Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi

Özet

Escherichia coli, yenidoğan Gram-negatif bakteriyel menenjitin önde gelen nedenidir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında, nötrofiller tarafından üretilen reaktif oksijen türleri önemli bir bakterisidal rol oynar. Burada, menenjit E. coli'yeyanıt olarak nötrofillerdeki reaktif oksijen türlerini tespit etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Escherichia coli (E. coli) yenidoğan menenjite neden olan en yaygın Gram-negatif bakteridir. Kan-beyin bariyeri yoluyla bakteriyemi ve bakteriyel penetrasyon oluşumu E. coli menenjit gelişimi için vazgeçilmez adımlardır. Reaktif oksijen türleri (ROS), istila edilen patojenleri yok etmek için nötrofillerin başlıca bakterisidal mekanizmalarını temsil eder. Bu protokolde, meningitik E. coli ile enfekte olan nötrofillerde zamana bağımlı hücre içi ROS üretimi, gerçek zamanlı bir floresan mikro plaka okuyucusu tarafından tespit edilen floresan ROS probları kullanılarak ölçüldü. Bu yöntem, patojen konak etkileşimleri sırasında memeli hücrelerinde ROS üretiminin değerlendirilmesine de uygulanabilir.

Giriş

Yenidoğan bakteriyel menenjit yaygın bir pediatrik bulaşıcı hastalıktır. Bir K1 kapsülü ile Escherichia coli (E. coli), yenidoğan bakteriyel menenjite neden olan en yaygın Gram negatif patojendir ve toplam insidansin yaklaşık% 80'ini oluşturur^1,2,3. Antimikrobiyal kemoterapi ve destekleyici bakımdaki gelişmelere rağmen, bakteriyel menenjit hala yüksek morbidite ve mortalite ile en yıkıcı durumlardan biridir⁴.

Yenidoğan bakteriyel menenjitin oluşumu genellikle patojenik bakterilerin yenidoğanların lokal lezyonlarından periferik dolaşıma girmesinden kaynaklanan bakteriyemi ile başlar, ardından kan-beyin bariyerinden (BBB) beyne nüfuz ederek menenjlerin iltihaplanmasına neden olur⁴. Bakteriseminin başlangıcı, nötrofiller ve makrofajlar vb. Beyaz kan hücrelerinin ~ 50-70% 'ini oluşturan nötrofiller, bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattıdır^5,6. Bakterilerin istilası sırasında, aktif nötrofiller enfeksiyöz bölgelere alınır ve süperoksit anion, hidrojen peroksit, hidroksil radikalleri ve singlet oksijen⁷dahil olmak üzere reaktif oksijen türlerini (ROS) serbest bırakır. ROS hücre zarı, nükleik asit molekülleri ve bakteri proteinleri ile redoks reaksiyonlarına maruz kalan ve istilacı bakterilerin yaralanmasına ve ölümüne neden olan⁸. Mitokondri, ökaryotik hücrelerde ROS üretiminin ana alanıdır ve çeşitli oksidazlar (örneğin, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidaz kompleksi, lipoksijenaz sistemi, protein kinaz C ve siklooksijenaz sistemi) ROS^9,10üretimine aracılık eder. Nötrofillerdeki birincil antimikrobiyal mekanizmayı temsil eden ROS üretiminin gerçek zamanlı ölçümü, bakteri-konak etkileşimi sırasında konak savunmasını incelemek için yararlı bir yöntemdir.

Bu protokolde, meningitik E. coli ile enfekte olan nötrofillerde zamana bağlı ROS üretimi, gerçek zamanlı bir floresan mikro plaka okuyucusu tarafından tespit edilen floresan ros probu DHE ile ölçüldü. Bu yöntem, patojen-konak etkileşimi sırasında diğer memeli hücrelerinde ROS üretiminin değerlendirilmesine de uygulanabilir.

Protokol

Bu araştırmada uygulanan gönüllülerden alınan periferik kan, ilk Çin Tıp Üniversitesi Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (#2020-2020-237-2).

1. Reaktiflerin ve kültür ortamının hazırlanması

1. Kırmızı kan hücresi liziz tamponunu 8,29 g NH₄Cl, 1 g KHCO 3 ,_37,2mg Na₂EDTA'yı 1 L çift damıtılmış suya ekleyerek hazırlayın ve pH'ı 7,2-7,4'e ayarlayın. 0,22 μm filtreler kullanarak bakteriyi filtrasyonla çıkarın.
2. RPMI 1640 ortamına %5 fetal sığır serumu ekleyerek nötrofiller için deneysel kültür ortamı hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığına dengeyi kullanın.
   NOT: RPMI 1640 ortamını fenol kırmızısı olmadan kullanın.
3. 1 L cam şişeye 1 L çift damıtılmış suya 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO_{4·2H 2}O ve 0,2 g KH₂PO₄ ekleyerek fosfat tampon salin (PBS) hazırlayın. pH'ı 7.2-7.4 olarak ayarlayın. 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlav.
4. 50 mg/mL rifampicin çözeltisi elde etmek için 10 mL dimetil sülfit (DMSO) içinde 0,5 g rifampicin tozunu eriterek rifampicin çözeltisi hazırlayın.
5. 1 L çift damıtılmış suya 10 g NaCl, 10 g tryptone, 5 g maya özü ve 15 g agar tozu ekleyerek LB agar çözeltisi hazırlayın ve karışımı otoklavlayın. Petri tabaklarını 100 μg/mL rifampicin içeren sıcak LB agar çözeltisini dökerek hacmin yarısına doldurun. Soğutulmuş katı plakayı 4 °C'de saklayın.
6. 37 g BHI tozunu 1 L çift damıtılmış suya eriterek bakteriyel suşlara uygun beyin kalbi infüzyonu (BHI) suyu hazırlayın. pH'ı 7.2'ye ayarlayın ve otomatik olarak örtün.
7. 10 mM stok çözeltisi elde etmek için floresan prob dihidroethidium'un (DHE) DMSO çözücüsünü çözün. Kullanmadan önce hafifçe karıştırın.
   NOT: Stok çözeltisini hemen ışığa dayanıklı şişelere aliquot. Stok çözeltisinin raf ömrü -20 °C'de 6 aydır.

2. E44 bakteri suşunun hazırlanması

NOT: E44, rifampicin direncine sahip meningitik E. coli'nin mutant bir suşudur.

1. Kriyoprezer korunmuş E44 kolonisini steril bir pipet ucuyla batırın, 100 μg/mL rifampicin içeren LB agar plakasındaki E44 suşunu çizgiler çizerek aşılayın. Plakayı bir gecede 37 °C'de inkübatöre baş aşağı koyun.
2. Deneyden bir gün önce, steril pipet ucu ile plakadan bir E44 kolonisi seçin ve 50 mL'lik bir şişede 100 μg / mL rifampicin içeren 5 mL BHI suyuna koyun. Bakteri kültürünü 37 °C'de kuluçka çalkalayıcıda 17 saat boyunca 90 rpm ile kuluçkaya yatırın.

3. Nötrofillerin insan periferik kanından izolasyonu

1. Antikoagülasyon için EDTA içeren vakumlu kan alma tüpüne gönüllülerden intravenöz olarak 5 mL kan örneği çekin.
2. Periferik kan örneklerini 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj edin. Kan örnekleri, aşağıdan yukarıya kırmızı kan hücresi (RBC) tabakası, beyaz kan hücresi (WBC) tabakası ve plazma tabakası olan santrifüjleme ile üç katmana ayrılır.
3. Beyaz kan hücresi tabakasını pipetle 3x RBC lizis tamponlu yeni bir tüpe epire edin. Karışımı iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika yerleştirin.
4. Tüpü 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj edin. Süpernatantı tamamen aspire edin ve atın.
   1. Lizis prosedürünü RBC lizis tamponu ile 1-2 kez, çökeltme beyaza dönene kadar tekrarlayın.
5. Çökeltiyi 2 mL PBS ile yeniden oluşturarak hücreleri yıkayın. Daha sonra hücrelerin tüpün dibine yerleşmesine izin vermek için 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.
6. Tortuyu 50 μL önceden solumuş manyetik hücre sıralama tamponu ile yeniden yağlayarak nötrofilleri CD16 mikrobeadlarla etiketleyin. Daha sonra 50 μL insan CD16 mikropları ile iyice karıştırın. Karışımı 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Hücre yüzeyindeki antikorların kaplanmasını ve spesifik olmayan etiketlemeyi önlemek için çözeltiler önceden soğutulmalıdır. Çoğu yetişkinin mikroliter kan başına yaklaşık 4.000 ila 10.000 beyaz kan hücresi vardır ve bunların arasında nötrofiller yaklaşık% 50-70'ini oluşturur. Tahmine göre, 5 mL insan periferik kanında toplam beyaz kan hücrelerinin sayısı genellikle 2-5 x 10⁷'ye kadardır.
7. 10 dakika boyunca 4 °C, 300 x g'da 2 mL manyetik hücre sıralama tamponu ve santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın. Süpernatantı tamamen atın ve çökeltme kısmını 500 μL sıralama tamponu ile yeniden sunun.
8. Manyetik sütunu ve ayırma rafını birleştirin. Ayırıcıyı manyetik sütunla rafa taşıyın ve sütunu 3 mL sıralama arabelleği ile durulayın.
9. Manyetik boncuklar tarafından etiketlenen nötrofillerin manyetik sütuna bağlanmasına izin vermek için hücre süspansiyonunu sütuna bırakın.
10. Etiketlenmemiş hücreleri 3 mL manyetik hücre sıralama tamponu ekleyerek 3 kez yıkayın ve sütun rezervuarının her seferinde boş olduğundan emin olun.
11. Sütunu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve 15 mL'lik bir tüpe koyun. Sütuna 5 mL manyetik hücre sıralama arabelleği ekleyin. Manyetik etiketli hücreleri bir piston kullanarak dışarı itin.
    NOT: Nötrofillerin saflığını artırmak için sıralama adımları yeni bir sütun kullanılarak yinelenebilir.
12. Tüpü 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin, süpernatantı tamamen atın ve çökeltmeyi 1 mL kültür ortamı ile yeniden atın. Hücre sayacıyla hücre numarasını belirleyin ve hücreleri daha fazla deneme için hazırlayın.

4. ROS ölçümü

1. İzole nötrofilleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin, çökeltiyi yeniden sövün ve hücre konsantrasyonu 5 μM DHE floresan probu içeren kültür ortamı ile 2 x 10⁶/mL'ye ayarlayın.
2. DHE probunu yüklemek için nötrofilleri 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından hücre süspansiyonunu kuyu başına 200 μL ile 96 kuyulu siyah bir polistiren mikro plakaya tahsis edin.
3. Mikro plaka okuyucuyu açın ve algılama yazılımını açın. Opak 96 kuyu plaka biçimini seçin ve okuma alanını belirleyin.
   1. Floresan (Ex/Em = 518/605 nm) 37 °C'de 60 dakika boyunca her 5 dakikada bir kinetik modda ayarlayın. Her okumadan önce tabağı 3 s sallayın.
4. Mikro plakayı inkübatörden çıkar, 3 çoğaltmalı önceden yüklenmiş nötrofiller içeren her kuyuya kültürlü E44 (MOI=100) veya phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) (100 ng/mL) ekleyin. PMA'yı pozitif kontrol olarak kullanın.
5. Plakayı mikro plaka okuyucuya yerleştirin ve tahlilleri hemen başlatın.

Sonuçlar

Bu makalede özetlenen protokol kullanılarak, nötrofiller insan periferik kanından izole edildi ve E44 enfeksiyonuna yanıt olarak ROS seviyelerinin değişikliklerini tespit etmek için floresan probu DHE ile yüklendi. Burada, bir mikro plaka okuyucu tarafından gerçek zamanlı olarak belirlenen E44 suşu tarafından uyandırılan ROS üretimini gösteren temsili veriler sunuyoruz. 100 MOI'de E44 suşları eklenerek, ROS seviyeleri hemen arttı ve zamana bağlı bir şekilde sürekli bir yükseliş eğilimi göster...

Tartışmalar

Nötrofiller, insan kan dolaşımındaki beyaz kan hücrelerinin en bol bileşeni olarak işlev görür. Patojenlerin istilasına karşı ilk savunma hattını oluşturan doğuştan gelen insan bağışıklık sisteminde önemli efektör hücrelerdir¹¹. ROS'un üretimi, fagositoz^11'itakiben nötrofillerin önemli bakterisidal mekanizmalarından birini temsil eder. Son çalışmalar, nötrofil hücre dışı tuzak (NET) adı verilen bir nötrofil tarafından salınan net ben...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL polypropylene conical centrifuge tubes	KIRGEN	KG2611
96-well plate	Corning	3025
Agar	DINGGUO	DH010-1.1
Autuomated cell counter	Bio-rad	508BR03397
Biological Safety Carbinet	Shanghai Lishen	Hfsafe-1200Lcb2
Brain heart infusion	BD	237500
CD16 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-701
Centrifuge	Changsha Xiangyi	TDZ5-WS
Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Dihydroethidium (DHE)	MedChemExpress	104821-25-2
Fetal bovine serum	Cellmax	SA211.02
Incubator	Heraeus	Hera Cell
MACS separation buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Beyoitme	S1819-1mg
QuadroMACS separation Unit	Miltenyi Biotec	130-090-976
Rifampicin	Solarbio	13292-46-1
RPMI1640 medium	Sangon Biotech	E600027-0500
Thermostatic shaker	Shanghai Zhicheng	ZWY-100D
Trypton	OXOID	LP0042
Yeast extract	OXOID	LP0021