JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskopisi, spesifik kimyasal moieties'in seçici, etiketsiz görüntülenmesini sağlar ve lipit moleküllerini in vivo olarak görüntülemek için etkili bir şekilde sunulmuştır. Burada, SRS mikroskopi prensibine kısa bir giriş sağlıyoruz ve Caenorhabditis elegans'talipid depolama görüntülemede kullanımı için yöntemleri açıklıyoruz.

Özet

Lipid metabolizması hücresel ve organizma sağlığı için gerekli olan temel bir fizyolojik süreçtir. Lipid metabolizmasının düzensizliği genellikle obeziteyi ve kardiyovasküler bozukluklar, tip II diyabet ve kanser de dahil olmak üzere birçok ilişkili hastalığı ortaya çıkarır. Lipid metabolik regülasyonunun mevcut anlayışını ilerletmek için, zaman ve mekanda in vivo lipid depolama seviyelerini hassas bir şekilde ölçmek için nicel yöntemler giderek daha önemli ve yararlı hale gelmiştir. Lipid depolamayı analiz etmek için geleneksel yaklaşımlar mikroskobik değerlendirme için yarı niceldir veya biyokimyasal ölçüm için mekansal-zamansal bilgiden yoksundur. Uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskopisi, canlı hücrelerdeki lipitlerin hücre altı çözünürlüğe sahip hızlı ve nicel olarak algılanmasını sağlayan etiketsiz bir kimyasal görüntüleme teknolojisidir. Kontrast içsel moleküler titreşimlerden yararlanıldığı için, SRS mikroskopisi canlı hayvanlarda lipitlerin dört boyutlu izlenmesine de izin eder. Son on yılda, SRS mikroskopisi biyomedikal araştırmalarda küçük molekül görüntüleme için yaygın olarak kullanılmaktadır ve geleneksel floresan boyama ve lipit ekstraksiyon yöntemlerinin başlıca sınırlamalarının üstesinden gelmektedir. Laboratuvarda, lipid damlacıklarının farklı hücre ve dokular arasındaki dağılımını ve heterojenliğini araştırmak ve nihayetinde lipid metabolizmasını modüle eden yeni korunmuş sinyal yollarını keşfetmek için SRS mikroskopisini güçlü model organizma Caenorhabditis elegans'ın kullanabileceği genetik ve biyokimyasal araçlarla birleştirdik. Burada, SRS mikroskopunun çalışma prensiplerini ve ayrıntılı kurulumunu sunuyoruz ve lipid depolamasını vahşi tip ve insülin sinyal eksikliği olan mutant C. elegans'ınfarklı gelişimsel zaman noktalarında ölçmede kullanılması için yöntemler sunuyoruz.

Giriş

Obezite, dünyadaki nüfusun üçte birini tehdit eden küresel bir sağlık sorunu haline gelmiştir ve kötü ruh sağlığı1 ve diyabet2,kardiyovasküler hastalıklar3 ve bazı kanser türleri de dahil olmak üzere ölümcül hastalıklarla ilişkisi göz önüne alındığında ciddi bir tıbbi endişe ortaya çıkarır4. Obezitenin arkasındaki biyolojik sorunları daha iyi anlamak için lipid metabolizmasının incelenmesi esastır. Lipid depolamanın hızlı ve spesifik nicelemesi, yağ asitlerinin ve türevlerinin yanı sıra sterol içeren metabolitlerin yüksek hassasiyetle ve tercihen mekansal bilgilerle tespit edilmesini gerektirir. Lipitler, içsel floresandan yoksun oldukları ve kolayca floresan olarak etiketlenemedikleri için görüntüye zorlu hedeflerdir. Floresan etiketler genellikle lipid moleküllerinden daha büyüktür ve bu nedenle in vivo uygulamalar için kimyasal olarak invaziv ve pratik olmayabilir. Lipid moleküllerinin hidrofobik yapısını korumak için etiketsiz veya minimum etiketleme stratejisi gereklidir5. Görüntüleme teknolojilerindeki son gelişmeler, canlı hücrelerde, dokularda ve organizmalarda lipitlerin etiketsiz görüntülenmesi için heyecan verici fırsatlar yaratmıştır.

Biyolojik örneklerde lipid depolama analizleri için geleneksel yaklaşımlar biyokimyasal tahliller ve lipofilik boyalarla boyama protokollerini içerir. Kütle spektrometresi (MS) içeren biyokimyasal niceleme tahlilleri moleküler çözünebilirliklerinde eşsizdir, ancak çok büyük numune miktarları gerektirirler ve numune hazırlama genellikle birkaç saat sürer, yaşam sistemlerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için uygulamalarını sınırlar5. Bu tahlillerin bir diğer önemli sınırlaması da mekansal bilgi eksikliğidir. Öte yandan Oil Red O ve Sudan Black gibi lipofilik boyalar lipid depolama organellerinin doku ve hücresel dağılımını sağlar ve MS tekniklerine göre bu boyama yöntemlerinin maliyeti de düşüktür ve yapılması kolaydır. Bununla birlikte, bu boyama protokolleri, lipit damlacıklarının hidrofobik doğasını etkileyebilecek, yapılarında yapay değişiklikler oluşturabilecek ve deneyler arasında tutarsızlıklara neden olabilecek fiksasyon gerektirir6. Biyokimyasal ve boyama teknikleri ile ilişkili teknik zorluklar, lipid moleküllerini görüntülemek için etiketsiz yöntemlerin aranmasına ve lipid görüntülemede tutarlı Raman saçılma (CRS) mikroskopisinin kullanımının hızla artmasına yol açmıştır.

Raman etkisi ilk olarak Raman ve Krishnan tarafından tanındı, burada bir fotonla etkileşime girdikten sonra, bir molekülün dalga boyunda (Rayleigh saçılımı olarak adlandırılır) veya nadiren değiştirilmiş bir dalga boyuyla (Raman saçılımı olarak adlandırılır) dağınık ışık üretebileceğini ve dalga boyundaki bu değişikliğin molekül içindeki fonksiyonel kimyasal grupların karakteristiği olduğunubildirdiler 7. Bir molekülün içindeki kimyasal bağlar, pompa foton adı verilen bir olay fotonunun daha yüksek titreşimsel enerji seviyesine yükselmesiyle, Stokes foton adı verilen dağınık fotonun enerjisi daha düşük hale gelir. Aksi takdirde, kimyasal bağlar başlangıçta daha yüksek bir seviyedeyse daha düşük bir titreşimli enerji seviyesine ulaşabilir ve dağınık foton Stokes karşıtı foton olmak için enerji kazanır. Olay ile dağınık fotonlar arasındaki frekans farkı Raman kayması olarak bilinir. Bir molekül içindeki her kimyasal bağın karakteristik ve ölçülebilir bir Raman kayması vardır. Örneğin, CH2 bağı 2.845 cm-1Raman kaymasına sahiptir, yağ asidi zincirlerinde bol miktarda bulunur8. Bu spontan Raman sinyali genellikle çok zayıftır, bu da geleneksel spontan Raman mikroskopisinde görüntüleme hızını büyük ölçüde sınırlamıştır. Yıllar içinde spontan Raman mikroskopisinin görüntüleme hızını ve hassasiyetini artırmak için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Tutarlı Anti-Stokes Raman Saçılma (CARS) mikroskopisi ve Uyarılmış Raman Saçılma (SRS) mikroskopisi de dahil olmak üzere tutarlı Raman saçılma mikroskopisi en son ilerlemedir. CARS ve SRS biraz farklı çalışma prensiplerine sahiptir, ancak her ikisi de canlı görüntüleme yeteneğine sahip, lipid depolama dinamikleri hakkında mekansal ve zamansal bilgi verebilen ve yalnızca küçük örnek boyutu gerektiren etiketsiz tekniklerdir. CARS mikroskopisi, çeşitli doğrusal olmayan işlemlerden gelen rezonans dışı arka plandan muzdariptir ve CARS sinyalleri ayrıca molekül konsantrasyonu ile doğrusal olmayan bir ilişkiye sahiptir, bu da birlikte nicelik sürecini zorlaştırır9. CARS mikroskopisinin aksine, SRS mikroskopisi rezonans olmayan arka plan sinyalleri oluşturmaz ve ilgi molekülünün konsantrasyonuna doğrusal bağımlılık sunar. Bu nedenle, şu anda SRS mikroskopisi lipid görüntüleme için daha yaygın olarak kullanılmaktadır.

SRS mikroskopisinde, zayıf spontan Raman sinyalleri, kimyasal bağ titreşim frekansıyla eşleşen frekans farkı ile senkronize iki lazer ışını tarafından heyecanlandığında yükseltilebilir. Molekül, tutarlı heyecan nedeniyle heyecanlı bir duruma gelişmiş bir geçiş yaşayacaktır. Sonuç olarak, Stokes foton oluşturma oranı artırılıyor. Sonuç olarak, iletilen "Stokes" ışınının yoğunluğu artar (uyarılmış Raman kazancı, SRG) ve iletilen "pompa" ışınının yoğunluğu azalır (uyarılmış Raman kaybı, SRL). SRG veya SRL sinyallerinin algılanmasının temeli, spesifik kimyasal bağlara sahip moleküllerin Uyarılmış Raman Saçılma (SRS) mikroskopisi görüntülemesinin temelini oluşturur10. İki lazer ışını arasındaki frekans farkı, ilgi çekici bir molekül içindeki kimyasal bağın titreşim frekansı ile eşleşmiyorsa, ne SRG ne de SRL sinyalleri üretilir. SRS mikroskopisinin görüntüleme hızı piksel başına yaklaşık 2 μsec veya kare başına 1 saniyedir, bu da spontan Raman mikroskopisi11'dençok daha hızlıdır. SRS mikroskopisi için tipik yanal çözünürlük kırınım sınırlı ve yaklaşık 300 nm'dir. Ek olarak, SRS mikroskopisinin iki fotonlu optik süreçleri, bağıl kalın doku örneklerinin hacimsel 3D görüntülenmesine izin verir ve görüntüleme derinliği 300-500 μm'ye ulaşabilir. Genel olarak, SRS mikroskopisi, özellikle lipitler olmak üzere belirli biyomolekülleri tespit etmek için etkili, etiketsiz bir görüntüleme tekniği sunar.

Lipid damlacıkları, triacylglycerols (THG) ve kolesterol esterleri (CE' ler) dahil olmak üzere nötr lipitler için ana hücresel depolama alanı olan tek membranlı organellerdir. Bu lipit moleküllerinin yağ asidi zincirlerindeki CH2 bağları, heyecanlandığında 2.845 cm-1'de güçlü SRS sinyalleri oluşturur8, böylece bozulmamış hücrelerde, doku bölümlerinde ve hatta tüm organizmalarda depolama lipit seviyelerinin tespit edilmesini ve nicelleştirilmesini sağlar12,13,14,15. Özellikle C. eleganlar saydamlıkları nedeniyle lipid görüntüleme çalışmaları için faydalıdır. Memeliler gibi, C. eleganlar da lipit damlacıklarında lipitleri depolarlar ve lipit moleküllerinin sentezi ve bozulma yolları yüksek oranda korunur16. Bu protokolde, SRS mikroskopisinin çalışma prensibini, temel kurulumunu sağlayacak ve C. elegans'talipit görüntülemede kullanım yöntemlerini açıklayacağız.

Protokol

1. Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi için enstrümantal kurulum

NOT: SRS mikroskopi sistemi, pompa entegre optik parametrik osilatörlü bir picosecond lazer ve konfokal lazer tarama mikroskobu üzerine inşa edilmiştir. Osilatör, 1.064 nm'de bir Stokes ışını ve 700-990 nm arasında ayarlanabilir bir pompa ışını dahil olmak üzere iki picosecond darbeli tren sağlar. Lazerin içinde iki ışının zamansal ve mekansal üst üste binmesi sağlanır. Dahili elektro optik modülatör (EOM), SRS mikroskopisi için özel olarak tasarlanmıştır. Bu protokol lazeri mikroskopla bağlamaya ve bu sistemin günlük çalışmasına odaklanacaktır (Şekil 1). Bir SRS mikroskop sisteminin yapılandırması son on yılda gelişiyor. Aşağıdaki açıklamanın yalnızca birkaç yapılandırmadan birini temsil ettiği belirtilmelidir.

  1. Lazer ışınlarını mikroskop içine beslemek
    1. Işınları picosecond ışık kaynağı çıkışından mikroskop tarayıcısındaki IR lazer giriş bağlantı noktasına kaldıracak şekilde periskopu ayarlayın.
      DİkKAT: Operasyondan önce lazer sistemi kılavuzunu okuyun ve gerekli tüm önlemleri alın, çünkü bu Sınıf IV lazer sistemi tarafından üretilen yakın kızılötesi radyasyon gözlere ve cilde ciddi zarar verebilir. Kurumsal çevre güvenliği departmanlarının gerektirdiği eğitimleri tamamlayın. Koruyucu gözlükler ve manşetli kollu laboratuvar önlüğü giyin.
    2. İlk olarak, pompa ışınını 750 nm'ye ayarlayın ve lazer gücünü 50 mW'a düşürerek, hizalamayı bağlaarak görsel olarak incelenebilir. Ardından, ışın çapını mikroskop hedeflerinin arka diyaframına uyacak şekilde ayarlamak için bir ışın genişletici(Şekil 1, L1 ve L2) kullanın. Lazer ışınını periskopa yönlendirmek için iki röle aynası(Şekil 1, M1 ve M2) kullanın(Şekil 1, P1 ve P2). Periskop, kirişi tarayıcı açıklığının yüksekliğine kaldıracak ve hizalama için direksiyon aynası görevi görecektir.
    3. Perskoptaki düğmeleri ayar aralığının ortasına ayarlayın ve lazer ışını aynanın ortasına çarpaca kadar her aynanın başlangıç konumunu ve açısını seçin.
    4. Nesnel kule üzerinde boş bir bağlantı noktası kullanarak kaba hizalamayı gerçekleştirin ve iletilen ışığın gücünü ölçmek için güç ölçer probunun yerleştirilmesini gerçekleştirin. Mikroskop tarayıcısını en yüksek yakınlaştırmada (50x) ayarlayın ve ardından odaklanmış lazer ışını noktasıyla iletilen ışığın gücünü ölçün. En yüksek iletimli lazer gücünü elde etmek için her aynadaki düğmeleri, M1 ve M2'yi yinelemeli olarak optimize edin.
    5. Hizalama aracıyla ince hizalamayı gerçekleştirin. Floresan hedef hizalama kapağını boş nesnel koltuğa koyun ve M1 düğmelerini noktayı ortalamak için ayarlayın. Ardından, hedef için uzatma tüpünü tanıtın ve noktayı ortalamak için M2 düğmelerini ayarlayın.
    6. Işın hedefi her iki konuma da ortalayına kadar 1.1.4 ve 1.1.5 adımlarını yineleyin.
  2. Bağlantı algılama ve elektronik
    1. SRS algılama modülini kurun. İletilen lazeri fotodiyot modülüne yönlendirmek için kondenserden sonra bir ışın ayırıcı küber yerleştirin. Modül, fotodotun aktif alanına uyacak şekilde ışın boyutunu röle etmek ve değiştirmek için bir teleskopun yanı sıra modüle edilmiş Stokes ışınını çıkarmak ve pompa ışınının demodülasyon için geçmesine izin vermek için bir optik filtre içerir.
    2. Elektronik bağlantıyı kurun (Şekil 1). Stokes ışınının yoğunluğu, picosecond ayarlanabilir lazerin içinde 20 MHz'de yerleşik bir EOM ile modüle edilir. Lazerden modülasyon frekansı çıkışı, demodülasyon için referans frekansı olarak kilitlenmiş amplifikatöre girilir. SRL'yi demodüle etmek için fotodiyotun çıkış sinyalini kilitli amplifikatöre besleyin.
      NOT: Tek kutulu lazer sistemleri yükseltilebilir ve böylece özellikleri farklı üretim tarihine bağlı olarak değişebilir. Bu protokolde kullanılan picosecond ayarlanabilir lazer sisteminin önceki sürümü 1.064 nm'lik bir Stokes ışına sahiptir, ancak son sürüm 1.031 nm'lik bir Stokes ışına sahiptir. Bu protokolde kullanılan EOM modülasyon frekansı 8 MHz'e göre özelleştirilmiştir, ancak son sistem için varsayılan modülasyon frekansı 10 veya 20 MHz olabilir.
    3. Son olarak, elektrik analog sinyalini dijital sinyale dönüştürmek için kilitli amplifikatör çıkışını mikroskobun analog kutusuna besleyin. Sistem SRS sinyalini işlemeye hazır olmalıdır.
  3. Görüntüleme koşullarını en iyi duruma getirme
    1. Sistem hizalaması için kimyasal bir örnek yapın. Örneğin, mikroskobu optimize etmek için dodecane kullanın, çünkü dodecane C-H bağlarından çok güçlü bir SRS sinyaline sahiptir. Mini bir oda yapmak için güvenli bir conta kullanın; 5 μL dodecane koyun ve bir kapakla örtün.
      NOT: Dodecane örneğini belirsiz göründüğünde veya enkaz sunduğunda, 2-3 ay boyunca hizalama için kullanılabilecek yeni bir örnekle değiştirin.
    2. Numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin. Sıvı damlacıklara doğru şekilde odaklanın. Dodecane pedinin kenarı alarak daha hızlı yapılabilir. Kondenserini Kohler aydınlatması için ayarlayın.
    3. Görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Gecikme aşamasının doğru numaralarda olup olmadığını kontrol edin. Pompa ışını dalga boylarını 795,8 nm olarak ayarlayın. Bir IR sensör kartı ve IR görüntüleyici kullanarak pompa ışını yolunun hala doğru olup olmadığını kontrol edin.
    4. Picosecond sistem kontrol panelinde pompa kirişinin gücünü 200 mW'a ve Stokes ışınını 400 mW'a ayarlayın.
      NOT: Lazer çıkışından iki ışının post hedefine kadar olan lazer verimleri pompa için yaklaşık% 25 ve bu sistem kurulumu için Stokes için% 14'tür. Bu nedenle, pompa ışınının nesnel bir gücü yaklaşık 50 mW'tır ve Stokes kirişi için yaklaşık 56 mW'tır. Son picosecond lazer sisteminin darbe genişliği 6 ps'den 2 ps'ye değişti, bu nedenle uygulanan lazer gücü daha da düşük olmalıdır.
    5. Kilitleme amplifikatörü kazancını maksimuma ayarlayın. Hem kirişler hem de lazerin ana deklanşörü için deklanşörü açın.
    6. Örneği tarayın ve bilgisayar ekranındaki görüntüyü kontrol edin. Görüntüleme yazılımında ekran modunu Hi-Lo olarak değiştirin. Aralığı ~%50 doygunluk görecek şekilde ayarlayın. Doygunluğun görüntüde ortalanıp ortalanmadığını kontrol edin. Değilse, görüntü yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak ve tepe yoğunluğunu ortalamak için direksiyon aynalarını, M1 ve M2'yi dikkatlice ayarlayın.
    7. Gecikme aşamasına ince ayar yapın ve dodecane örneğinden maksimum SRS sinyal yoğunluğunu bulun. Sistem daha sonra kullanıma hazırdır.

2. SRS mikroskopi görüntüleme için C. elegans örneklerinin hazırlanması

NOT: Model organizmalar olarak, Caenorhabditis elegans'ın çoklu görüntüleme teknikleri için çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Tüm vücut şeffaftırlar, bu nedenle çeşitli dokular diseksiyona gerek kalmadan sağlam hayvanda görüntülenebilir. C. elegans'ta nötr lipitler, bağırsak lümeninin etrafında ikimetrik olarak bulunan 20 epitel hücresinden oluşan bağırsakta bulunan lipit damlacıklarında depolanır16. Hipodermal hücreler ve oositler de lipitleri depolar. C. elegans lipid damlacıklarındaki depolama lipitlerinin ana formu triacylglycerols (TAGs) 17 Yağ asidi zincirlerinde bulunan CH 2 bağlarının bolluğu nedeniyle güçlü SRS sinyalleri üreten17'dir. Bu bölümde C. elegans örneklerinin SRS mikroskopi görüntülemesi için nasıl hazırlanacağı ve toplam bağırsak lipit depolama seviyelerinin ölçülmesi üzerinde durulacaktır.

  1. Görüntüleme slaytlarının hazırlanması
    1. İlk olarak, damıtılmış H 2 O'da%2agarose çözeltisi hazırlayın ve agarose pedlerini hazırlamadan önce tüm agarose eriyiklerinden emin olun.
    2. İki kat laboratuvar bandı ile destek slaytları arasına yerleştirilen boş bir slayda (yaklaşık 100 μL) bir damla sıcak %2 agarose ekleyin ve ilk slaydın üzerine hızlı bir şekilde ikinci bir slayt yerleştirin. İnce, hatta agarose bir ped oluşturmak için hafifçe bastırın.
    3. Bu slaytları kapalı konumda bir kenara koyun ve solucanlar monte etmeye hazır olana kadar ayırmayın. Pedler 1 gün sonra kuruyacağından, her görüntüleme seansından önce taze slaytlar hazırlayın.
      NOT: Yüksek verimli genetik ekranlarda birkaç solucanı görüntüliyorsanız, çok iyi görüntüleme odaları kullanın18. Lipid metabolizmasının spatio-zamansal dinamiklerini geliştirme ve yaşlanma yoluyla görüntülemek için canlı görüntüleme kurulumlarını kullanın19.
  2. Solucanların montajı
    1. M9 tamponuna sırasıyla 100 mM veya 1 mM'lik son konsantrasyona sodyum azit veya levamisol ekleyerek anestezi maddesini hazırlayın.
      NOT: Genetik ekranlardan sonra genotipleme için görüntülemeden sonra solucanların kurtarılması gerekiyorsa levamisole kullanın.
      DİkKAT: Sodyum azit ve levamisol de dahil olmak üzere çeşitli anestezi ajanları solunursa zararlıdır. Koruyucu eldivenler ve giysiler giyin ve bu çalışma çözümlerini hazırlarken kimyasal bir duman başlığı kullanın.
    2. Bir kapak kılıfı için bir damla anestezi maddesi yerleştirin (10-20 solucan için yaklaşık 4-5 μL).
      NOT: Solucanları mümkün olduğunca birbirine yakın tutmak için analiz edici maddenin miktarını solucan numarasına göre ayarlayın. Birkaç solucan için çok fazla sıvı kullanmak, solucanların agarose pedinde yayılmasına neden olabilir.
    3. Diseksiyon mikroskopisi altında görüntülenecek solucanları seçin ve anestezi edici madde damlacığı ile aktarın. Tüm solucanlar damlacığın içine eklendikten sonra, solucan toplayıcıyı kullanarak hareket ettinin ve birbirleriyle çakışmadıklarından emin olun.
    4. Cam slaytları (adım 2.1'den) agarose pedini bozmadan ayırın.
    5. Solucan damlacığı agarose pedi olan cam slaytla örtün. Agarose pedinin solucanlara doğru dönük olduğundan emin olun. Alternatif olarak, anestezi yaşlanma damlacığı da agarose pedi üzerine eklenebilir ve solucanlar kapakla kaplanabilir.
    6. Son olarak, cam slaytta kalıcı bir işaretleyici kullanarak solucanların yerini işaretleyin.

3. Görüntü alma ve analiz

  1. Görüntüleri SRS mikroskop sistemini kullanarak elde etmek.
    1. Herhangi bir örneği görüntülemeden önce, görüntüleme parametrelerini belirleyin ve SRS sinyallerini doğrulayın (Protokol 1'de açıklandığı gibi).
    2. Slaytı, kapak altlığı objektif lense bakacak şekilde monte edin. Solucanları bulmak için parlak alan ışık kaynağını açın ve göz merceğine yönlendirin.
      NOT: Lipid deposunun tüm bağırsakta görüntülenerek 20x objektif lens kullanılması. Hipodermal yağ depolamayı görüntülemek veya lipid damlacık boyutunu / numarasını ölçmek için 60x objektif bir lens kullanmayı düşünün.
    3. Solucanları odak noktasına getirin ve kondenser konumunu buna göre ayarlayın.
    4. Parlak alan ışık kaynağını kapatın ve lazer tarama ünitesine geçin. İlk solucanı hızlı tarama hızında (örneğin, 512 x 512 piksel) taramaya başlayın ve ilgi alanını bulmak için ince odağı ayarlayın. Görüntülenecek ilk örnek için lazer güçlerini SRS sinyallerinin doygun olmadığı seviyeye ayarlayın.
    5. SRS görüntüsünü elde etmek için daha yavaş tarama hızına (örneğin, 2 μs/piksel) ve daha yüksek çözünürlüğe (örneğin, 1024 x 1024 piksel) geçin.
      NOT: Görüntüleme oturumu sırasında görüntülenecek her örnek için lazer güçlerini sabit tutun.
    6. SRS görüntüsünü yüksek çözünürlüğe (.tiff dosyası gibi) olanak sağlayan istediğiniz biçimde kaydedin. Kullanılan görüntüleme yazılımına ve kuruluma bağlı olarak, bir sonrakine geçmeden önce ilk solucanın konumunu kaydedin.
    7. Slayda monte edilen tüm solucanların tam görüntülemesi. Lazer ışınlarını engellemek için deklanşörü kapatın. Tüm örnekler görüntülenine kadar lazer kaynağını kapatmayın.
    8. Sonraki örnek slaydı yerleştirmeden önce slaydı kaldırın. 3.1.2–3.1.7 adımlarını yineleyin.
    9. Tüm örnekler görüntülendikten sonra, lazer kaynağını beklemeye alın ve amplifikatör, dedektör, mikroskop ve bilgisayar dahil olmak üzere ilgili ekipmanı kapatın.
  2. ImageJ kullanılarak görüntülerin analizi
    1. ImageJ'de ölçülecek görüntü dosyalarını (genellikle .tiff) dosyaları seçip ImageJ penceresine sürükleyip bırakarak açın. Belirli Olympus mikroskop biçimlerini (.oib dosyaları gibi) kullanıyorsanız, uygun ImageJ eklentilerini indirin.
    2. Analiz edilecek özellikleri seçin ( ÖlçümleriAnaliz > Ayarlayın). Toplam lipid depolama miktarı için Alan, Min ve Maksimum Gri Değer ve Ortalama Gri değer'i seçin.
    3. Çokgen seçim aracını kullanın ve ölçülecek solucan bağırsağı bölgesini özetler. 3.2.2 adımında seçilen parametreleri ölçmek için Ölçü> Çözümle 'yi tıklatın. Ölçüm sonuçlarını içeren yeni bir pencere açılır. Tüm açık görüntüler için bu adımı yineleyin.
    4. Belirli bir genotipteki tüm solucanların ölçümlerini seçin ve sonuçları kopyalayıp yeni bir elektronik tabloya yapıştırın. Aynı görüntüleme oturumundaki tüm genotipler için 3.2.1–3.2.4 adımlarını yineleyin.
    5. Solucanın çevresinde, arka plan olarak ölçmek için herhangi bir SRS sinyali olmayan bir alan seçin. Arka plan ölçümü için seçilen alanın SRS sinyali verebilecek bakteri veya döküntü içermediğinden emin olun.
    6. Her bir solucanın ölçümlerinden arka plan ortalama gri değerini çıkarın. Belirli bir genotip/test grubundaki tüm solucanlardan çıkarılan arka planın ortalama ve standart ortalama gri değerlerinin ortalama ve standart sapması hesaplayın. Bu değeri denetim grubunun ortalamasına normalleştirin.
    7. Son olarak, her solucandaki lipit seviyeleri için bir ölçü olarak ortalama gri değeri kullanarak uygun istatistiksel analizi gerçekleştirin. Genellikle, iki grup için Student'ın t-testini kullanın ve ikiden fazla grup için uygun bir çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA kullanın.
      NOT: Şekil sunumu için görüntüleri seçerken, seçilen görüntülerin aynı piksel yoğunluğu dağılımına sahip olduğundan emin olun. Parlaklığı ve kontrastı aynı şekildeki tüm görüntüler için aynı değerlere ayarlayın (Görüntü > parlaklığı ve kontrastı> ayarlayın).

Sonuçlar

İnsülin sinyali, gelişimi, üremeyi, ömrü ve metabolizmayı etkileyen önemli bir endokrin yoldur. Solucanlarda, insülin sinyali yaklaşık 40 insülin benzeri peptid ligand, insülin benzeri büyüme faktörü reseptör reseptör ortolog DAF-2, aşağı akış PI3K / AKT kinaz kaskad ve FoxO transkripsiyon faktörü ortolog, DAF-1620oluşur. insülin reseptöründen yoksun daf-2 mutantların bağırsaklarında daha fazla lipit damlacıkları vardır, solucan lipid depolama dokusu

Tartışmalar

Obezite ve buna bağlı metabolik bozukluklara karşı savunmada, lipid homeostazının düzenleyici mekanizmalarını daha iyi anlamak için önemli araştırma çalışmaları uygulanmıştır. Biyolojik örneklerde lipit moleküllerinin nicel olarak tespiti için SRS mikroskopisi ile etiketsiz görüntülemenin biyokimyasal tahlillere ve diğer boyama yöntemlerine güvenilir bir alternatif olduğu kanıtlanmıştır. Grubumuz ve diğerleri, C. elegans ve SRS mikroskopisi12 , 18 , 28 , 29

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH hibeleri R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W. ), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.) ve HHMI araştırmacısı (M.C.W.). Caenorhabditis Genetics Center'a (CGC) C. elegans suşları için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
A/D converterOlympusAnalog Unit
AgaroseGeneMate3119For making agarose pads
Alignment tool - adapterThorlabsSM1A4For mounting the tool on scope
Alignment tool - targetThorlabsVRC2SM1For viewing IR laser
Alignment tool - tubeThorlabsSM1L40Length can vary
Autocorrelator (Optional)APEpulseCheck
Bandpass filterminicircuitsBBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHzFor signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscopeNikonSMZ800For handling and picking worms for imaging
DodecaneSigma-Aldrich44010Used for calibration of the SRS signal
FilterChroma Technology890/220 CARSFor removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tapeVWR89097For making agarose pads
Glass coverslipsVWR48393-106For covering worms for imaging
Glass microscope slideVWR16004-422For making agarose pads
Laser scanning microscopeOlympusFV3000
LensThorlabsL1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B		For beam expander
Lock-in amplifierZurichHF2LI
Lowpass filterminicircuitsBLP-1.9+For power supply noise suppression
MirrorsThorlabsBB1-E03For relay and periscope
ObjectiveOlympusUPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
PhotodiodeThorlabsFDS1010
Picosecond laser sourceAPEpicoEmerald
Power supplyTEKPOWERTP1342UFor photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azideSigmaS2002For anaesthesizing the worms
Worm pickerWormStuff59-AWP

Referanslar

  1. Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
  2. Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
  3. Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
  4. Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
  5. Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
  6. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
  7. Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 271-291 (2017).
  8. Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
  9. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 883-909 (2008).
  10. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  11. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  12. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  13. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  14. Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
  15. Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).
  16. Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
  17. Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
  18. Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865 (2017).
  19. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
  20. Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
  21. Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
  22. Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (2), 413-446 (2017).
  23. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
  24. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  25. Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (2), 613-629 (2015).
  26. Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
  27. Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450 (2020).
  28. Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
  29. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  30. Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
  31. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
  32. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
  33. Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
  34. Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
  35. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  36. Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), 152-155 (2018).
  37. Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
  38. Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
  39. Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930 (2015).
  40. Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
  41. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  42. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  43. Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 171Raman g r nt lemeUyar lm Raman Sa lma mikroskopisiSRS mikroskopisiC eleganslipid metabolizmaslipitleryalipit damlac klaretiketsiz g r nt lemelipid g r nt lemecanl g r nt leme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır