Drosophila'da Tüketimin Nicelleştirilmesi için Yüksek Verimli Mikro Plaka Besleyici Tahlili

Özet

Mikro plaka besleyici tahlili, Drosophila'dakisıvı gıda tüketimini ölçmek için ekonomik, yüksek verim yöntemi sunar. 3D baskılı bir cihaz, sineklerin barındırıldığı 96 kuyulu bir mikro plakayı, sineklerin bir izleyici boyası ile bir besleme çözeltisi tükettiği 1536 kuyulu bir mikro plakaya bağlar. Çözelti hacmi düşüşü spektrofotometrik olarak ölçülür.

Özet

Drosophila'da gıda alımını ölçmek, tüketimle ilişkili özelliklerin genetik ve fizyolojik temellerini, çevresel faktörlerini ve çok sayıda maddenin toksikolojik ve farmakolojik etkilerini incelemek için kullanılır. Şu anda uygulanan birkaç yöntem yüksek aktarım hızı ölçümüne uygundur. Microplate Besleyici Test (MFA), absorbans kullanarak bireysel sinekler için sıvı gıda tüketimini ölçmek için geliştirilmiştir. Bu testte, sinekler 1536 kuyulu bir mikro plakanın belirli kuyularından sıvı gıda ortamı tüketir. Seyreltilmiş bir izleyici boyasını sıvı gıda ortamına dahil ederek ve bilinen bir hacmi her kuyuya yükleyerek, tüketimden önce ve sonra elde edilen kuyunun absorbans ölçümleri, elde edilen hacimdeki değişimi (yani tüketilen hacmi) yansıtır. Bu yöntemle yüksek verim analizini etkinleştirmek için, sineklerin 96 kuyulu mikro plakalara ayrı ayrı sıralanmasını sağlayan 3D baskılı bir bağlayıcı tasarlanmıştır. Bu cihaz, her bir uçucuya tüketim için 4 kuyuya erişim sağlamak için 96 ve 1536 kuyulu mikro plakaları hassas bir şekilde yönlendiriyor, böylece düzenli tüketime ek olarak gıda tercihi nicelleştirmesini sağlıyor. Ayrıca, cihaz, bir kerede bir numune sütununun kontrollü bir şekilde çevrelenmesine ve serbest bırakılmasına izin vermek için açık ve kapalı konumlar arasında geçiş yapan bariyer şeritlerine sahiptir. Bu yöntem, aynı anda birçok sinek tarafından sulu çözeltilerin tüketiminin yüksek verim ölçümlerini sağlar. Ayrıca diğer böceklere adapte olma ve besin, toksin veya ilaç tüketimini tarama potansiyeline sahiptir.

Giriş

Drosophila melanogaster, gıda alımının biyolojik temellerini ve tüketimle ilişkili özellikleri incelemek için genetik model organizma olarak geniş bir kullanım görmüştür¹. İnsan hastalığına neden olan genlerin% 65'inin sineklerde fonksiyonel homologlara sahip olduğu ve bunların önemli bir kısmının sinekler ve insanlar arasındaki işlevsel olarak eşdeğer dokularda ifade edildiği tahmin edilmektedir². Ayrıca, D. melanogaster'ın büyüklüğü, kısa kuşaklararası süresi, basit bakımı ve genetik çekiş kabiliyeti, insektisitler5 , kirleticiler⁶, farmasötik⁷ve kötüye kullanım ilaçları^8,9,¹⁰dahil olmak üzere çeşitli maddelerin^3,4 ve toksikolojik ve farmakolojik etkileri üzerine yapılan çalışmalar için çekici bir model haline getirmektedir.

Çoğu durumda, bu özelliklerin incelenmesi tüketimin kesin nicelleştirilmesini gerektirir. Tüketimi ölçme yöntemleri çeşitlidir ve CApillary FEeder (CAFE) tahlil¹¹, MAnual FEeding (MAFE) tahlil¹², Hortum Uzatma Yanıtı (PER)¹³, izleyici boyası ekstraksiyonu^14,15, oligonükleotid izleyici ekstraksiyonu¹⁶ve radyo-izotop ekstraksiyonu^5,17içerir. Son çalışmalar, Expresso test¹⁸ veya plaka tabanlı Tüm Hayvan Besleme FLat (WAFFL) sistemi^19'daolduğu gibi, bu tahlillerin verimini artırmaya odaklanmıştır. Yardımcı programlarına rağmen, bu tahliller karmaşık, maliyetli veya emek yoğun olabilir ve yüksek verim çalışmalarında kullanımlarını engelleyebilir.

Şekil 1: Mikro Plaka Besleyici Tahlili bileşenleri. (A) Monte edilen mikro plaka besleyici testinin 3D oluşturulması. 1536 kuyulu mikro plaka, 3D baskılı bağlayıcı tarafından yönlendirilir, böyle şekilde alt 96 kuyulu mikro plakanın her kuyusu üst 1536 kuyu mikro plakanın dört kuyusuna erişebilir. Kuyulara erişim, bağlayıcıdan oluklu bariyer şeritlerinin konumunu ayarlayarak kontrol edilebilir. (B) Mikro plaka besleyici testinin her kuyusunun grafiksel bir gösterimi. Tüketim çözümleri, sinek tarafından erişime izin vermek için delikli bir sızdırmazlık filmi kullanılarak her kuyuda tutulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mikro Plaka Besleyici Tahlili'ndeki prosedürlere genel bakış. Şekil, protokolün 4.1-5.8 adımlarına karşılık gelen bir akış diyagramı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu engelleri aşmak için Mikro Plaka Besleyici Tahlil (MFA; Şekil 1) geliştirildi. Bu testte, sinekler 96 kuyulu mikro plakalarda ayrı ayrı barındırılıyor. Her mikro plaka, 3D baskılı özel bir cihaz kullanılarak 1536 kuyulu bir mikro plaka ile birleştirilmiştir. Cihaz, iki plakayı tam olarak yönlendiriyor, böylece her biri 96 kuyu plakasının kendi kuyusunda uçuyor ve 1536 kuyulu mikro plakanın 4 kuyusuna erişiyor. Dipsiz 1536 kuyu plakası ve sızdırmazlık filmleri kullanılarak, çözeltiler belirli kuyulara dağıtılır ve sineklere erişim sağlamak için hassas 0,25 mm çapında iğnelerle delinir. Kritik olarak, doğrudan bir mikro plakadan tüketime izin vermek, mikro plaka okuyucu kullanarak anında absorbans tabanlı ölçümlere izin verir. Seyreltilmiş bir izleyici boyası tüketim ortamına dahil edilir ve maruziyet sonrası emiciliğin değişmesi tüketilen hacmi belirlemek için kullanılır (Şekil 2 ve Şekil 3). Her kuyudaki sıvı bir sıvı sütununa yaklaşık olarak sahip olduğundan, hacimsel farklılıklar sütunun yüksekliğinde farklılıklar olarak kendini gösterecektir. (Şekil 3A) Bira-Lambert yasasına göre²⁰:

burada A emiciliktir, ε zayıflatıcı analiz için azı diş emme katsayısıdır, l optik yol uzunluğudur ve c zayıflatıcı analitin konsantrasyonudur. Bu nedenle, sürekli azı diş emme katsayısı ve konsantrasyonu ile, emicilikteki değişiklikler sadece optik ışık yolundaki değişikliklerden, yani belirli bir kuyudaki sıvı seviyesinden kaynaklanmaktadır. Maruz kalmadan önce ve sonra absorbansı ölçerek, emiciliğin oransal değişimi hacimdeki orantılı değişimi yansıtır (Şekil 3B).

Şekil 3: Kuyu hacminin absorbans tabanlı nicelemesi. (A) Bilinen giriş yoğunluğunda olay ışığı (I₀) her kuyudan geçer. Farklı dolgu hacimlerinde ışığın zayıflaması, hacim ve emiciliğin doğrusal bir ilişkisini sergileyen farklı çıkış yoğunlukları (I) verir. (B) Emicilik ve hacim için ampirik ölçüm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hacimdeki değişime bağlı olarak, yutmuş herhangi bir bileşiğin miktarı, besleme çözeltisindeki bilinen konsantrasyonundan hesaplanabilir. Test için gerekli parçaların maliyeti düşüktür ve yüksek derecede yeniden kullanılabilirliğe sahiptir ve bu da tahlilin yinelenen maliyetini önemli ölçüde azaltır. Bu nedenle, bu prosedür tüketimi hassas bir şekilde ölçmek için uygun fiyatlı, yüksek verimli bir yöntem sunar.

Protokol

1. Açlık plakası hazırlama

1. 250 mL cam bir beher içine 1,5 g agarose tartın.
2. Kabın içine 100 mL damıtılmış H₂O ekleyin.
3. Agarose tamamen eriyene kadar aralıklı olarak mikrodalga.
   NOT: Agarose kaynamaya eğilimli olduğundan beheri gözlemleyin.
4. Erimiş agarose'u bir reaktif oluğuna dökün ve çok kanallı bir pipet kullanarak 96 kuyulu bir mikro plakanın her kuyusuna 80 μL erimiş agarose dağıtın. Tabakların oda sıcaklığında kapalıyken kürlenebilmesine izin verin. Kalan agarose'u kapalı bir torbada bir haftaya kadar soğutun ve ek plakalar yapmak için yeniden eritin.

2. Sinek ayıklama ve açlık

1. Bariyer şeridi kanallarına bariyer şeritleri yerleştirerek bağlayıcıları hazırlayın. Bariyer şeritleri çok gevşekse, onları kanallarda tutmak için eğrilik vermek için parmağın etrafına sarın.
2. Bağlayıcıyı açlık plakasına yapıştırın. Bağlayıcı kayabileceğinden plakayı manipüle etmek için bağlayıcıyı kullanmayın. Bağlayıcıların doğru yönlendirildiğinden emin olun (yani, bağlayıcının açılı köşesinin mikro plakanın açılı köşesine eşleştiğinden emin olun).
3. CO₂ anestezisi (Malzeme Masası)altında, 3-5 günlük sinekleri sıralayın. Tek tek sinekleri sütunla açlık plakasına yükleyin.
   NOT: Sinekler sütuna göre yüklenmiş olsa da, örnek gruplarının aşağı sütunlar yerine plakanın aşağı satırlarına dağıtılması önerilir (plaka düzeni örneği için Şekil 4'e bakın).
4. Bariyer şeridini kapalı konuma ayarlayarak her sütunu doldururken kapatın.

Şekil 4: Temsili Açlık Plakası Düzeni. Diyagram, bu çalışmada kullanılan 96 kuyulu bir plakada buharlaşma kontrollerinin ve erkek ve dişi sineklerin organizasyonununu göstermektedir. A ve H satırlarında buharlaşma kontrollerine sahip alternatif erkek ve kadın sıraları da dahil olmak üzere alternatif konfigürasyonlar da kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Numune düzenini mikro plaka içinde dikkatlice kaydedin. Açlık plakası doldurulduktan sonra, CO_2'yi çıkardıktan sonra sineklerin kendiliğinden iyileşmesine izin verin ve ilk anestezi sürelerinden başlayarak 6 saat aç bırakın.

3. Sıvı gıda hazırlama

NOT: Sıvı gıdaları her gün taze yapın.

1. Damıtılmış H₂O'da FD&C Blue #1'in 10 mg/mL boya stok çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Bu, oda sıcaklığında 6 aya kadar saklanabilir.
2. 10 mL sıvı gıda (%4 sakkaroz, %1 maya özü, 40 μg/mL FD&C Blue #1) 15 mL konik tüpte 0,4 g sakkaroz ve 0,1 g maya ekstresini 10 mL damıtılmış H₂O. Vortex tüpü katılar tamamen çözünene kadar çözün. Çözeltiyi homojenize etmek için 40 μL boya stok çözeltisi ekleyin ve tüpü tekrar tekrar ters çevirin.
3. Sıvı gıdayı 0,45 μm filtre ile uçlu 10 mL şırınna aktarın. Çözeltinin ~1,5 mL'lik kısmını aynı anda 1,7 mL mikrosantrifüj tüpüne filtreleyin. Çözeltiyi içeren şırınnayı bir kenara koyun ve besleyici plaka hazırlığı sırasında ek çözeltiyi gerektiği gibi filtreleyin.

4. Besleyici plaka hazırlama

NOT: Kuyuda emici okumaları etkileyebilecek kabarcıkların veya damlacıkların oluşumunu önlemek için doldurduktan sonra besleyici plakalarını hafifçe kullanın.

1. 1536 kuyulu bir mikro plakanın altını sızdırmazlık filmiyle kapatarak bir besleyici plakası hazırlayın. Filme iyice yapışmak için bir sızdırmazlık raketi kullanın. Fazla filmi jiletle sol ve sağ kenarlardan kesin.
2. Filtrelenmiş sıvı gıda kolonunun 10 μL'sini (çizim için Şekil 5'e bakınız) 1536 kuyulu mikro plakanın uygun kuyularına dağıtın. Dört kuyudan oluşan her küme için sol üst kuyuya dağıtın (çizim için Şekil 5'e bakın).

Şekil 5: 1536 kuyulu besleyici plakası için sırayı ve kuyu konumunu doldurun. Diyagramda protokolün 4.2. Oklar, besleme çözeltisinin besleyici plakasına sütun 1'den 12'ye kadar her seferinde bir sütunda uygulanma sırasını gösterir. Örnek B1, 1 seçimli ve 2 seçenekli tahliller için besleme çözümlerinin yerinin bir örneğini göstermek için büyütülmüştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Tüm kuyular dolduktan sonra, plakanın üstüne bir sızdırmazlık filmi uygulayın. Filme iyice yapışmak için bir sızdırmazlık raketi kullanın. Fazla filmi jiletle sol ve sağ kenarlardan kesin. İstediğiniz sayıda plaka için tekrarlayın.
4. Sıvıyı yerleştirmek için plakaları 10 s için 200 x g'da santrifüjlayın. Plakanın soğutulmasına izin vermeyin, çünkü bu kuyularda yoğuşma birikmesine neden olabilir ve absorbans okumalarını gizleyebilir.

5. Pozlama

1. Sinekler tüketim testine hazır olduğunda, plakanın üst yüzeyindeki kuyuları 0,25 mm çapında bir iğne ile donatılmış iğne prob aracı ile delin. Çözümleri dağıtırken kullanılanla aynı sırayı delinmek için kullanın. Plakayı çevirin ve alttaki kuyuları delin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için çözeltiler arasındaki iğneyi silin. Kuyulardan gelen çözeltiyi fitillerken deliklere dokunmamaya dikkat edin.
2. Plakanın emiciliğini kapaksız 630 nm'de okuyun.
3. Yoğuşma halkalarının delikli kuyuları çevrelemesini sağlamak için üst sızdırmazlık filmine bir iç kapak yerleştirin. Dış kapağı tabağa yerleştirin.
4. Besleyici plakasını bağlayıcının üzerine, kılavuzlar besleyici plakasının ve açlık plakasının uygun deliklerini hizaleyecek şekilde yerleştirin. Bağlayıcının ve plakaların doğru yönlendirildiğinden emin olun (yani, bağlayıcının açılı köşesinin ve plakaların eşleştiklerinden emin olun). Bağlayıcıyı bir arada tutmak için elastik bantları üst ve alt plakaların etrafına sarın. Besleyici plakası ile bağlayıcı arasındaki hizalama ve boşlukları kontrol edin.
5. Tüm besleyici plakaları bağlayıcılara yüklendikten sonra, bağlayıcı üzerindeki bariyer şeritlerini ayarlayarak plakaların kuyularını açın. Bağlayıcı/plaka montajlarını ikincil kaba yerleştirin. Her ikincil kapsayıcı en fazla altı montaj barındırabilir.
6. Nem sağlamak için her ikincil kaba ıslatılmış kağıt havlu içeren bir pipet kutusunun alt yarısını yerleştirin. İkincil kapların kapağını kapatın ve kontrollü bir ortama aktarın (25 °C, nem kontrollü, 12 saat ışık:karanlık döngüler). Sineklerin 22 saat boyunca tüketilmesine izin verin.
7. 22 saat pozlama işleminden sonra, her plakada ölü sinek olup olmadığını kontrol edin ve plaka düzenini buna göre güncelleyin. Tüm plakalar kontrol edildikten sonra, ikincil kabın içine CO₂ pompalayarak sinekleri toplu olarak uyuşturun. ~60 s'den sonra, tüm sineklerin hareketsiz olduğundan emin olun. Sinekleri yavaşça açlık plakasına koyun ve plastik bariyer şeritlerini değiştirin. Beslemek plakalarını okumak için çıkarın.
8. Plakanın emiciliğini 630 nm'de yeniden okuyun. Tüm plakalar okunana kadar tekrarlayın.

6. Veri analizi

NOT: Analiz, araştırmacının tercih ettiği yazılım paketi ile yapılabilir.

1. 22 saat maruz kalma sırasında ölen sinekleri atla.
2. Her kuyu için, tüketilen hacmi şu şekilde hesaplayın:
   
   C - Tüketilen Hacim (μL)
   V - İlk Kuyu Hacmi (yani, 10 μL)
   ABS₀ - Ön Pozlama Absorbansı
   ABS₁ - Maruz Kalma Sonrası Absorbans
   NOT: Tüketim, hesaplamada pozitif bir hacim olarak gösterilir.
3. Buharlaşmayı hesaba katmak için, ortalama buharlaşma hacmini ilgili plakalardaki sinek tüketim değerlerinden çıkarın. 2 tercihli/tercihli test için, her kuyuyu ilgili çözümüne göre ayarlayın,örneğinbuharlaştırma kontrollerinde "seçim 1" kuyularını "seçim 1" ile ayarlayın.
4. Buharlaşma için ayarladıktan sonra, tüketim değeri sıfırdan az olan örnekleri bırakın.
5. 2 seçenekli testler için, her biri için tercihi hesaplayın:
   
   P - Tercih Endeksi (pozitif yön tercihi gösterir)
   F_A - Katkı Maddesi İçeren Sıvı Gıdaların Hacmi (Seçim 2)
   F_N - Tüketilen Normal Sıvı Gıda Hacmi (Seçim 1)

7. Mikro plaka ve bağlayıcı yıkama protokolü.

NOT: Hasar sızdırmazlıkları etkileyebileceğinden, mikro plakaların alt kısımlarında hasar görmesini önlemeye özen edin.

1. Filmleri ve etiketleri 1536 kuyulu mikro plakalardan çıkarın. Bağlayıcıları ve bariyer şeritlerini ayırın. Bariyer şeritlerini şişe gibi kapatılabilir bir kaba yerleştirin. Bariyer şeritlerini bir dizi ılık musluk suyu, hafif deterjan çözeltisi, ılık musluk suyu ve ardından damıtılmış H₂O'da kuvvetlice sallayarak yıkayın.
2. 1536 kuyulu mikro plakaları ve bağlayıcıları ılık musluk suyunun altında durulayın. Mikro plakalar için, mümkün olduğunca fazla çözelti ve döküntü temizlemek için her mikro plakanın kuyularından musluk suyu geçirin. Gerekirse, enkazı yerinden çıkarmak için bir pipet ucu kullanın; plakalarda metal veya cam gereçler kullanmayın.
3. Her tabağı ve bağlayıcıyı hafif bir deterjan çözeltisi (örn. %1 v/v Aquet) ile örtün. Plakalar için yüzeyleri eldivenli bir elle ovalayın. Bağlayıcılar için bir fırça kullanın.
4. Her plakayı musluk suyuyla ve ardından damıtılmış H₂O ile iyice durulayın.
5. Tabakların ve bağlayıcıların oda sıcaklığında kapalı olarak kurumasını bekleyin. Kullanıma kadar temiz bir depolama kutusunda saklayın.
   NOT: 1536 kuyulu mikro plakaları asla eldivensiz kullanın. Deriden kalan yağlar sızdırmazlığı engelleyebilir, iyi sızıntıya ve buharlaşmaya yol açabilir.

