununla birlikte, biküküllin beyne hızlı girişini önlemek için pompa yavaşça yerleştirilmelidir.
      7. Forseps kullanarak kesiğin iki kenar boşluğuna birbirine yakından bastırın. Kesi hattını bir doku yapıştırıcısı ile yapıştırın. Alternatif olarak, dikişleri kullanarak kesiği kapatın.
      8. Bölgeyi povidon iyot ile tarayın ve 1.2.12.10-1.2.12.11 adımlarında ayrıntılı olarak belirtildiği gibi ameliyatı sonlandırın.

Sonuçlar

Sıçanlarda tik indüksiyonu için akut ve kronik modellerin üretilmesine yönelik protokoller yukarıda sunulmuştur. Protokoller ameliyat ve deneyler için tam hazırlığı kapsar (Akut model içinŞekil 1, kronik model için Şekil 2). Biküküllin striatumun motor bölgelerine uygulanması, devam eden motor tiklerin ifade edilir. Tikler uygulamanın kontralteral tarafında görünür ve kısa ve tekrarlayan kas kasılmaları ile karakterize edilir. Striat...

Tartışmalar

Bu yazıda, özgürce davranan bir sıçanda tik indüksiyonu için akut ve kronik modellerin protokollerini ayrıntılı olarak detaylandırdık. Bu protokoller, tüm bileşenlerin hazırlanmasını, ameliyatı ve özel araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için özelleştirmeye uyarlanabilecek deneysel süreci açıklar. Bu modellerin altında kalan birincil ilke, tic bozuklukların patofizyolojisinde kilit rol oynadığı bilinen striatumun motor bölgelerine biküküllin doğrudan lokal uygulamasıdır

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen bir İsrail Bilim Vakfı (ISF) hibesi (297/18) tarafından desteklendi. Yazarlar, akut kemirgen modelini kurduğu için M. Bronfeld'e ve yorumları için M. Israelashvili'ye teşekkür ediyor.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anchor screwsMicro FastenersSMPPS0002#0 x 1/8 - Pan Head Sheet Metal Screws
Bicuculline methiodideSigma Aldrich14343
Cyanoacrylate (CA) acceleratorZapPT29
Cyanoacrylate (CA) glueBSIIC-2000This glue was found to be stronger than others
Dental cementColteneH00322Hygenic Perm Repair Material Reline Resin Self Cure
Glue gelLoctiteUltra Gel Control
HemostatWPI501242Any hemostat sized approximately 14 cm would be sufficient
Hypo-tube, extra-thin wall 25GComponent supply companyHTX-25X
Hypo-tube, regular wall 22GComponent supply companyHTX-22R
Hypo-tube, regular wall 30GComponent supply companyHTX-30R
Infusion pump machineNew Era Pump SystemsNE-1000
Mini-osmotic pumpALZET20011.0µl per hour, 7 days
PE compatible adhesiveCEYSSpecial difficult plastics (suitable for PE)
PE-10 Catheter TubingALZETPE-10ID = 0.28mm, OD = 0.61mm
Precision glass microsyringe, 10µlHamilton800651701 RNR 10µl syr (22s/51/3)
Tissue adhesive3M1469SbVetbond
Tubing-adapterCMA3409500
Tygon micro bore tubing, 0.02 inch ID * 0.06 ODComponent supply companyTND80-020
Wire 0.005-inchComponent supply companyGWX-0050
Wire 0.013-inchComponent supply companyGWX-0130

Referanslar

  1. American Psychiatric Association. DSM-5. American Psychiatric Association. , (2013).
  2. Peterson, B. S., Leckman, J. F. The temporal dynamics of tics in Gilles de la Tourette syndrome. Biol.Psychiatry. 44, 1337-1348 (1998).
  3. Ganos, C., et al. The somatotopy of tic inhibition: where and how much. Movement Disorders. , (2015).
  4. Barnea, M., et al. Subjective versus objective measures of tic severity in Tourette syndrome - The influence of environment. Psychiatry Research. 242, 204-209 (2016).
  5. Silva, R. R., Munoz, D. M., Barickman, J., Friedhoff, A. J. Environmental Factors and Related Fluctuation of Symptoms in Children and Adolescents with Tourette's Disorder. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 36 (2), 305-312 (1995).
  6. Rothenberger, A., et al. Sleep and Tourette syndrome. Advances in Neurology. 85, 245-259 (2001).
  7. Conelea, C. a., Woods, D. W., Brandt, B. C. The impact of a stress induction task on tic frequencies in youth with Tourette Syndrome. Behaviour Research and Therapy. 49 (8), 492-497 (2011).
  8. Ganos, C., Rothwell, J., Haggard, P. Voluntary inhibitory motor control over involuntary tic movements. Movement Disorders. 33 (6), 937-946 (2018).
  9. Yael, D., Vinner, E., Bar-Gad, I. Pathophysiology of tic disorders. Movement Disorders. 30 (9), 1171-1178 (2015).
  10. Kurvits, L., Martino, D., Ganos, C., Eddy, C. M. Clinical Features That Evoke the Concept of Disinhibition in Tourette Syndrome. Frontiers in Psychiatry. 11, 1-10 (2020).
  11. Mink, J. W. Basal ganglia dysfunction in Tourette's syndrome: a new hypothesis. Pediatric Neurology. 25, 190-198 (2001).
  12. Bronfeld, M., Bar-Gad, I. Tic disorders: what happens in the basal ganglia. The Neuroscientist. 19 (1), 101-108 (2013).
  13. Tarsy, D., Pycock, C. J., Meldrum, B. S., Marsden, C. D. Focal contralateral myoclonus produced by inhibition of GABA action in the caudate nucleus of rats. Brain. 101 (1), 143-162 (1978).
  14. Crossman, A. R., Mitchell, I. J., Sambrook, M. A., Jackson, A. Chorea and Myoclonus in the Monkey Induced By Gamma-Aminobutyric Acid Antagonism in the Lentiform Complex. Brain. 111 (5), 1211-1233 (1988).
  15. McCairn, K. W., Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. The neurophysiological correlates of motor tics following focal striatal disinhibition. Brain. 132 (8), 2125-2138 (2009).
  16. Worbe, Y., et al. Behavioral and movement disorders induced by local inhibitory dysfunction in primate striatum. Cerebral Cortex. 19 (8), 1844-1856 (2009).
  17. Pogorelov, V., Xu, M., Smith, H. R., Buchanan, G. F., Pittenger, C. Corticostriatal interactions in the generation of tic-like behaviors after local striatal disinhibition. Experimental Neurology. 265, 122-128 (2015).
  18. Bronfeld, M., Yael, D., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Motor tics evoked by striatal disinhibition in the rat. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 50 (2013).
  19. Vinner, E., Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Prolonged striatal disinhibition as a chronic animal model of tic disorders. Journal of Neuroscience Methods. 292, 20-29 (2017).
  20. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6, (2007).
  21. Flecknell, P. Analgesia and Post-Operative Care. Laboratory Animal Anaesthesia. , (2016).
  22. Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Corticostriatal divergent function in determining the temporal and spatial properties of motor tics. Journal of Neuroscience. 35 (50), 16340-16351 (2015).
  23. Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Spatial and temporal properties of tic-related neuronal activity in the cortico-basal ganglia loop. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8713-8721 (2011).
  24. McCairn, K. W., et al. A Primary Role for Nucleus Accumbens and Related Limbic Network in Vocal Tics. Neuron. 89 (2), 300-307 (2016).
  25. Rizzo, F., et al. Aripiprazole Selectively Reduces Motor Tics in a Young Animal Model for Tourette's Syndrome and Comorbid Attention Deficit and Hyperactivity Disorder. Frontiers in Neurology. 9, 1-11 (2018).
  26. Vinner, E., Matzner, A., Belelovsky, K., Bar-gad, I. Dissociation of tic expression from its neuronal encoding in the striatum during sleep. bioRxiv. , (2020).
  27. Webster, K. E. Cortico-striate interrelations in the albino rat. Journal of Anatomy. 95, 532-544 (1961).
  28. Ebrahimi, A., Pochet, R., Roger, M. Topographical organization of the projections from physiologically identified areas of the motor cortex to the striatum in the rat. Neuroscience Research. 14, 39-60 (1992).
  29. Brown, L. L., Sharp, F. R. Metabolic mapping of rat striatum: somatotopic organization of sensorimotor activity. Brain Research. 686, 207-222 (1995).
  30. Brown, L. L., Smith, D. M., Goldbloom, L. M. Organizing principles of cortical integration in the rat neostriatum: Corticostriate map of the body surface is an ordered lattice of curved laminae and radial points. Journal of Comparative Neurology. 392 (4), 468-488 (1998).
  31. Yael, D., Tahary, O., Gurovich, B., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Disinhibition of the nucleus accumbens leads to macro-scale hyperactivity consisting of micro-scale behavioral segments encoded by striatal activity. The Journal of Neuroscience. , 3120 (2019).
  32. Obeso, J. A., Rothwell, J. C., Marsden, C. D. The spectrum of cortical myoclonus. From focal reflex jerks to spontaneous motor epilepsy. Brain. 108, 124-193 (1985).
  33. Bronfeld, M., et al. Bicuculline-induced chorea manifests in focal rather than globalized abnormalities in the activation of the external and internal globus pallidus. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3261-3275 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

DavranSay 171Tic ind ksiyonmotor tiklerhayvan modelleriozmotik pompabazal gangliyonstriatumbik k linGABA antagonistlerikronik modelakut modelTourette sendromu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır