Markierungsfreie Bildgebung der Lipidspeicherdynamik in Caenorhabditis elegans mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Zusammenfassung

Die stimulierte Raman-Streumikroskopie (SRS) ermöglicht eine selektive, markierungsfreie Abbildung bestimmter chemischer Bestandteile und wurde effektiv zur Abbildung von Lipidmolekülen in vivo eingesetzt. Hier geben wir eine kurze Einführung in das Prinzip der SRS-Mikroskopie und beschreiben Methoden zu deren Einsatz bei der bildgebenden Lipidspeicherung bei Caenorhabditis elegans.

Zusammenfassung

Der Fettstoffwechsel ist ein grundlegender physiologischer Prozess, der für die Gesundheit von Zellen und Organismen notwendig ist. Eine Dysregulation des Fettstoffwechsels löst oft Fettleibigkeit und viele damit verbundene Krankheiten wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-II-Diabetes und Krebs aus. Um das aktuelle Verständnis der Lipidmetabolregulation voranzutreiben, sind quantitative Methoden zur präzisen Messung der In-vivo-Lipidspeicher in Zeit und Raum immer wichtiger und nützlicher geworden. Herkömmliche Ansätze zur Analyse der Lipidspeicherung sind semi-quantitativ für die mikroskopische Beurteilung oder es fehlen räumlich-zeitliche Informationen für biochemische Messungen. Die stimulierte Raman-Streuung (SRS)-Mikroskopie ist eine markierungsfreie chemische Bildgebungstechnologie, die einen schnellen und quantitativen Nachweis von Lipiden in lebenden Zellen mit subzellulärer Auflösung ermöglicht. Da der Kontrast durch intrinsische molekulare Schwingungen ausgenutzt wird, ermöglicht die SRS-Mikroskopie auch die vierdimensionale Verfolgung von Lipiden bei lebenden Tieren. In den letzten zehn Jahren wurde die SRS-Mikroskopie häufig für die Bildgebung kleiner Moleküle in der biomedizinischen Forschung eingesetzt und überwand die großen Einschränkungen herkömmlicher fluoreszierender Färbe- und Lipidextraktionsmethoden. Im Labor haben wir die SRS-Mikroskopie mit den genetischen und biochemischen Werkzeugen kombiniert, die dem leistungsstarken Modellorganismus Caenorhabditis elegans zur Verfügung stehen, um die Verteilung und Heterogenität von Lipidtröpfchen über verschiedene Zellen und Gewebe hinweg zu untersuchen und schließlich neue konservierte Signalwege zu entdecken, die den Fettstoffwechsel modulieren. Hier stellen wir die Arbeitsprinzipien und den detaillierten Aufbau des SRS-Mikroskops vor und stellen Methoden für seine Verwendung zur Quantifizierung der Lipidspeicherung zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten der Wildtyp- und Insulinsignalisierung der mangelhaften Mutante C. eleganszur Verfügung.

Einleitung

Fettleibigkeit ist zu^einem globalen Gesundheitsproblem geworden, das ein Drittel der Bevölkerung auf der ganzen Welt bedroht, und es stellt ein ernstes medizinisches Problem dar, da es mit schlechter psychischer Gesundheit 1 und tödlichen Krankheiten wie Diabetes^2,Herz-Kreislauf-Erkrankungen³ und einigen Krebsarten^{4 in}Verbindung steht. Das Studium des Fettstoffwechsels ist unerlässlich, um die biologischen Probleme hinter Fettleibigkeit besser zu verstehen. Die schnelle und spezifische Quantifizierung der Lipidspeicherung beinhaltet den Nachweis von Fettsäuren und deren Derivaten sowie sterolhaltigen Metaboliten mit hoher Sensitivität und vorzugsweise mit räumlichen Informationen. Lipide sind schwierige Ziele, da sie keine intrinsische Fluoreszenz haben und nicht leicht fluoreszierend markiert werden können. Die fluoreszierenden Tags sind oft größer als die Lipidmoleküle und können daher chemisch invasiv und für In-vivo-Anwendungen unpraktisch sein. Eine markierungsfreie oder minimale Markierungsstrategie ist notwendig, um die hydrophobe Struktur der Lipidmoleküle zu erhalten⁵. Jüngste Entwicklungen in der Bildgebung haben aufregende Möglichkeiten für die markierungsfreie Bildgebung von Lipiden in lebenden Zellen, Geweben und Organismen geschaffen.

Traditionelle Ansätze für Lipidspeicheranalysen in biologischen Proben umfassen biochemische Assays und Färbeprotokolle mit lipophilen Farbstoffen. Biochemische Quantifizierungsassays mit Massenspektrometrie (MS) sind in ihrer molekularen Auflösungsfähigkeit unübertroffen, erfordern jedoch sehr große Probenmengen und die Probenvorbereitung dauert in der Regel mehrere Stunden, was ihre Anwendung für die Echtzeitbildgebung lebender Systeme einschränkt⁵. Eine weitere große Einschränkung dieser Assays ist der Mangel an räumlichen Informationen. Auf der anderen Seite sorgen lipophile Farbstoffe wie Oil Red O und Sudan Black für die Gewebe- und Zellverteilung von Lipidspeicherorganellen und im Vergleich zu MS-Techniken sind diese Färbemethoden auch kostengünstig und einfach durchzuführen. Diese Färbeprotokolle erfordern jedoch eine Fixierung, die sich auf die hydrophobe Natur der Lipidtröpfchen auswirken, künstliche Veränderungen in ihrer Struktur erzeugen und zu Inkonsistenzen zwischen den Experimenten führen kann⁶. Die technischen Schwierigkeiten, die mit biochemischen und Färbetechniken verbunden sind, haben zur Suche nach markierungsfreien Methoden zur Abbildung von Lipidmolekülen und zu einer raschen Zunahme der Verwendung kohärenter Raman-Streumikroskopie (CRS) in der Lipidbildgebung geführt.

Der Raman-Effekt wurde zuerst von Raman und Krishnan erkannt, wo sie berichteten, dass ein Molekül bei der Wechselwirkung mit einem Photon gestreutes Licht ohne Änderung der Wellenlänge (Rayleigh-Streuung genannt) oder selten mit einer veränderten Wellenlänge (Raman-Streuung genannt) erzeugen kann, und diese Änderung der Wellenlänge ist charakteristisch für die funktionellen chemischen Gruppen innerhalb des^{Moleküls 7}. Wenn die chemischen Bindungen innerhalb eines Moleküls durch ein einfallendem Photon, das als Pumpphoton bezeichnet wird, auf ein höheres Schwingungsenergieniveau angeregt werden, wird die Energie des gestreuten Photons, das Stokes-Photon genannt, niedriger. Andernfalls können die chemischen Bindungen ein niedrigeres Schwingungsenergieniveau erreichen, wenn sie sich ursprünglich auf einem höheren Niveau befinden, und das gestreute Photon gewinnt Energie, um das Anti-Stokes-Photon zu sein. Der Frequenzunterschied zwischen den einfallenden und gestreuten Photonen wird als Raman-Verschiebung bezeichnet. Jede chemische Bindung innerhalb eines Moleküls hat eine charakteristische und quantifizierbare Raman-Verschiebung. Zum Beispiel hat die_CH2-Bindung eine Raman-Verschiebung von 2.845 cm^-1, die in Fettsäureketten reichlich vorhanden ist⁸. Dieses spontane Raman-Signal ist im Allgemeinen sehr schwach, was die Bildgebungsgeschwindigkeit in der herkömmlichen spontanen Raman-Mikroskopie stark eingeschränkt hat. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um die Bildgebungsgeschwindigkeit und Empfindlichkeit der spontanen Raman-Mikroskopie zu erhöhen. Die kohärente Raman-Streumikroskopie, einschließlich der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie (CARS) und der stimulierten Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie, ist der jüngste Fortschritt. CARS und SRS haben leicht unterschiedliche Arbeitsprinzipien, aber beide sind markierungsfreie Techniken, die Live-Imaging-Fähigkeit haben, räumliche und zeitliche Informationen über die Dynamik der Lipidspeicherung liefern können und nur eine kleine Stichprobengröße erfordern. Die CARS-Mikroskopie leidet unter einem nicht-resonanten Hintergrund, der von verschiedenen nichtlinearen Prozessen herrgeht, und CARS-Signale haben auch eine nichtlineare Beziehung zur Molekülkonzentration, was zusammen den Quantifizierungsprozess erschwert⁹. Im Gegensatz zur CARS-Mikroskopie erzeugt die SRS-Mikroskopie keine nicht-resonanten Hintergrundsignale und bietet eine lineare Abhängigkeit von der Konzentration des interessierenden Moleküls. Daher wird die SRS-Mikroskopie derzeit häufiger für die Lipidbildgebung eingesetzt.

In der SRS-Mikroskopie können die schwachen spontanen Raman-Signale verstärkt werden, wenn sie von zwei synchronisierten Laserstrahlen angeregt werden, deren Frequenzdifferenz mit der Schwingungsfrequenz der chemischen Bindung übereinstimmt. Das Molekül wird aufgrund kohärenter Anregung einen verstärkten Übergang in einen angeregten Zustand erfahren. Infolgedessen wird die Rate der Stokes-Photonenerzeugung erhöht. Folglich nimmt die Intensität des übertragenen "Stokes"-Strahls zu (stimulierte Raman-Verstärkung, SRG) und die Intensität des übertragenen "Pump"-Strahls ab (stimulierter Raman-Verlust, SRL). Die Detektion von SRG- oder SRL-Signalen liegt der Grundlage für die mikroskopische Bildgebung von Molekülen mit spezifischen chemischen Bindungen (SRS)¹⁰zugrunde. Stimmt die Frequenzdifferenz zwischen den beiden Laserstrahlen nicht mit der Schwingungsfrequenz der chemischen Bindung innerhalb eines interessierenden Moleküls überein, werden weder SRG- noch SRL-Signale erzeugt. Die Bildgeschwindigkeit der SRS-Mikroskopie liegt bei etwa 2 μsec pro Pixel oder 1 Sekunde pro Bild, was viel schneller ist als die spontane Raman-Mikroskopie^11. Typische laterale Auflösung für die SRS-Mikroskopie ist beugungsbegrenet und um die 300 nm. Darüber hinaus ermöglichen die optischen Zwei-Photonen-Verfahren der SRS-Mikroskopie eine volumetrische 3D-Bildgebung von relativ dicken Gewebeproben und die Bildtiefe könnte 300-500 μm erreichen. Insgesamt stellt die SRS-Mikroskopie eine effiziente, markierungsfreie Bildgebungstechnik dar, um spezifische Biomoleküle, insbesondere Lipide, nachzuweisen.

Lipidtröpfchen sind Einmembranorganellen, die die Hauptspeicherstelle für neutrale Lipide sind, einschließlich der Triacylglycerole (TAGs) und Cholesterinester (CEs). CH2-Bindungen in den Fettsäureketten dieser Lipidmoleküle erzeugen starke SRS-Signale bei 2.845 cm^-1, wenn sie⁸angeregt werden, wodurch der Nachweis und die Quantifizierung von Speicherlipidspiegeln in intakten Zellen, Gewebeabschnitten und sogar ganzen Organismen ermöglicht^{wird 12,13,14,15}. Insbesondere C. elegans sind aufgrund ihrer Transparenz für Lipidbildgebungsstudien nützlich. Wie Säugetiere speichert auch C. elegans Lipide in Lipidtröpfchen und die Synthese- und Abbauwege von Lipidmolekülen sind hoch konserviert¹⁶. In diesem Protokoll werden wir das Funktionsprinzip der SRS-Mikroskopie, ihren grundlegenden Aufbau und die Methoden für ihre Verwendung in der Lipidbildgebung in C. elegansbeschreiben.

Protokoll

1. Instrumenteller Aufbau für stimulierte Raman-Streumikroskopie

HINWEIS: Das SRS-Mikroskopiesystem basiert auf einem Pikosekundenlaser mit pumpenintegriertem optischem parametrischem Oszillator und einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop. Der Oszillator liefert zwei Pikosekunden-Pulszüge, darunter einen Stokes-Strahl bei 1.064 nm und einen Pumpstrahl, der zwischen 700 und 990 nm abstimmbar ist. Zeitliche und räumliche Überlappungen der beiden Strahlen werden im Inneren des Lasers erreicht. Ein eingebauter elektrooptischer Modulator (EOM) wurde speziell für die SRS-Mikroskopie entwickelt. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Kopplung des Lasers mit dem Mikroskop und den täglichen Betrieb dieses Systems (Abbildung 1). Die Konfiguration eines SRS-Mikroskopsystems hat sich in den letzten zehn Jahren weiterentwickelt. Es ist zu beachten, dass die folgende Beschreibung nur eine der verschiedenen Konfigurationen darstellt.

1. Einspeisung von Laserstrahlen in das Mikroskop
   1. Richten Sie das Periskop so ein, dass der Strahl vom Ausgang der Pikosekunden-Lichtquelle zum IR-Lasereingangsanschluss am Scanner des Mikroskops gehoben wird.
      ACHTUNG: Lesen Sie vor der Operation das Handbuch des Lasersystems und treffen Sie alle erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen, da die von diesem Lasersystem der Klasse IV erzeugte Nahinfrarotstrahlung Augen und Haut schwer schädigen kann. Absolvieren Sie die Schulungen, die von den institutionellen Umweltsicherheitsabteilungen gefordert werden. Tragen Sie schutzbrillen und Laborkittel mit manschettenbeschten Ärmeln.
   2. Stellen Sie zunächst den Pumpenstrahl auf 750 nm ein und senken Sie die Laserleistung auf 50 mW, die visuell inspiziert werden kann, wodurch die Ausrichtung angepasst wird. Verwenden Sie dann einen Strahlexp expander(Abbildung 1,L1 und L2), um den Strahldurchmesser an die hintere Öffnung von Mikroskopzielen anzupassen. Verwenden Sie zwei Relaisspiegel(Abbildung 1,M1 und M2), um den Laserstrahl zum Periskop zu leiten(Abbildung 1,P1 und P2). Das Periskop hebt den Strahl auf die Höhe der Scanneröffnung und dient auch als Lenkspiegel für die Ausrichtung.
   3. Stellen Sie die Knöpfe am Periskop in der Mitte des Stimmbereichs ein und wählen Sie die Ausgangsposition und den Winkel jedes Spiegels so, dass der Laserstrahl ungefähr auf die Mitte des Spiegels trifft.
   4. Führen Sie die grobe Ausrichtung mit einem leeren Anschluss am Objektivrevolver durch und platzieren Sie die Leistungsmessersonde, um die Leistung des durchgelassenen Lichts zu messen. Stellen Sie den Scanner des Mikroskops auf den höchsten Zoom (50x) und messen Sie dann die Leistung des durchgelassenen Lichts mit dem fokussierten Laserstrahlpunkt. Optimieren Sie die Knöpfe an jedem Spiegel, M1 und M2, iterativ, um die höchste übertragene Laserleistung zu erzielen.
   5. Führen Sie die Feinausrichtung mit dem Ausrichtungswerkzeug durch. Setzen Sie die Kappe für das Fluoreszenzziel auf den leeren Objektivsitz und stellen Sie die Knöpfe von M1 so ein, dass der Punkt zentriert wird. Führen Sie dann das Verlängerungsrohr für das Ziel ein und stimmen Sie die Knöpfe von M2 ab, um den Punkt zu zentrieren.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.4 und 1.1.5, bis der Strahl das Ziel an beiden Positionen zentriert.
2. Verbindung von Detektion und Elektronik
   1. Richten Sie das SRS-Erkennungsmodul ein. Platzieren Sie einen Strahlteilerwürfel nach dem Kondensator, um den übertragenen Laser zum Fotodiodenmodul zu leiten. Das Modul enthält ein Teleskop zum Relais und Ändern der Strahlgröße, um es an den aktiven Bereich der Fotodiode anzupassen, sowie einen optischen Filter, um den modulierten Stokes-Strahl zu entfernen und den Pumpenstrahl zur Demodulation durchgehen zu lassen.
   2. Richten Sie den Elektronikanschluss ein (Abbildung 1). Die Intensität des Stokes-Strahls wird durch ein eingebautes EOM bei 20 MHz im Pikosekunden-abstimmbaren Laser moduliert. Die Modulationsfrequenzausgabe des Lasers wird als Referenzfrequenz für die Demodulation in den Lock-in-Verstärker eingegeben. Speisen Sie das Ausgangssignal der Fotodiode in den Lock-in-Verstärker ein, um das SRL zu demodulieren.
      HINWEIS: Die One-Box-Lasersysteme können aufgerüstet werden und daher können ihre Spezifikationen aufgrund unterschiedlicher Produktionsdatum variieren. Die vorherige Version des pikosekundentimen abstimmbaren Lasersystems, das in diesem Protokoll verwendet wird, hat einen Stokes-Strahl von 1.064 nm, aber die neueste Version hat einen Stokes-Strahl von 1.031 nm. Die modulationsfrequenz von EOM, die in diesem Protokoll verwendet wird, ist auf 8 MHz angepasst, aber die Standardmodulationsfrequenz für das neueste System kann 10 oder 20 MHz betragen.
   3. Schließlich speisen Sie den Lock-in-Verstärkerausgang in die analoge Box des Mikroskops ein, um elektrisches analoges Signal in digitales Signal umzuwandeln. Das System sollte bereit sein, das SRS-Signal zu verarbeiten.
3. Optimierung der Bildgebungsbedingungen
   1. Machen Sie eine chemische Probe für die Systemausrichtung. Verwenden Sie beispielsweise Dodecan, um das Mikroskop zu optimieren, da Dodecan ein sehr starkes SRS-Signal von den C-H-Bindungen hat. Verwenden Sie eine sichere Dichtung, um eine Minikammer herzustellen. 5 μL Dodecan geben und mit einem Deckblatt bedecken.
      HINWEIS: Ersetzen Sie die Dodecanprobe, sobald sie unklar aussieht oder Trümmer aufwies, durch eine neue Probe, die für 2-3 Monate zur Ausrichtung verwendet werden kann.
   2. Legen Sie die Probe auf den Mikroskopstand. Konzentrieren Sie sich richtig auf den Flüssigkeitströpfchen. Es kann schneller gemacht werden, indem man nach dem Rand des Dodecan-Pads sucht. Stellen Sie den Kondensator für die Kohler-Beleuchtung ein.
   3. Legen Sie die Imaging-Parameter fest. Überprüfen Sie, ob die Verzögerungsstufe auf den richtigen Zahlen ist. Stellen Sie die Wellenlänge des Pumpenstrahls auf 795,8 nm ein. Überprüfen Sie mithilfe einer IR-Sensorkarte und eines IR-Viewers, ob der Pumpenstrahlweg noch korrekt ist.
   4. Stellen Sie die Leistung des Pumpenstrahls auf 200 mW und den Stokes-Strahl auf 400 mW auf dem Bedienfeld des Pikosekundensystems ein.
      HINWEIS: Die Laserdurchsätze vom Laserausgang bis zum Postobjektiv der beiden Strahlen betragen ungefähr 25% für die Pumpe und 14% für Stokes für diesen Systemaufbau. Daher beträgt eine postobjektive Leistung des Pumpenstrahls etwa 50 mW und für den Stokes-Strahl etwa 56 mW. Die Pulsbreite des neueren Pikosekunden-Lasersystems hat sich von 6 ps auf 2 ps geändert, daher sollte die aufgebrachte Laserleistung noch geringer sein.
   5. Stellen Sie die Lock-in-Verstärkerverstärkung auf Maximum ein. Öffnen Sie den Verschluss sowohl für die Strahlen als auch für den Hauptverschluss des Lasers.
   6. Scannen Sie die Probe und überprüfen Sie das Bild auf dem Computerbildschirm. Ändern Sie den Anzeigemodus in der Bildgebungssoftware in Hi-Lo. Passen Sie den Bereich an, um eine Sättigung von ~ 50% zu sehen. Überprüfen Sie, ob die Sättigung im Bild zentriert ist. Wenn nicht, passen Sie die Lenkspiegel M1 und M2 sorgfältig an, um die Bildintensität zu maximieren und die Spitzenintensität zu zentrieren.
   7. Stimmen Sie die Verzögerungsstufe fein ab und finden Sie die maximale SRS-Signalintensität aus der Dodecan-Probe. Das System ist dann einsatzbereit.

2. Vorbereitung von C. elegans Proben für die SRS-Mikroskopie

HINWEIS: Als Modellorganismen hat sich Caenorhabditis elegans als sehr nützlich für mehrere bildgebende Verfahren erwiesen. Sie sind ganzkörpertransparent, daher können verschiedene Gewebe im intakten Tier abgebildet werden, ohne dass eine Dissektion erforderlich ist. Bei C. elegans werden neutrale Lipide in Lipidtröpfchen im Darm gespeichert, der aus 20 Epithelzellen besteht, die sich bisymmetrisch um das Darmlumen¹⁶befinden. Hypodermale Zellen und Eizellen speichern auch Lipide. Die Hauptform der Speicherlipide in C. elegans Lipidtröpfchen sind die Triacylglycerole (TAGs)¹⁷, die aufgrund der Fülle von_{CH2-Bindungen} in ihren Fettsäureketten starke SRS-Signale erzeugen. Dieser Abschnitt konzentriert sich auf die Vorbereitung von C. elegans-Proben für die SRS-Mikroskopie und die Quantifizierung ihrer gesamten intestinalen Lipidspeicherung.

1. Vorbereitung der bildgebenden Dias
   1. Bereiten Sie zuerst 2% ige Agaroselösung in destilliertem_H2Ovor und stellen Sie sicher, dass alle Agarose schmilzt, bevor Sie die Agarose-Pads vorbereiten.
   2. Fügen Sie einen Tropfen warmer 2% Agarose auf einen leeren Objektträger (ca. 100 μL) hinzu, der mit zwei Schichten Laborband zwischen Trägerobjektträgern platziert wird, und legen Sie schnell einen zweiten Objektträger auf den ersten Objektträger. Drücken Sie vorsichtig, um ein dünnes, gleichmäßiges Agarose-Pad zu erzeugen.
   3. Stellen Sie diese Schlitten in geschlossener Position beiseite und trennen Sie sie nicht, bis die Würmer bereit sind, montiert zu werden. Bereiten Sie vor jeder Bildgebungssitzung frische Dias vor, da die Pads nach 1 Tag trocknen.
      HINWEIS: Verwenden Sie Multi-Well-Bildgebungskammern, wenn Sie mehrere Würmer in genetischen Hochdurchsatz-Screens^{abbilden 18}. Verwenden Sie Live-Imaging-Setups, um die räumlich-zeitliche Dynamik des Fettstoffwechsels durch Entwicklung und Alterung^{abbilden 19}.
2. Montage der Würmer
   1. Bereiten Sie das Betäubungsmittel vor, indem Sie Natriumazid oder Levamisol im M9-Puffer auf die Endkonzentration von 100 mM bzw. 1 mM hinzufügen.
      HINWEIS: Verwenden Sie Levamisol, wenn die Würmer nach der Bildgebung zur Genotypisierung nach genetischen Screens wiederhergestellt werden müssen.
      VORSICHT: Mehrere Anästhetisierungsmittel, einschließlich Natriumazid und Levamisol, sind beim Einatmen schädlich. Tragen Sie Schutzhandschuhe und -kleidung sowie einen chemischen Abzug, wenn Sie diese Arbeitslösungen vorbereiten.
   2. Geben Sie einen Tropfen Betäubungsmittel in einen Coverlip (ca. 4–5 μL für 10–20 Würmer).
      HINWEIS: Passen Sie die Menge des Betäubungsmittels entsprechend der Wurmzahl an, um die Würmer so nah wie möglich beieinander zu halten. Die Verwendung von zu viel Flüssigkeit für wenige Würmer kann dazu führen, dass sich die Würmer auf dem Agarose-Pad ausbreiten.
   3. Wählen Sie die Würmer aus, die unter der Dissektionsmikroskopie abgebildet werden sollen, und übertragen Sie sie auf das Betäubungsmitteltröpfchen. Nachdem alle Würmer dem Tröpfchen hinzugefügt wurden, bewegen Sie sie mit dem Wurmpicker und stellen Sie sicher, dass sie sich nicht überlappen.
   4. Trennen Sie die Glasobjektträger (ab Schritt 2.1), ohne das Agarose-Pad zu belästigen.
   5. Decken Sie den Wurmtropfen mit dem Glasträger ab, der das Agarose-Pad enthält. Stellen Sie sicher, dass das Agarose-Pad zu den Würmern zeigt. Alternativ kann das anästhesierende Alterungströpfchen auch auf das Agarose-Pad aufgesetzt und Würmer mit dem Coverlip abgedeckt werden.
   6. Markieren Sie abschließend die Position der Würmer mit einem Permanentmarker auf dem Glasobjektträger.

3. Bilderfassung und -analyse

1. Erfassung der Bilder mit dem SRS-Mikroskopsystem.
   1. Bevor Sie eine Probe abbilden, bestimmen Sie die Bildgebungsparameter und überprüfen Sie die SRS-Signale (wie in Protokoll 1 erläutert).
   2. Befesten Sie den Schlitten mit dem Abdeckdeckel zum Objektiv. Schalten Sie die Hellfeldlichtquelle ein und richten Sie sie zum Okular, um die Würmer zu lokalisieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein 20-fach objektives Objektiv, um die Lipidspeicherung im gesamten Darm abbilden. Erwägen Sie die Verwendung eines 60-fach objektiven Objektivs, um die hypodermale Fettspeicherung abbilden oder die Größe / Anzahl der Lipidtröpfchen zu quantifizieren.
   3. Bringen Sie die Würmer in den Fokus und passen Sie die Kondensatorposition entsprechend an.
   4. Schalten Sie die Hellfeldlichtquelle aus und wechseln Sie zur Laserscanning-Einheit. Beginnen Sie mit dem Scannen des ersten Wurms mit einer schnellen Scanrate (z. B. 512 x 512 Pixel) und passen Sie den Feinfokus an, um den interessierenden Bereich zu finden. Für die erste zu bildunterschriftsartige Probe stellen Sie die Laserleistung auf den Pegel ein, auf dem SRS-Signale nicht gesättigt sind.
   5. Wechseln Sie zu einer langsameren Abtastrate (z. B. 2 μs/Pixel) und einer höheren Auflösung (z. B. 1024 x 1024 Pixel), um das SRS-Bild zu erhalten.
      HINWEIS: Halten Sie die Laserleistung für jede Probe, die während der Bildgebungssitzung abgebildet werden soll, konstant.
   6. Speichern Sie das SRS-Bild im gewünschten Format, das eine hohe Auflösung ermöglicht (z. B. eine .tiff Datei). Speichern Sie je nach verwendeter Bildgebungssoftware und Setup den Standort des ersten Wurms, bevor Sie zum nächsten übergehen.
   7. Vollständige Bildgebung aller Würmer, die auf dem Objektträger montiert wurden. Schalten Sie den Verschluss aus, um die Laserstrahlen zu blockieren. Schalten Sie die Laserquelle erst aus, wenn alle Proben abgebildet sind.
   8. Entfernen Sie die Folie, bevor Sie die nächste Beispielfolie platzieren. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.2 bis 3.1.7.
   9. Sobald alle Proben abgebildet sind, stellen Sie die Laserquelle in den Standby-Modus und schalten Sie die zugehörige Ausrüstung einschließlich des Verstärkers, des Detektors, des Mikroskops und des Computers aus.
2. Analyse von Bildern mit ImageJ
   1. Öffnen Sie die Bilddateien (normalerweise .tiff), die in ImageJ quantifiziert werden sollen, indem Sie die Dateien auswählen und per Drag & Drop in das ImageJ-Fenster ziehen. Laden Sie die entsprechenden ImageJ-Plug-Ins herunter, wenn Sie bestimmte Olympus-Mikroskopformate (z. B. OIB-Dateien) verwenden.
   2. Wählen Sie die zu analysierenden Eigenschaften aus (Analysieren > Messungen festlegen). Wählen Sie für die Quantifizierung des gesamten Lipidspeichers Die Option Fläche, Mindest- und Max. Grauwert und Mittelwert grau aus.
   3. Verwenden Sie das Polygonauswahlwerkzeug und skizzieren Sie die Region des Wurmdarms, die quantifiziert werden soll. Um die in Schritt 3.2.2 ausgewählten Parameter zu messen, klicken Sie auf Analysieren > Messen. Ein neues Fenster mit den Messergebnissen wird angezeigt. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle geöffneten Bilder.
   4. Wählen Sie die Messungen für alle Würmer in einem bestimmten Genotyp aus und kopieren Sie die Ergebnisse in eine neue Tabelle. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 bis 3.2.4 für alle Genotypen in derselben Bildgebungssitzung.
   5. Wählen Sie einen Bereich in der Nähe des Wurms aus, der kein SRS-Signal hat, um ihn als Hintergrund zu quantifizieren. Stellen Sie sicher, dass der für die Hintergrundmessung ausgewählte Bereich keine Bakterien oder Trümmer enthält, die auch ein SRS-Signal geben könnten.
   6. Subtrahieren Sie den Hintergrundmittel-Grauwert von den Messungen jedes einzelnen Wurms. Berechnen Sie den Durchschnitt und die Standardabweichung der im Hintergrund subtrahierten mittleren Grauwerte von allen Würmern in einem bestimmten Genotyp / einer bestimmten Testgruppe. Normalisieren Sie diesen Wert auf den Durchschnitt der Kontrollgruppe.
   7. Führen Sie schließlich die entsprechende statistische Analyse durch, indem Sie den mittleren Grauwert als Maß für den Lipidgehalt in jedem Wurm verwenden. Verwenden Sie in der Regel den t-Testvon Student für zwei Gruppen und verwenden Sie einseitige ANOVA mit einem geeigneten Mehrfachvergleichstest für mehr als zwei Gruppen.
      HINWEIS: Stellen Sie bei der Auswahl von Bildern für die Darstellung von Abbildungen sicher, dass diese ausgewählten Bilder die gleiche Pixelintensitätsverteilung aufweisen. Legen Sie Helligkeit und Kontrast für alle Bilder in derselben Abbildung auf die gleichen Werte fest (Bild > > Helligkeit und Kontrast anpassen ).

Ergebnisse

Insulinsignalisierung ist ein wichtiger endokriner Weg, der Entwicklung, Fortpflanzung, Lebensdauer und Stoffwechsel beeinflusst. Bei Würmern besteht die Insulinsignalisierung aus etwa 40 insulinähnlichen Peptidliganden, insulinähnlichen Wachstumsfaktorrezeptororthologe DAF-2, nachgeschalteter PI3K/AKT-Kinasekaskade und dem FoxO-Transkriptionsfaktor-Ortholog, DAF-16²⁰. daf-2 Mutanten, denen der Insulinrezeptor fehlt, haben mehr Lipidtröpfchen in ihrem Darm, das Wurmlipidspeichergewebe...

Diskussion

Zur Abwehr von Fettleibigkeit und den damit verbundenen Stoffwechselstörungen wurden wichtige Forschungsanstrengungen unternommen, um die Regulationsmechanismen der Lipidöostase besser zu verstehen. Für den quantitativen Nachweis von Lipidmolekülen in biologischen Proben hat sich die markierungsfreie Bildgebung mittels SRS-Mikroskopie als zuverlässige Alternative zu biochemischen Assays und anderen Färbemethoden erwiesen. Unsere Gruppe und andere haben neue biologische Mechanismen in der Lipidstoffwechselregulation...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/D converter	Olympus	Analog Unit
Agarose	GeneMate	3119	For making agarose pads
Alignment tool - adapter	Thorlabs	SM1A4	For mounting the tool on scope
Alignment tool - target	Thorlabs	VRC2SM1	For viewing IR laser
Alignment tool - tube	Thorlabs	SM1L40	Length can vary
Autocorrelator (Optional)	APE	pulseCheck
Bandpass filter	minicircuits	BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz	For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope	Nikon	SMZ800	For handling and picking worms for imaging
Dodecane	Sigma-Aldrich	44010	Used for calibration of the SRS signal
Filter	Chroma Technology	890/220 CARS	For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape	VWR	89097	For making agarose pads
Glass coverslips	VWR	48393-106	For covering worms for imaging
Glass microscope slide	VWR	16004-422	For making agarose pads
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Lens	Thorlabs	L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B	For beam expander
Lock-in amplifier	Zurich	HF2LI
Lowpass filter	minicircuits	BLP-1.9+	For power supply noise suppression
Mirrors	Thorlabs	BB1-E03	For relay and periscope
Objective	Olympus	UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode	Thorlabs	FDS1010
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Power supply	TEKPOWER	TP1342U	For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide	Sigma	S2002	For anaesthesizing the worms
Worm picker	WormStuff	59-AWP