Quantification en temps réel des espèces réactives d’oxygène dans les neutrophiles infectés par escherichia coli méningitique

Résumé

Escherichia coli est la principale cause de méningite bactérienne gramnégative néonatale. Pendant l’infection bactérienne, les espèces réactives d’oxygène produites par les neutrophiles jouent un rôle bactérien majeur. Ici, nous introduisons une méthode pour détecter les espèces réactives d’oxygène dans les neutrophiles en réponse à la méningite E. coli.

Résumé

Escherichia coli (E. coli) est la bactérie gramnégative la plus commune causant la méningite néonatale. L’apparition de la bactériémie et la pénétration bactérienne par la barrière céphalo-encéphalique sont des étapes indispensables au développement de la méningite à E. coli. Les espèces réactives d’oxygène (ROS) représentent les principaux mécanismes bactéricides des neutrophiles pour détruire les pathogènes envahis. Dans ce protocole, la production intracellulaire de ROS dépendante du temps dans les neutrophiles infectés par E. coli méningitique a été quantifiée à l’aide de sondes ROS fluorescentes détectées par un lecteur de microplaque de fluorescence en temps réel. Cette méthode peut également être appliquée à l’évaluation de la production de ROS dans les cellules mammifères lors des interactions pathogènes-hôtes.

Introduction

La méningite bactérienne néonatale est une maladie infectieuse pédiatrique courante. Escherichia coli (E. coli) avec une capsule K1 est l’agent pathogène gramnégatif le plus commun causant la méningite bactérienne néonatale, représentant environ 80% de l’incidence totale^1,2,3. Malgré les progrès de la chimiothérapie antimicrobienne et des soins de soutien, la méningite bactérienne reste l’une des affections les plus dévastatrices avec une morbidité et une mortalité^{élevées 4}.

L’occurrence de la méningite bactérienne néonatale commence habituellement par la bactériémie provoquée par l’entrée des bactéries pathogènes dans la circulation périphérique des lésions locales des nouveau-nés, suivie de la pénétration par la barrière de sang-cerveau (BBB) dans le cerveau, ayant pour résultat l’inflammation des méninges^4. L’apparition de la bactériémie dépend de l’interaction entre les bactéries et les cellules immunitaires hôtes, y compris les neutrophiles et les macrophages, etc. Les neutrophiles, qui représentent ~50-70% des globules blancs, sont la première ligne de défense contre les infections bactériennes^5,6. Pendant l’invasion des bactéries, les neutrophiles activés sont recrutés dans les sites infectieux et libèrent des espèces réactives d’oxygène (ROS), y compris l’anion de superoxyde, le peroxyde d’hydrogène, les radicaux hydroxyles et l’oxygène singlet⁷. Le ROS subit des réactions de redox avec la membrane cellulaire, les molécules d’acide nucléique et les protéines des bactéries, ayant pour résultat la blessure et la mort des bactéries envahissantes^8. Les mitochondries sont le site principal de la production de ROS dans les cellules eucaryotes, et divers oxidases (par exemple, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase complexe, système de lipoxygénase, protéine kinase C et système de cyclooxygénase) médiation la production de ROS^9,10. La mesure en temps réel de la production de ROS, représentant le mécanisme antimicrobien primaire dans les neutrophiles, est une méthode utile pour étudier la défense de l’hôte pendant l’interaction bactéries-hôte.

Dans ce protocole, la production de ROS dépendante du temps dans les neutrophiles infectés par E. coli méningitique a été quantifiée par une sonde ROS fluorescente DHE, détectée par un lecteur de microplaque de fluorescence en temps réel. Cette méthode peut également être appliquée à l’évaluation de la production de ROS dans d’autres cellules mammifères au cours de l’interaction pathogène-hôte.

Protocole

Le sang périphérique des volontaires appliqués dans cette recherche a été approuvé par le Conseil d’examen institutionnel de la première université médicale de l’Hôpital de Chine (#2020-2020-237-2).

1. Préparation des reagents et du milieu culturel

1. Préparer le tampon de lyse des globules rouges en ajoutant 8,29 g de NH₄Cl, 1 g de KHCO₃, 37,2 mg de Na₂EDTA en 1 L d’eau distillée double et ajuster le pH à 7,2-7,4. Éliminez les bactéries par filtration à l’aide de filtres de 0,22 μm.
2. Préparer un milieu de culture expérimentale pour les neutrophiles en ajoutant 5 % de sérum bovin fœtal au milieu du RPMI 1640 et le conserver à 4 °C. Equilibrer à température ambiante avant utilisation.
   REMARQUE : Utilisez le milieu RPMI 1640 sans rouge phénol.
3. Préparer le salin tampon phosphate (PBS) en ajoutant 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄·2H₂O et 0,2 g de KH₂PO₄ en 1 L d’eau distillée double dans un flacon de verre de 1 L. Réglez le pH à 7,2-7,4. Autoclave-le pendant 15 min à 121 °C.
4. Préparer la solution de rifampicine en dissolvant 0,5 g de poudre de rifampicine dans 10 mL de sulfure de diméthyle (DMSO) pour produire une solution de rifampicine de 50 mg/mL.
5. Préparer la solution d’agar LB en ajoutant 10 g de NaCl, 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure et 15 g de poudre d’agar dans 1 L d’eau distillée double et autoclave le mélange. Remplissez les boîtes de Pétri à la moitié du volume en versant la solution chaude d’agar de LB contenant 100 μg/mL de rifampicine. Conserver la plaque solide refroidie à 4 °C.
6. Préparer l’infusion cardiaque du cerveau (BHI) bouillon approprié pour les souches bactériennes en dissolvant 37 g de poudre BHI dans 1 L d’eau distillée double. Réglez le pH à 7,2 et autoclavez-le.
7. Dissoudre la sonde fluorescente dihydroethidium (DHE) dans le solvant DMSO pour produire une solution de stock de 10 mM. Mélanger délicatement avant utilisation.
   REMARQUE : Aliquot la solution de stock immédiatement dans des flacons à l’épreuve de la lumière. La durée de conservation de la solution de stock est de 6 mois à -20 °C.

2. Préparation de la souche de bactéries E44

REMARQUE : E44 est une souche mutante d’E. coli méningitique résistante à la rifampicine.

1. Tremper la colonie cryopréservée E44 avec une pointe stérile de pipette, inoculer la souche E44 sur la plaque d’agar LB contenant 100 μg/mL de rifampicine en dessinant des lignes. Mettez la plaque à l’envers dans l’incubateur à 37 °C pendant la nuit.
2. Un jour avant l’expérience, choisissez une colonie E44 dans la plaque avec une pointe stérile de pipette et mettez-la dans 5 mL de bouillon BHI contenant 100 μg/mL de rifampicine dans un flacon de 50 mL. Incuber la culture bactérienne à 37 °C avec 90 rpm pendant 17 h dans un shaker d’incubation.

3. Isolement des neutrophiles du sang périphérique humain

1. Tirez 5 mL d’échantillon de sang des volontaires par voie intraveineuse au tube de collecte de sang sous vide contenant EDTA pour l’anticoagulation.
2. Centrifugeuse les échantillons de sang périphériques à 500 x g pendant 5 min. Les échantillons de sang sont divisés en trois couches par centrifugation, qui de bas en haut sont la couche de globules rouges (RBC), la couche de globules blancs (WBC) et la couche plasmatique, séquentiellement.
3. Aspirez la couche de globules blancs avec un pipet à un nouveau tube avec tampon de lyse RBC 3x. Bien mélanger le mélange et le placer à température ambiante pendant 5 min.
4. Centrifuger le tube à 500 x g pendant 5 min. Aspirer complètement le surnatant et jeter.
   1. Répétez la procédure de lyse avec le tampon de lyse RBC 1-2 fois, jusqu’à ce que le précipité devient blanc.
5. Lavez les cellules en réutilisant le précipité avec 2 mL de PBS. Puis centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min pour laisser les cellules s’installer au fond du tube.
6. Étiquetez les neutrophiles avec des microbilles CD16 en réutilisant les sédiments avec 50 μL de tampon de tri des cellules magnétiques précoolées. Ensuite, mélanger avec 50 μL de microbilles humaines CD16 à fond. Incuber le mélange à 4 °C pendant 30 min.
   REMARQUE : Les solutions doivent être pré-refroidies pour éviter le plafonnement des anticorps à la surface des cellules et l’étiquetage non spécifique. La plupart des adultes ont environ 4.000 à 10.000 globules blancs par microlitre de sang, parmi lesquels, les neutrophiles représentent environ 50-70%. Selon les estimations, les comptes de globules blancs totaux dans 5 mL de sang périphérique humain sont généralement jusqu’à 2-5 x 10⁷.
7. Lavez les cellules en ajoutant 2 mL de tampon de tri des cellules magnétiques et centrifugeuse à 4 °C, 300 x g pendant 10 min. Jetez complètement le supernatant et resuspendez le précipité avec 500 μL de tampon de tri.
8. Assembler la colonne magnétique et séparer l’étagère. Déplacez le séparateur sur l’étagère avec la colonne magnétique et rincez la colonne avec 3 mL de tampon de tri.
9. Déposez la suspension cellulaire dans la colonne pour permettre aux neutrophiles étiquetés par les perles magnétiques de s’attacher à la colonne magnétique.
10. Lavez les cellules non étiquetées en ajoutant 3 mL de tampon de tri des cellules magnétiques 3 fois, en vous assurant que le réservoir de colonne est vide à chaque fois.
11. Retirez la colonne du séparateur magnétique et placez-la sur un tube de 15 mL. Ajouter 5 mL de tampon de tri des cellules magnétiques à la colonne. Poussez les cellules magnétiques étiquetées à l’aide d’un piston.
    REMARQUE : Pour améliorer la pureté des neutrophiles, les étapes de tri peuvent être répétées à l’aide d’une nouvelle colonne.
12. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min, jeter complètement le supernatant et resuspendre le précipité avec 1 mL de culture moyenne. Déterminez le numéro de cellule avec un compteur cellulaire et préparez les cellules pour d’autres expériences.

4. Mesure du ROS

1. Centrifugeuse les neutrophiles isolés à 300 x g pendant 5 min, resuspendent le précipité, et ajustent la concentration cellulaire à 2 x 10^6/mLavec le milieu de culture contenant la sonde de fluorescence de 5 μM DHE.
2. Incuber les neutrophiles à 37 °C pendant 30 min pour charger la sonde DHE, puis allouer la suspension cellulaire à une microplaque de polystyrène noir de 96 puits avec 200 μL par puits.
3. Allumez le lecteur de microplaque et ouvrez le logiciel de détection. Choisissez un format opaque de plaques de 96 puits et déterminez la zone de lecture.
   1. Réglez la fluorescence (Ex/Em = 518/605 nm) en mode cinétique toutes les 5 minutes pendant 60 min à 37 °C. Assurez-vous de secouer la plaque pendant 3 s avant chaque lecture.
4. Sortez la microplaque de l’incubateur, ajoutez l’E44 cultivé (MOI=100) ou le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) (100 ng/mL) à chaque puits contenant des neutrophiles préchargés avec 3 répliques. Utilisez la PMA comme un contrôle positif.
5. Placez la plaque dans le lecteur de microplaque et commencez l’analyse immédiatement.

Résultats

Utilisant le protocole décrit dans cet article, les neutrophiles ont été isolés du sang périphérique humain et chargés avec la sonde de fluorescence DHE pour détecter les changements des niveaux de ROS en réponse à l’infection d’E44. Ici, nous fournissons des données représentatives démontrant la production ros évoquée par la souche E44 déterminée par un lecteur de microplaques en temps réel. En ajoutant des souches E44 à un MOI de 100, les niveaux de ROS ont augmenté immédiatement et ont montré...

Discussion

Les neutrophiles agissent comme la composante la plus abondante des globules blancs dans la circulation sanguine humaine. Ce sont des cellules effectrices importantes dans le système immunitaire humain inné, qui construit la première ligne de défense contre l’invasion des pathogènes¹¹. La génération de ROS représente l’un des principaux mécanismes bactéricides des neutrophiles suivant la phagocytose¹¹. Des études récentes ont montré qu’une structure en fo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL polypropylene conical centrifuge tubes	KIRGEN	KG2611
96-well plate	Corning	3025
Agar	DINGGUO	DH010-1.1
Autuomated cell counter	Bio-rad	508BR03397
Biological Safety Carbinet	Shanghai Lishen	Hfsafe-1200Lcb2
Brain heart infusion	BD	237500
CD16 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-701
Centrifuge	Changsha Xiangyi	TDZ5-WS
Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Dihydroethidium (DHE)	MedChemExpress	104821-25-2
Fetal bovine serum	Cellmax	SA211.02
Incubator	Heraeus	Hera Cell
MACS separation buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Beyoitme	S1819-1mg
QuadroMACS separation Unit	Miltenyi Biotec	130-090-976
Rifampicin	Solarbio	13292-46-1
RPMI1640 medium	Sangon Biotech	E600027-0500
Thermostatic shaker	Shanghai Zhicheng	ZWY-100D
Trypton	OXOID	LP0042
Yeast extract	OXOID	LP0021