Hücre İzleme Kullanılarak Oral Aparat Rejenerasyonu Sırasında ve Sonrasında Stentor Motilite Paternlerinin Analizi

Özet

Parlak alan mikroskobu ve hücre takibi kullanılarak yüz mikron ila milimetre büyüklüğünde hücrelerden oluşan bir popülasyonun hareketliliğinin ve davranışının karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, Stentor coeruleus'un kayıp bir oral aparatı yenilerken davranışsal olarak farklı dört aşamadan geçtiğini ortaya koymaktadır.

Özet

Stentor coeruleus , tek hücreli rejenerasyon çalışmaları için iyi bilinen bir model organizmadır. Bireysel hücrelerin transkriptomik analizi, çoğu oral aparat (OA) ile ilişkili olmayan yüzlerce geni ortaya çıkardı - rejenerasyon süreci boyunca fazlar halinde farklı şekilde düzenlenmiştir. Hücresel kaynakların bu sistemik yeniden düzenlenmesi ve yeni bir OA'nın büyümesine doğru mobilizasyonunun, zaman içinde diferansiyel gen ekspresyonunun fazlarına karşılık gelen hareket ve davranışta gözlemlenebilir değişikliklere yol açacağı varsayılmıştır. Bununla birlikte, S. coeruleus'un morfolojik karmaşıklığı, istatistikleri ve zaman ölçeğini yakalamak için bir tahlilin geliştirilmesini gerektirmiştir. Kısa videolardaki hücreleri izlemek için özel bir komut dosyası kullanıldı ve istatistikler büyük bir popülasyon (N ~ 100) üzerinden derlendi. OA'nın kaybedilmesi üzerine, S. coeruleus başlangıçta yönlendirilmiş hareket yeteneğini kaybeder; daha sonra ~ 4 saatten başlayarak, ~ 8 saate kadar hızda önemli bir düşüş gösterir. Bu tahlil, motiliteli fenotiplerin taranması için yararlı bir araç sağlar ve diğer organizmaların araştırılması için uyarlanabilir.

Giriş

Stentor coeruleus (Stentor), büyük boyutu, çeşitli mikrocerrahi tekniklere dayanma kabiliyeti ve laboratuvar ortamında kültürleme kolaylığı nedeniyle tek hücreli rejenerasyonu incelemek için kullanılan iyi bilinen bir model organizmadır ^1,2,3. Erken rejenerasyon çalışmaları, Stentor'daki en büyük ve morfolojik olarak en belirgin özelliğe odaklanmıştır - OA - tamamen kimyasal şok ^4,5,6 üzerine dökülür. Kayıp bir OA'nın de novo replasmanı, sekiz morfolojik aşamada fonksiyonel bir OA oluşturmadan önce yavaş yavaş hücrenin ön tarafına doğru kayan yeni bir membranllar bandın ortaya çıkmasıyla başlar³. Bu aşamalar, sıcaklıktan bağımsız olarak sırayla gözlemlenmiştir ve neredeyse tüm çalışmalar için evrensel bir referans noktası sağlamaktadır⁵.

Stentor rejenerasyonunun mekanik analizi, rejenerasyonun zamanlamasını ölçmek için kimyasal veya moleküler bir ekranın parçası olarak birden fazla numuneye uygulanabilecek kadar sağlam ve basit araçlar gerektirir. Hücre bazlı bir tahlil yapmak için standart yöntem, bu durumda, rejenerasyon sırasında yeni OA oluşumunu görüntülemektir. Bununla birlikte, bu tür görüntüleme tabanlı analizler, yenileyici yapı belirteçler olarak kullanılabilecek farklı moleküler bileşenler içerdiğinde en etkilidir, böylece bir floresan görüntüsünde kolayca tespit edilebilirler. Stentor OA durumunda, bilinen bileşenler (kirpikler, bazal cisimler) hücre yüzeyinin geri kalanında da bulunur; bu nedenle, AE'nin restorasyonunu tanımak, sadece bir bileşenin varlığını veya yokluğunu arayarak elde edilemez.

Daha ziyade, bir OA'yı tespit etmek için bir çeşit şekil tanıma gerekli olacaktır ve Stentor hücrelerinin sıklıkla hızlı bir kasılma süreci yoluyla şekil değiştirdiği gerçeği göz önüne alındığında, bu potansiyel olarak çok zordur. Bu yazıda, vücudun hareketli aktivitesine ve OA kirpiklerine dayanan rejenerasyon için alternatif bir test sunulmaktadır. OA yenilendikçe, yeni oluşan kirpikler pozisyon ve aktivitede tekrarlanabilir değişikliklere uğrar ve bu da hücrenin yüzme hareketliliğini etkiler. Hareketliliği analiz ederek, yenilenen yapıların işlevini nicelleştirerek rejenerasyonu ölçen "fonksiyonel rejenerasyon" için bir test yapmak mümkündür. Rejenerasyon sırasında Stentor siliyer fonksiyonunun önceki analizi, rejenerasyonun farklı aşamalarında akış modelindeki değişiklikleri gözlemlemek için dış ortama eklenen izleyici boncuklarla birlikte partikül görüntü velosimetrisi kullandı⁷; Bununla birlikte, bu yaklaşım, tek tek hücrelerin ve bunlarla ilişkili akış alanlarının birer birer zahmetli bir şekilde görüntülenmesini gerektirir.

Hücrenin kendisinin hareketini kirpik kaynaklı akış için bir proxy olarak kullanarak, yüksek verimli tarama platformlarıyla uyumlu düşük çözünürlüklü görüntüleme sistemlerini kullanarak daha fazla sayıda hücreyi paralel olarak analiz etmek mümkün olacaktır. Bu tahlil, prensip olarak, yüzlerce mikron ila milimetre boyut ölçeğinde diğer yüzme organizmalarında gelişim ve fonksiyonel rejenerasyonu incelemek için kullanılabilir. Protokolün 1. Bölümü, bir hücre popülasyonunun tüm güne kadar yüksek verimli görüntülenmesini sağlayan çok kuyulu bir örnek slaytının yapımını açıklamaktadır. Diğer hücre türleriyle kullanım için nasıl ayarlanacağına ilişkin ayrıntılar sağlanmıştır. Protokolün 2. Bölümü, dijital tek lensli refleks kamera ile diseksiyon mikroskobunda gerçekleştirilebilen bu test için video verilerinin elde edilmesini kapsamaktadır. Protokolün 3. Bölümü, MATLAB kodunu (Ek Bilgiler) kullanarak hücre izleme ve hücre hızı hesaplaması hakkında bir kılavuz sağlar. Protokolün 4. Bölümü, sonuçların kolay yorumlanması için sayısal sonuçların Şekil 1C-F ve Şekil 2C'de gösterildiği gibi grafiklere nasıl dönüştürüleceğini açıklamaktadır.

Protokol

NOT: Yaklaşık yüz S. coeruleus hücresinden oluşan bir popülasyon, daha önce yayınlanmış bir JoVE protokolü^8'e uygun olarak kültürlenmiştir.

1. Numune hazırlama

1. 250 μm kalınlığında silikon ara parça levha (Malzeme Tablosu) parçasını mikroskop slaytından hem yükseklik hem de genişlik açısından biraz daha küçük kesin. 5/16" delik delme kullanarak dairesel kuyucuklar oluşturun. İyi bir sızdırmazlık sağlamak için komşu kuyular arasında yeterli boşluk bırakmaya dikkat edin.
   NOT: Komşu kuyular arasında 3 mm'lik bir boşluk yeterli bulunmuştur. Uygulamayla, tek bir örnek slayta on kuyucuk yerleştirilebilir.
2. Hücreleri 2 dakika boyunca% 10 sakkaroz veya% 2 üre içinde inkübe ederek OA'nın rejenerasyonunu başlatın (Şekil 1A). Ardından, taze ortam⁸ ile üç kez yıkayın. Her bir oyuğa yaklaşık on Stentor'u nazikçe pipetleyin. Numune hacmini kuyu hacmiyle mümkün olduğunca yakından eşleştirmeye dikkat edin.
   NOT: Burada kullanılan kuyu boyutları için, her bir kuyucuğa 12,5 μL numune pipetlenmiştir.
3. Bir kenardan başlayarak kuyucukların üzerine bir parça kapak camını (bkz. Malzeme Tablosu) yavaşça indirerek kuyuları kapatın. 10 μL pipet ucu gibi dar ve hafif esnek bir nesne kullanarak silikon tabakaya temas ettiği kapak camına bastırarak iyi bir sızdırmazlık sağlayın.

2. Görünür ışık mikroskobu hızlandırılmış

1. Numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin ve büyütmeyi mevcut en düşük seviyeye ayarlayın, böylece bir tanesi çerçeveye tamamen sığar.
   NOT: Bu protokol için mikroskopta 1.6x kamera adaptörü ve objektif üzerinde 1x büyütme kullanılmıştır.
2. Hızlandırılmış olarak başlayın. Her zaman noktasında her kuyucuğun saniyede 30 karesinde 10 saniyelik bir video elde edin. Motorlu bir X-Y aşamasına sahip bir mikroskop kurulumu kullanıyorsanız, tüm hızlandırılmış çekimi otomatikleştirin. Aksi takdirde, her bir kuyu boşluğunu kaydetmek üzere örneği el ile çevirmek için her zaman noktasında bir kullanıcının bulunduğundan emin olun.
   NOT: Isınmayı ve buharlaşmayı önlemek için görüntüleme yapmadığınız zamanlarda numuneyi ışıklı bırakmaktan kaçının. Numune hacimleri küçüktür ve buharlaşma hava kabarcıklarına yol açacaktır.
3. Filmleri TIFF, MOV veya AVI olarak kaydedin.
   NOT: Bunlar, tescilli olmayan en yaygın video dosyası türleridir. Belirli mikroskop yazılımına bağlı olarak, videolar varsayılan olarak özel bir dosya türüne kaydedilebilir, ancak daha sonra yukarıda belirtilen dosya türlerinden birine aktarılabilir.
4. Fiziksel ölçek için pikselden milimetreye dönüştürme faktörü kullanın ve bir kalibrasyon gerçekleştirin veya kullanılan kameradan bilinen piksel boyutunu kullanın. Kalibre etmek için, videolarla aynı büyütme ayarlarında kalibrasyon slaytının veya net bir cetvelin net bir görüntüsünü elde edin. Herhangi bir görüntü görüntüleme programını kullanarak, bilinen bir fiziksel mesafenin işaretleri arasındaki piksel sayısını sayın.
   NOT: Örneğin, bir cetvelin görüntüsünde 100 piksel ile ayrılacak 1 mm işareti ve 2 mm işareti gösteriliyorsa, dönüşüm faktörü 100 piksel başına 1 mm'dir. Alternatif olarak, bu faktörü kamera piksel boyutundan türetmek için, kamera piksel boyutunu büyütme ile çarpmanız yeterlidir. Örneğin, kullanılan fotoğraf makinesinde 3,45 μm piksel varsa ve kullanılan büyütme 1,6x ise, dönüşüm 1 piksel başına 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm'dir.

3. Hücre izleme

1. İki komut dosyasını, TrackCells.m ve CleanTraces.m'yi, bilgisayarda hatırlanması kolay bir konuma indirin. Veri videoları zaten bu bilgisayarda değilse, bunları bu bilgisayara aktarın.
   NOT: Veri videolarının ve komut dosyalarının aynı klasörde olması gerekmez.
2. Veri videolarını, her zaman noktası için bir tane olmak üzere klasörler halinde düzenleyin. Veri videolarında otomatik hücre izleme gerçekleştirmek için önce TrackCells.m komut dosyasını kullanın. TrackCells.m dosyasını açın ve komut dosyasını çalıştırın.
3. Bir açılır pencere tarafından istenirse Yola Ekle'yi seçin., bu genellikle yalnızca komut dosyası belirli bir klasörden ilk kez çalıştırıldığında gerçekleşir. İstendiğinde, İzlemeyi Başlatmak için Bir veya Daha Fazla Veri Videosu Seçin, veri videolarına gidin (bölüm 2). Shift tuşunu basılı tutarak tıklatın, Control tuşunu basılı tutarak veya vurgulamak için dosyaların üzerine gelirken farenin sol düğmesini basılı tutarak birden fazla video dosyası seçin.
4. İstem penceresinin altındaki Dosya adı: kutusundaki dosya listesinden memnun kaldığınızda, Aç'a tıklayın. Tüm parametrelerin doğru ayarlandığını onaylamak için önce bir videoda test çalışması yapın (aşağıdaki tartışmaya bakın).
   NOT: Bu komut dosyası artık seçilen her video dosyası için bir klasör oluşturacaktır. Daha sonra videonun her karesini bir .jpg dosyası ve videoda bulunan tüm izleri içeren position_estimates.mat adlı bir dosya olarak bu klasöre yazar. Videoların boyutuna, video sayısına ve bilgisayarın hızına bağlı olarak, bu komut dosyasının çalışması saatler sürebilir.

4. İzleme doğrulaması

1. Devam etmeden önce hata iletisi olup olmadığını denetleyerek bölüm 3'te açıklanan adımların doğru şekilde izlendiğini doğrulayın. Anormal veya yanlış izlemeleri el ile reddetmek için CleanTraces.m komut dosyasını kullanın. CleanTraces.m dosyasını MATLAB düzenleyicisi penceresinde dosyaya çift tıklayarak açın.
2. İstemde TrackCells.m tarafından veri klasörü çıktısını seçin. Video dosyasıyla aynı ada sahip olacak, bölüm 3'te açıklandığı gibi oluşturulan klasörlerden birine gidin. Yalnızca bir klasör seçin.
   NOT: Bu komut dosyası artık izlemeleri bir açılır pencerede tek tek görüntüleyecektir. İzin başladığı video karesine yeşil renkte ve videonun izinin bittiği kareye eflatun olarak yerleştirilirler. Bu nedenle, geçerli bir iz yeşil bir hücreyi ve bir macenta hücresini birbirine bağlamalıdır.
3. İstendiğinde, izlemeyi korumak için 1 ve izlemeyi reddetmek için 0 girin. Sonraki izlemeye geçmek için Enter tuşuna basın.
   NOT: Yeni izlemeler, daha fazla iz kalmayana veya ilk altmış tanesi gösterilene kadar görüntülenmeye devam eder. Bu işlem tamamlandığında, komut dosyası çıktıları kaydetmek için otomatik olarak CLEAN TRACES adlı bir klasör oluşturur ve kalan tüm izlemeleri videonun ilk karesinin üstünde görüntüler (Şekil 1B). Bu görüntü, ileride başvurmak üzere otomatik olarak LabeledTraces.png olarak kaydedilir. Kullanıcının tutmayı seçtiği tüm izler clean_traces.mat dosyasına kaydedilir.
4. Devam etmeden önce tüm videolar için bu adımı tek bir zaman noktasında tamamlayın.
   NOT: Bu makaledeki veriler için, her zaman noktasında her kuyu için bir video, zaman noktası başına toplam on video elde edilmiştir.

5. Veri görselleştirme

NOT: Tüm hücre popülasyonunun farklı zaman noktalarındaki hareketliliğini görsel olarak karşılaştırmak için, bölüm 4'teki tüm izler orijinde başlayacak ve her zaman noktası için bir radyal yer değiştirmeye karşı zaman grafiği oluşturacak şekilde çevrilmiştir (Şekil 1C-F, tüm zaman noktaları için Ek Şekil S1'e bakınız).

1. SpaghettiPlots.m adlı komut dosyasını indirerek başlayın. Komut dosyasını açın ve çalıştırın. Grafiğin kuyu verilerini (clean_traces.mat) içeren zaman klasörünü seçin istemiyle bir pencere dosyası tarayıcı penceresi açıldığında, zaman noktalarından birinin klasörüne gidin. Bu klasörün içinde analiz edilen videoların her biri için bir klasör içermesi gerektiğini unutmayın.
2. Kalibrasyon: Milimetre başına piksel sayısı nedir?" sorusu sorulduğunda, adım 2.4'te bulunan kalibrasyon değerini yazın ve Enter tuşuna basın.
   NOT: Komut dosyası artık şu anda analiz edilen tüm videolardaki izleri tek bir grafikte birleştirecektir (Şekil 1C-F). Grafikteki soluk noktalı daireler, 1, 2, 3 ve 4 mm'lik radyal yer değiştirmeleri gösterir.
3. Varsayılan olarak, 4 mm'ye kadar bir yarıçap eklemek için rr = 4 olarak ayarlanan komut dosyasının 55. satırını değiştirerek grafiğin eksenlerini gerektiği gibi ayarlayın. Grafiği kaydedin.

Sonuçlar

Bu tahlilin amacı, hareket kalıplarının kademeli değişimini ve büyük (N ~ 100) rejenere Stentor popülasyonundaki hücrelerden hareket hızındaki aşamalı artışı ölçmektir. Sonuçların yorumlanmasına yardımcı olmak için, bu protokolde yer alan özel kod iki tür çizim oluşturur: bir dizi video verisindeki tüm hücre hareketi izlerinin bir bindirmesi (Şekil 1C-F ve Şekil S1) ve rejenerasyonun başlamasından bu yana saate göre yüzme hı...

Tartışmalar

Birçok parçacık ve hücre izleme algoritması şu anda mevcuttur, bazıları tamamen ücretsizdir. Maliyet ve kullanım kolaylığı genellikle ödün vermeyi gerektiren ödünleşimlerdir. Ek olarak, mevcut hücre izleme programlarının çoğu, yüzerken dönen ve ani yön değişikliklerine uğrayabilen Stentor'un hızlı yüzme hareketi yerine, doku kültürü hücrelerinin yavaş sürünen hareketini izlemek için tasarlanmıştır. Bu seçeneklerin çoğunu test ettikten sonra, burada sunulan protokolü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m