Generazione di modelli sperimentali acuti e cronici di espressione tic motoria nei ratti

Riepilogo

Presentiamo protocolli per generare modelli sperimentali acuti e cronici di espressione tic nei ratti che si comportano liberamente. I modelli sono basati sull'impianto di cannula striatale e sulla successiva applicazione_{antagonista GABA A.} Il modello acuto utilizza iniezioni transitorie mentre il modello cronico utilizza infusioni prolungate attraverso una pompa mini-osmotica impiantata sottocutanea.

Abstract

I motori sono movimenti improvvisi, rapidi e ricorrenti che sono i sintomi chiave della sindrome di Tourette e di altri disturbi tic. La fisiopatologia della generazione tic è associata all'inibizione anomala dei gangli basali, in particolare la sua struttura di input primaria, lo striato. Nei modelli animali di roditori e primati non umani, l'applicazione locale degli antagonisti del GABA_A, come la bicucullina e la picrotossine, nelle parti motorie dello striato induce la disinibizione locale con conseguente espressione di tic motori.

Qui presentiamo modelli acuti e cronici di tic motori nei ratti. Nel modello acuto, le microiniezioni bicuculline attraverso una cannula impiantata nello striato dorsale suscitano l'espressione di tic che durano per brevi periodi di tempo fino a un'ora. Il modello cronico è un'alternativa che consente l'estensione dell'espressione tic a periodi di diversi giorni o addirittura settimane, utilizzando l'infusione continua di bicucullina attraverso una pompa mini-osmotica sub-cutanea.

I modelli consentono lo studio dei meccanismi comportamentali e neurali della generazione tic in tutta la via cortico-basale dei gangli. I modelli supportano l'impianto di dispositivi di registrazione e stimolazione aggiuntivi oltre alle cannule di iniezione, consentendo così un'ampia varietà di usi come stimolazione elettrica e ottica e registrazioni elettrofisiopatiche. Ogni metodo presenta diversi vantaggi e carenze: il modello acuto consente il confronto delle proprietà cinematiche del movimento e dei corrispondenti cambiamenti elettrofisiologici prima, durante e dopo l'espressione tic e gli effetti dei modulatori a breve termine sull'espressione tic. Questo modello acuto è semplice da stabilire; tuttavia, è limitato a un breve periodo di tempo. Il modello cronico, sebbene più complesso, rende fattibile lo studio della dinamica tic e degli effetti comportamentali sull'espressione tic per periodi prolungati. Pertanto, il tipo di query empirica guida la scelta tra questi due modelli complementari di espressione tic.

Introduzione

I tic sono il sintomo distintivo della sindrome di Tourette (TS) e di altri disturbi tic. I tic sono descritti come movimenti improvvisi, rapidi, ricorrenti (motori) o vocalizzazioni (tic vocali)¹. L'espressione tic in genere fluttua nelle sue proprietà temporali (frequenza)^{2 e} spaziali (intensità, posizione del corpo)³ su più scale temporali (ore, giorni, mesi e anni). Queste modifiche sono influenzate da diversi fattori, ad esempio le^{caratteristiche ambientali 4,5}, gli stati^{comportamentali 6,7}e la soppressione volontaria e temporanea⁸.

Sebbene il meccanismo neuronale che governa la motociclo non sia ancora pienamente compreso, un numero crescente di studi teorici e sperimentali ha fornito nuove prove sulla sua natura⁹. Attualmente, si pensa che la fisiopatologia della generazione tic coinvolga il ciclo dei gangli cortico-basali (CBG), ed è specificamente associata all'inibizione anomala dello striato, il nucleo primario di ingresso di gangli basali^10,11,12. Studi precedenti su roditori e primati hanno dimostrato che lo striato può essere disinibito dall'applicazione locale di diversi antagonisti GABA_A, come bicucullina e picrotoxina^{13,14,15,16,17,18}. Questo intervento farmacologico porta ad un'espressione motoria transitoria nel lato contralaterale dell'iniezione, stabilendo così un robusto modello acuto di disturbi tic con il viso e costruire la validità. Il modello acuto è semplice da indurre e consente di studiare gli effetti della modulazione a breve termine come la stimolazione elettrica e ottica in concomitanza con registrazioni elettrofisiopatiche e cinematiche prima, durante e dopo l'espressione. Tuttavia, il modello acuto è limitato al breve periodo di tempo successivo all'iniezione. Sulla base del modello acuto, abbiamo recentemente proposto un modello cronico di generazione tic nei ratti che utilizza un'infusione prolungata a tasso fisso di bicucullina allo striato attraverso una pompa mini-osmotica impiantata sottocutanea¹⁹. Questo modello estende il periodo di espressione tic a più giorni/settimane. Il rilascio costante di bicucullina per un lungo periodo di tempo consente l'esame degli effetti di una varietà di fattori come trattamenti farmacologici e stati comportamentali sull'espressione tic.

Qui presentiamo protocolli per generare i modelli acuti e cronici di espressione tic nei ratti. In funzione della specifica domanda di ricerca, i protocolli consentono la messa a punto dei parametri tra cui l'impianto unilaterale rispetto a quello bilaterale, il sito dei tic (secondo l'organizzazione somatotopica dello striato)¹⁸ e l'angolo dell'impianto-cannula (a seconda della posizione di dispositivi impiantati aggiuntivi). Il metodo utilizzato nel modello cronico si basa parzialmente su prodotti commerciali ma con regolazioni critiche per adattarsi al modello tic. Questo articolo descrive in dettaglio le regolazioni necessarie per personalizzare questi modelli tic.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate e supervisionate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e hanno aderito alla Guida nazionale degli istituti sanitari per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e alle Linee guida dell'Università Bar-Ilan per l'uso e la cura degli animali da laboratorio nella ricerca. Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Nazionale per gli Esperimenti sugli Animali da Laboratorio presso il Ministero della Salute.

NOTA: Questo protocollo utilizza ratti long-evans femminili (modelli acuti e cronici) e ratti Sprague Dawley femminili (modello acuto) di età compresa tra 3 e 10 mesi, 280-350 g. L'implementazione di questi modelli in altri ceppi, pesi o età deve essere testata attentamente per reazioni diverse.

1. Modello acuto

1. Preparazione pre-chirurgica
   1. Preparazione implantare-cannula
      NOTA: L'impianto-cannula consente iniezioni di bicucullina locali nello striato.
      1. Tagliare un ipotubo in acciaio inossidabile, 25 G (OD 0.02'', ID 0.015'') per ottenere una cannula implantare(Figura 1,dispositivo #1). Utilizzare uno strumento rotante per ottenere spigoli dritti. La lunghezza della cannula dipende dalla profondità del bersaglio dell'impianto, dall'angolo di impianto della cannula e dall'altezza finale del cappuccio cementato. La profondità target dell'impianto deve essere superiore di 2 mm (0,079'') rispetto al bersaglio finale di iniezione per prevenire danni ai tessuti.
         NOTA: L'oggetto più alto impiantato determina l'altezza del cappuccio.
      2. Sabbia e lisciare i bordi implantare-cannula, prevenendo ulteriori attriti meccanici al cervello. Inserire un ago da 30 G (0,01'') attraverso di esso per rimuovere eventuali ostruzioni interne.
   2. Preparazione fittizia
      NOTA: Il manichino è un filo interno rimovibile posto all'interno della cannula impiantata. Il manichino sigilla la cannula impiantata, prevenendo così la sua ostruzione.
      1. Crea un manichino tagliando un filo da 0,013' con uno strumento rotante. Il manichino deve essere più lungo di 3 mm (0,118'') rispetto alla lunghezza dell'impianto-cannula(Figura 1,dispositivo #2).
      2. Inserire il manichino nella cannula dell'impianto fino a raggiungere la fine. Piegare il filo in eccesso pizzicandolo contro la cannula. La parte piegata deve essere a filo con l'implanto-cannula per evitare che il manichino cada dalla cannula impiantata e per impedire al topo di rimuoverlo.
   3. Preparazione dell'iniettore
      NOTA: L'iniettore, composto da un tubo flessibile e una cannula di iniezione (Figura 1, dispositivo #3), consente l'iniezione diretta di bicucullina nello striato.
      1. Tagliare un tubo flessibile in microbore polimerico da 70 cm (27.559'') (OD 0,06'', ID 0,02'')(Figura 1, dispositivo #3.1).
         NOTA: La lunghezza del tubo flessibile è definita dalla distanza tra la gabbia sperimentale e la posizione della macchina della pompa per infusione. Deve essere sufficiente per consentire la libera circolazione del ratto durante il periodo di iniezione, ma non troppo a lungo, per evitare che il ratto si impigli in esso (cfr. figura 3A).
      2. Tagliare un tubo di iniezione in acciaio inossidabile, 30 G (OD 0.012'', ID 0.007'') per ottenere cannula a iniezione(Figura 1, dispositivo #3.2). Utilizzare uno strumento rotante per ottenere spigoli dritti. Dovrebbe misurare 5 mm (0,197'') più lungo della cannula-impianto: 2 mm (0,079'') più lungo della cannula impiantata all'interno del cervello per raggiungere l'obiettivo di iniezione finale e 3 mm (0,118'') per inserirlo nel tubo flessibile.
      3. Sabbia e lisciare la punta dell'iniezione-cannula, prevenendo ulteriori attriti meccanici al cervello. Inserire un filo di 0,005'' diametro per verificare che non sia strutturato.
      4. Inserire 3 mm (0,118'') della cannula a iniezione nel tubo flessibile e incollare il giunto tra di loro, per ottenere un iniettore. Utilizzare colla cianoacrilato (CA) e acceleratore CA.
      5. Attaccare una siringa con ago da 25 G (0,018'') riempito con acqua sterile all'iniettore e lavarlo. Ciò garantisce che l'orientamento del flusso che esce dalla cannula di iniezione sia dritto e senza sforzo. Fondamentalmente, se il flusso non è dritto, utilizzare la punta dell'ago da 30 G (OD 0.01'') per rimuovere eventuali ostruzioni e ingrandire il foro di cannula di iniezione e verificare nuovamente il flusso.
   4. Preparazione porta cannula
      NOTA: Il portacambri è collegato al braccio stereotassico e tiene la cannula dell'impianto durante l'impianto. Il portalachila è costituito da base porta-cannula e piombo porta cannula, che sono incollati insieme(Figura 1,dispositivo #4). Durante l'impianto, la base porta-cannula è attaccata al braccio stereotassico e il piombo portacaduta è attaccato alla cannula dell'impianto.
      1. Base porta-cannula: Taglio 10 cm (3.947'') di acciaio inossidabile, 22 G (OD 0.028'', ID 0.017'') ipotubo(Figura 1, dispositivo #4.1).
      2. Piombo porta-cannula: tagliare il filo 0,013'' a una lunghezza di 3 mm (0,118'') più lungo della cannula implantare desiderata(Figura 1, dispositivo #4.2).
      3. Inserire il piombo porta-cannula nella base porta-cannula e incollare il giunto tra di loro, utilizzando colla CA e acceleratore CA. Il piombo deve essere più corto di 1 mm (0,039'') rispetto all'impianto-cannula, per evitare danni ai tessuti durante l'impianto.
   5. Preparazione bicucolare: sciogliere il metioduro bicucullina nel liquido cerebrospinale fisiologico salino o artificiale (ACSF) ad una concentrazione finale di 1 μg/μL. Dividere la bicucullina disciolta in siringhe da 1 ml, coprire con un foglio di alluminio e congelare a -20 °C fino a quando necessario. Quando necessario, scongelare la siringa prima dell'uso.
2. chirurgia
   1. Indurre l'anestesia iniziale posizionando il ratto in una camera progettata e fornire il 4-5% di isoflurane miscelato con un ossigeno ad una velocità di 0,5-1 L/min. Quindi, iniettare il ratto intramuscolare (IM o IP) con miscela di ketamina e xiazina (rispettivamente 100 e 10 mg/kg).
   2. Radere la testa al topo usando un clipper elettrico.
   3. Metti il gel di lidocaina nelle orecchie del topo. Metti la vaselina sugli occhi del topo per prevenire l'essiccazione corneale e i traumi.
   4. Fissare il topo nel telaio stereotattico utilizzando auricolari e barra dei denti.
   5. Tamponare il cuoio capelluto del topo con iodio di povidone e quindi con salvietta alcolica per sterilizzare l'area. Infiltrarsi lungo la linea di incisione desiderata con soluzione di lidocaina 0,5 - 1% sottocutanea (SC). Usando una lama bisturi, fare un'incisione lungo il cuoio capelluto.
   6. Tirare la fascia verso i bordi per aprire l'area chirurgica.
   7. Pulire il cranio con soluzione salina sterile, utilizzando tamponi di cotone. In caso di sanguinamento, utilizzare un cauterizzatore per cauterizzare il capillare sanguigno. Questo passaggio è fondamentale per la stabilità del limite nel tempo.
   8. Bloccare la fascia con quattro emostati curvi (due anteriori, due posteriori) per ingrandire il sito chirurgico.
   9. Misurare le coordinate bregma e lambda. Livellare le coordinate dorsoventrali (DV) dei due punti, in modo che si si trovano entro un intervallo di 100 μm.
   10. Utilizzando l'apparato stereotassico, misurare e contrassegnare le coordinate delle aree di interesse e le viti di ancoraggio da impiantare. Le coordinate della cannula di impianto dritto per l'induzione tica nell'area dell'anelimb sono: AP: da +1 a +1,5, mL: ±2.5, DV: 3; area posteriore: AP: da -0,4 a -0,5, mL: ±3,5, DV:3^18,20.
       NOTA: In caso di impianto di più dispositivi che impediscono l'impianto di cannula dritta, modificare l'angolo di impianto della cannula e le sue coordinate di conseguenza (coordinate dell'artificino anteriore: AP: +2,7, mL: ±2.5, DV: 3, angolo 15 ° da anteriore a posteriore).
   11. Praticare fori nel cranio al microscopio. Utilizzare una macchina per trapano dentale con borre rotonde in carburo di dimensioni 1/4-1/2 bit. Per ridurre al minimo i rischi di lesioni cerebrali, regolare la velocità di perforazione in base alle abilità di perforazione ed evitare qualsiasi pressione meccanica. Perforare fino a quando il cervello è visibile, per circa 1 mm. Assorbire il sangue con un batuffolo di cotone e lavare con soluzione salina sterile.
       NOTA: Le viti di ancoraggio servono a stabilizzare il cappuccio. Assicurarsi che le viti si trovino in entrambi gli emisferi e lungo l'asse anteriore-posteriore.
   12. Impianto di cannula
       1. Avvitare le viti di ancoraggio nei fori. Utilizzare viti in acciaio #0 x 1/8.
          NOTA: Il numero di viti di ancoraggio dipende dal numero totale di dispositivi impiantati. Le viti a terra (ad esempio per le registrazioni elettriche o le stimolazioni elettriche) dovrebbero raggiungere la superficie cerebrale.
       2. Attaccare il portacarsi al braccio stereotassico.
       3. Far scorrere l'impianto-cannula sul portascolare. Posizionare lentamente l'impianto-cannula sopra il foro fino a raggiungere il cervello.
       4. Misurare le coordinate DV a partire dalla superficie cerebrale. Abbassare l'impianto-cannula fino al bersaglio dell'impianto. Assorbire il sangue che esce dal foro con un batuffolo di cotone, lavare con soluzione salina sterile e quindi asciugare accuratamente.
       5. Incollare la cannula impiantata al cranio usando colla gel. Aspetta fino all'asciutto.
       6. Applicare il cemento dentale lungo la cannula impiantata per attaccarlo al cranio. Lasciare 2 mm (0,079'') estendere dall'estremità superiore per consentire l'inserimento fittizio. Aspetta fino all'asciutto.
          NOTA: Non mettere cemento sul portascolare.
       7. Sollevare il portabici, lasciando la cannula impiantata in posizione.
       8. Inserire il manichino nella cannula impiantata.
       9. Impiantare tutti gli altri dispositivi come array di registrazione, fibre ottiche, elettrodi di stimolazione, ecc. Applicare il cemento dentale sul resto del cranio, coprendo tutti gli impianti.
       10. Iniettare 3 mL di soluzione ringer a temperatura ambiente e carprofene 5 mg/kg SC²¹.
       11. Monitorare il topo fino a quando non riprende conoscenza (l'animale è in posizione verticale, ha il controllo delle sue vie aeree e non è in pericolo di aspirazione). Riportare il topo nella sua gabbia di casa per il pieno recupero.
3. Microiniezioni
   NOTA: Durante l'iniezione, è fondamentale verificare che il flusso della bicucullina sia intatto. Questo può essere fatto lasciando che una piccola bolla d'aria si formi nell'iniettore e monitorandone il movimento. Il volume rimanente dell'iniettore può essere riempito con soluzione salina, in modo che nessuna bicucullina venga sprecata.
   1. Attaccare l'iniettore a una siringa bicucullina con un ago da 25 G (OD 0,018''). Riempire ~1/3-1/2 dell'iniettore e rimuovere la siringa, consentendo la formazione di una piccola bolla d'aria.
   2. Attaccare l'iniettore a una siringa sterile riempita di salina con un ago da 25 G (OD 0,018''). Riempire l'iniettore fino a quando la bicucullina raggiunge la fine e ne esce una piccola goccia.
   3. Rimuovere lo stantuffo di una microsiringa di vetro di precisione da 10 μL.
   4. Tagliare e attaccare un tubo polimerico corto-flessibile (~3 cm, 1,181'') alla microsiringa di vetro di precisione.
   5. Collegare l'altra estremità del tubo flessibile corto a una siringa da 1 ml, ago da 25 G (OD 0,018'') riempito con acqua sterile.
   6. Iniettare acqua attraverso il tubo corto-flessibile nel microsiringe di vetro di precisione fino a quando l'acqua ne esce. Scollegare il tubo corto-flessibile.
   7. Reinserire lo stantuffo fino a raggiungere il segno ~7 μL sulla microsiringa di vetro di precisione.
   8. Inserire la microsiringa di vetro di precisione nello slot destinato nella pompa per infusione.
   9. Collegare l'iniettore alla microsiringa di vetro di precisione e configurare le impostazioni a una velocità di 0,35 μL/min e a un volume totale di 0,35 μL.
   10. Mettere una salvietta di carta sotto la punta dell'iniettore. Contrassegnare la posizione della bolla d'aria sull'iniettore, avviare la macchina della pompa per infusione e verificare che venga visualizzata una caduta di bicucullina. Dopo l'iniezione, contrassegnare nuovamente la posizione della bolla d'aria.
       NOTA: La differenza tra i due segni corrisponde alla differenza desiderata durante l'iniezione sperimentale.
   11. Mettere il topo nella gabbia sperimentale e rimuovere il manichino.
   12. Inserire l'iniettore nella cannula impiantata fino alla fine (vedere figura 3A).
   13. Avviare la macchina della pompa per infusione. Verificare che la bolla d'aria si muova. Avviare il cronometro per tenere traccia dei tempi di iniziazione e terminazione del tic.
   14. Un minuto dopo l'iniezione, rimuovere l'iniettore e reinserire lentamente il manichino.
       NOTA: Inserendo il manichino dopo l'iniezione spinge la bicucullina nel bersaglio di iniezione.
4. Post iniezione
   1. Scollegare l'iniettore dalla microsiringa di vetro di precisione.
   2. Lavare la soluzione rimanente dall'iniettore, utilizzando una siringa riempita d'aria. Pulire l'iniettore con acqua sterile e quindi scolarlo iniettando aria attraverso l'iniettore.
   3. Scollegare la microsiringa di vetro di precisione dalla macchina della pompa per infusione e pulirla con acqua sterile.

2. Modello cronico

1. Preparazione pre-chirurgica
   1. Preparazione della guida cannula
      NOTA: La guida della cannula fa parte del tubo di infusione e viene utilizzata per attaccare la cannula per infusione al portacarne durante l'impianto.
      1. Tagliare 12 mm (0,472'') di acciaio inossidabile, 25 G (OD 0,02'', ID 0,015'') ipotubo per ottenere una guida cannula(Figura 2, dispositivo #1). Utilizzare uno strumento rotante per ottenere spigoli dritti.
      2. Preparare un portapenne come descritto al passaggio 1.1.4. Inserire il portalachila nella guida della cannula per verificare che sia correttamente attaccato e rimuoverlo.
   2. Preparazione infusione-cannula
      NOTA: Anche la cannula per infusione fa parte del tubo di infusione. Viene impiantato nel bersaglio finale dello striato e consente l'infusione focale di bicucullina.
      1. Taglio acciaio inossidabile, ipotubo da 30 G (OD 0.012'', ID 0.007'') per ottenere una cannula per infusione. Utilizzare uno strumento rotante per ottenere spigoli dritti. La lunghezza totale dell'infusione-cannula è la somma della profondità di impianto desiderata più un fattore di sicurezza (~ 1-2 mm, 0,039''-0.079''), la parte piegata in infusione (2 mm, 0,079''), la sovrapposizione con la guida a cannula (3 mm, 0,118'') e la parte orizzontale (4 mm, 0,157'')(figura 2, dispositivo #2).
         NOTA: A differenza del modello acuto, la profondità di impianto è uguale al bersaglio finale dell'infusione.
      2. Inserire un filo di 0,005'' diametro nella cannula per infusione e piegarli in una forma A nella posizione prevista. La parte verticale corrisponde alla profondità di impianto desiderata più 4-5 mm (0,157''-0.197'') e la parte orizzontale è lunga 4 mm (0,157'').
         NOTA: L'inserimento del filo interno impedisce l'ostruzione della cannula durante la flessione.
   3. Preparazione flessibile del tubo catetere
      NOTA: È anche un componente del tubo di infusione. Collega la cannula per infusione alla pompa mini-osmotica tramite un adattatore per tubi.
      1. Tagliare 8 cm (3.149'') di tubi in polietilene (PE)-10 (ID 0.011'', OD 0.025'')(Figura 2, dispositivo #3).
         NOTA: La lunghezza del catetere è determinata dalla distanza tra il bersaglio di impianto e la posizione della pompa, consentendo la libera circolazione della testa e del collo del topo (vedere figura 3B).
   4. Montaggio del tubo di infusione
      NOTA: Il tubo di infusione conduce la bicucullina dalla pompa mini-osmotica al cervello. Si compone della guida cannula, della cannula per infusione, del tubo flessibile del catetere, dell'adattatore per tubi e del moderatore di flusso(figura 2).
      1. Rimuovere il filo interno dalla cannula da infusione. Ispezionare la cannula al microscopio per assicurarsi che i suoi bordi siano aperti e puliti su entrambi i lati; in caso contrario, utilizzare un ago da 30 G (OD 0.01'') per aprirlo.
      2. Incollare la guida cannula alla sezione verticale della cannula da infusione, vicino alla parte piegata, sulla sovrapposizione di 3 mm (0,118''), utilizzando colla CA e acceleratore CA.
      3. Inserire la parte orizzontale della cannula per infusione nel tubo flessibile del catetere. La sovrapposizione dovrebbe essere di almeno 2 mm (0,079'').
      4. Espellere il tappo traslucido del moderatore del flusso della pompa. Ciò rivelerà il tubo corto in cannula in acciaioinossidabile (Figura 2,dispositivo #5.1).
         NOTA: Il flow-moderator fa parte del kit pompa mini-osmotica. È composto da un cappuccio traslucido, una breve parte di cannula, una flangia bianca e una lunga parte di cannula. La lunga parte in cannula viene inserita nella mini-pompa osmotica e la parte corta della cannula è collegata al catetere-tubo tramite adattatore per tubi.
      5. Immergere l'adattatore per tubi(Figura 2,dispositivo #4) in 70% di alcol. Attendere alcuni minuti per consentire al materiale di gonfiarsi.
      6. Collegare l'adattatore di tubo alla parte corta della cannula del moderatore di flusso, fino a tocchi la flangia bianca (Figura 2, dispositivo #5.2). L'adattatore per tubi si restringerà nell'aria per formare una connessione sigillata stretta.
      7. Inserire il tubo flessibile del catetere nell'estremità aperta dell'adattatore per tubi, fino a tocchire la parte corta della cannula del moderatore di flusso.
      8. Tenere premuta la parte cannula lunga (Figura 2, device #5.3) utilizzando un supporto per clip e incollare tutte le connessioni. I collegamenti sono tra l'adattatore per tubi e la flangia bianca, l'adattatore per tubi e il tubo flessibile del catetere, e infine il tubo catetere flessibile e la parte orizzontale della cannula per infusione. Attendere diverse ore fino a quando la colla è completamente asciutta (a seconda del tipo di colla).
         NOTA: Utilizzare adesivo compatibile con PE per evitare che le connessioni si allentno.
      9. Iniettare acqua sterile attraverso la lunga parte di cannula del tubo di infusione, utilizzando una siringa con un ago smussato da 27 G (0,014''). Verificare che l'acqua fluisca senza intoppi attraverso l'infusione-cannula. Iniettare aria attraverso il tubo di infusione per drenare l'acqua.
   5. Adescamento della pompa mini-osmotica
      NOTA: L'adescamento è una procedura di avvio che consente alla pompa di avviare l'infusione immediatamente dopo l'impianto.
      1. Riempire un bagno di riscaldamento con acqua a temperatura corporea (~ 37 °C). Riempire un piccolo bicchiere con soluzione salina sterile e posizionare nel bagno di riscaldamento.
      2. Avvolgere la mini pompa osmotica con una salvietta di carta e fissarla verticalmente con l'apertura rivolta verso l'alto, utilizzando un supporto per clip.
      3. Riempire la pompa con ACSF utilizzando una siringa con un ago smussato da 27 G (0,014''). Durante la rimozione della siringa, continuare a iniettare l'ACSF per impedire l'ingresso di aria. Una bolla ACSF apparirà nell'apertura della pompa.
         NOTA: L'infusione iniziale di ACSF consente al ratto di riprendersi completamente dall'intervento chirurgico prima che i tic siano indotti. Opzionalmente, la pompa riempita di bicucullina può essere impiantata durante l'intervento chirurgico primario per evitare la seguente sostituzione della pompa, ma non è ottimale¹⁹.
      4. Attaccare una siringa, 27 G (0,014'') ago smussato alla lunga parte di cannula del tubo di infusione e iniettare ACSF attraverso di esso. Durante la rimozione della siringa, continuare a iniettare l'ACSF, per evitare che l'aria entri. Una bolla ACSF apparirà nella lunga parte di cannula.
      5. Inserire la lunga parte di cannula nella pompa, bollare per bollare. Una bolla ACSF dovrebbe apparire sulla punta della cannula da infusione.
      6. Posizionare la pompa nel becher. Innescare la pompa, attaccata al tubo di infusione, per almeno 4-6 ore (a ~ 37 °C) prima dell'impianto della pompa. Assicurarsi che solo la pompa contatti la salina.
   6. Chirurgia implantare della pompa
      1. Anestetizza il topo secondo il protocollo di anestesia. Vedere il passaggio 1.2.1.
      2. Radere la testa e la schiena del topo, usando un clipper elettrico, leggermente posteriore alle scapole.
      3. Eseguire i passaggi di base della chirurgia, come descritto nei passaggi 1.2.3-1.2.11. L'incisione dovrebbe essere lungo il cuoio capelluto fino all'osso occipitale.
      4. Sterilizzare un grande emostato (~14 cm di lunghezza, 5.512'') in autoclave. Inserire l'emostato attraverso l'incisione e creare una tasca sottocutanea nella schiena del topo aprendola alternativamente e chiudendola sotto la pelle attraverso la linea centrale.
         NOTA: La tasca dovrebbe essere abbastanza grande da contenere la pompa e consentirgli di muoversi leggermente.
   7. Impianto mini-osmotico pompa e tubo per infusione
      1. Attaccare il portacambri al braccio stereotassico e posizionarlo nella posizione desiderata per l'impianto.
      2. Rimuovere la pompa dal bagno di riscaldamento e posizionarla sulla schiena del topo coperta da una salvietta di carta.
      3. Far scorrere la cannula-guida del tubo di infusione sul portala cannula.
      4. Tenere la pompa con un emostato e inserirla delicatamente nella tasca sottocutanea.
      5. Impiantare le viti di ancoraggio.
         NOTA: Impiantare le viti di ancoraggio dopo aver inserito la pompa, per evitare il blocco dell'apertura della tasca e prima dell'impianto di cannula per evitare lo spostamento della cannula.
      6. Impiantare la cannula da infusione nel bersaglio e incollarla al cranio usando colla gel. Aspetta fino all'asciutto. Le coordinate per l'induzione primaria sono: AP: da +1 a +1,5, mL: ±2.5, DV: 5.
      7. Applicare il cemento dentale lungo la cannula da infusione per fissarlo al cranio. Aspetta fino all'asciutto.
      8. Sollevare il portabici lasciando la cannula impiantata in posizione.
      9. Impiantare tutti gli altri dispositivi. Applicare il cemento dentale sul resto del cranio, coprendo tutti gli impianti. Lasciare un catetere-tubo flessibile sufficiente nella tasca sottocutanea non ancorato per consentire la libera circolazione del topo.
         NOTA: Assicurarsi che non vi siano aree esposte tra il cranio e l'apertura della tasca e che il catetere non sia piegato.
      10. Finalizzare l'intervento come descritto nei passaggi 1.2.12.10-1.2.12.11.
2. Chirurgia di sostituzione della pompa
   NOTA: Ogni tipo di pompa mini-osmotica ha il proprio periodo di infusione di consegna predeterminato. Pertanto, l'intervento chirurgico di sostituzione della pompa deve essere eseguito prima della data di scadenza.
   1. Preparazione pre-chirurgica
      1. Ripetere i passaggi 2.1.5.1-2.1.5.2.
      2. Riempire la pompa con bicucullina utilizzando una siringa con un ago smussato da 27 G (0,014''). Durante la rimozione della siringa, continuare a iniettare bicucullina, per evitare che l'aria entri.
      3. Inserire il flow-moderator (collegato al tappo traslucido) all'interno della pompa.
      4. Posizionare la pompa nel becher. Innescare la pompa per almeno 4-6 ore (a ~37 °C) prima della sostituzione della pompa.
   2. chirurgia
      1. Anestetizzare il ratto (vedere punto 1.2.1.1) e radersi la schiena utilizzando un clipper elettrico.
      2. Tamponare la schiena del topo con iodio di povidone e quindi con una salvietta alcolica per sterilizzare l'area. Infiltrarsi lungo la linea di incisione desiderata con una soluzione di lidocaina 0,5-1% (SC).
      3. Fare un'incisione sulla pelle sopra la pompa impiantata. Lavare la tasca con ACSF a temperatura ambiente e asciugare con cuscinetti di garza. Utilizzare tende monouso autoclavate per coprire l'area vicino all'incisione.
      4. Staccare la pompa riempita con ACSF dal moderatore di flusso utilizzando un emostato e scartare.
      5. Rimuovere la pompa riempita di bicucullina dal bagno di riscaldamento. Staccare e scartare il flusso-moderatore dalla pompa riempita di bicucullina.
      6. Collegare delicatamente la pompa riempita di bicucullina al moderatore di flusso impiantato. Evitare di toccare la pelle circostante.
         NOTA: I passaggi 2.2.2.4-2.2.2.6 devono essere eseguiti rapidamente per evitare bolle d'aria. Tuttavia, la pompa deve essere inserita lentamente per impedire un rapido ingresso di bicucullina nel cervello.
      7. Premere i due margini dell'incisione strettamente insieme, usando le forcep. Incollare la linea di incisione con un adesivo tissutale. In alternativa, chiudere l'incisione usando le suture.
      8. Tamponare l'area con iodio povidone e finalizzare l'intervento come descritto nei passaggi 1.2.12.10-1.2.12.11.

Risultati

Sopra sono stati presentati protocolli per la generazione dei modelli acuti e cronici di induzione tica nei ratti. I protocolli riguardano la preparazione completa per la chirurgia e gli esperimenti(figura 1 per il modello acuto, figura 2 per il modello cronico). L'applicazione della bicucullina nelle aree motorie dello striato si traduce nell'espressione di motori in corso. I tic appaiono sul lato contralaterale dell'applicazione e sono caratterizzati da contra...

Discussione

In questo manoscritto, abbiamo dettagliato i protocolli dei modelli acuti e cronici per l'induzione tic in un ratto che si comporta liberamente. Questi protocolli descrivono la preparazione di tutti i componenti, l'intervento chirurgico e il processo sperimentale che può essere adattato per la personalizzazione per soddisfare specifiche esigenze di ricerca. Il principio primario alla base di questi modelli è l'applicazione locale diretta della bicucullina alle aree motorie dello striato, che è noto per svolgere un ruo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anchor screws	Micro Fasteners	SMPPS0002	#0 x 1/8 - Pan Head Sheet Metal Screws
Bicuculline methiodide	Sigma Aldrich	14343
Cyanoacrylate (CA) accelerator	Zap	PT29
Cyanoacrylate (CA) glue	BSI	IC-2000	This glue was found to be stronger than others
Dental cement	Coltene	H00322	Hygenic Perm Repair Material Reline Resin Self Cure
Glue gel	Loctite		Ultra Gel Control
Hemostat	WPI	501242	Any hemostat sized approximately 14 cm would be sufficient
Hypo-tube, extra-thin wall 25G	Component supply company	HTX-25X
Hypo-tube, regular wall 22G	Component supply company	HTX-22R
Hypo-tube, regular wall 30G	Component supply company	HTX-30R
Infusion pump machine	New Era Pump Systems	NE-1000
Mini-osmotic pump	ALZET	2001	1.0µl per hour, 7 days
PE compatible adhesive	CEYS		Special difficult plastics (suitable for PE)
PE-10 Catheter Tubing	ALZET	PE-10	ID = 0.28mm, OD = 0.61mm
Precision glass microsyringe, 10µl	Hamilton	80065	1701 RNR 10µl syr (22s/51/3)
Tissue adhesive	3M	1469Sb	Vetbond
Tubing-adapter	CMA	3409500
Tygon micro bore tubing, 0.02 inch ID * 0.06 OD	Component supply company	TND80-020
Wire 0.005-inch	Component supply company	GWX-0050
Wire 0.013-inch	Component supply company	GWX-0130