Sonuçlar

Tek tek plakaların kuyuları arasında herhangi bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için, buharlaşma her kuyu için ölçüldü (n = üç plaka için 96 kuyu / plaka). Buharlaşmanın -0.036 μL ± 0.003 μL (ortalama ± SEM boyunca) olduğu bulunmuştur. (Şekil 6A) Pearson korelasyonları buharlaşma ve kuyu konumları arasındaki eğilimleri değerlendirmek için hesaplandı. Buharlaşma ve satırlar için korelasyon katsayısı (Şekil 6B,C) -0,04 (p = 0,4949) ve buharlaşma vs sütunlar için -0,23 (p = 0,0001) idi. Gruplar daha sonra sütunlar arasındaki hafif ama istatistiksel olarak anlamlı korelasyonları azaltmak için sütunlar arasında dağıtıldı.

Şekil 6: MFA'da buharlaşma. (A) Kesik çizgi ile belirtilen ortalama ± SD ile buharlaşma değişikliklerinin yoğunluk dağılımı. Buharlaşma ve satırlar (B) veya sütunlar (C) arasındaki korelasyonlar, belirtilen Pearson korelasyon katsayısı ve p değeri ile. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokolün geçerliliğini belirlemek için, 3-5 günlük Kanton-S B sinekleri (n = 36 / seks / plaka ve n = üç plaka için 24 buharlaştırma kontrolü / plaka) için tüketim ölçüldü (Şekil 7). Kontrol kuyuları arasındaki buharlaşma sıfırdan önemli ölçüde farklıydı (-0.030 μL ± 0.006 μL, p = 4.81 x 10^-6; bir örnek t-test vs sıfır). Veri kümesinden biri gece maruziyeti sırasında ölüme, diğeri de buharlaşma ayarlamasından sonra negatif tüketim değerine bağlı olmak üzere iki örnek atlandı (her ikisi de erkek). Bu, %99'> örnek tutma oranı sağladı.

Şekil 7: MFA kullanılarak tüketim ölçülmesi. (A) Tüketim özel bir fabrikasyon cam hazne kullanılarak görselleştirilmiştir. Sineklerin delikli kuyulardan içilmesi gözlendi ve boyalı çözeltinin yutulması sonrasında mavi karın lekesi görüldü. Ayrıca bkz. Ek Video S.1. (B) Buharlaşma kontrolleri, erkek sinekler ve dişi sinekler arasında tüketim değerleri (ortalama ± SEM). İstatistiksel karşılaştırmalar için eşit olmayan varyanslı çift yönlü post hoc t-test yapıldı ve önemi çubuklarla belirtildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Daha sonra, Y = μ + S + P + SxP + e tarafından açıklandığı gibi, grup ortalaması olarak Y, genel ortalama olarak μ, cinsiyetin sabit etkisi olarak S, plakanın sabit etkisi olarak P, Seks ve Plaka arasındaki etkileşim olarak SxP ve artık değişkenlik olarak bir Varyans Analizi (ANOVA) modeli oluşturulmuştır. ANOVA tüketim için plakadan plakaya değişkenlik (p = 0.671) veya plakalarla cinsiyete özgü etkileşimler (p = 0.104) göstermezken, cinsiyet tek başına tüketimde gözlenen varyasyona önemli ölçüde katkıda bulunmuştur (p = 4.17 x 10^-18). Geçici bir test,erkeklerin kadınlardan önemli ölçüde daha az tükettiklerini göstermiştir (0.500 μL ± 0.017 μL vs 0.811 μL ± 0.028 μL, p = 1.13 x 10^-17, eşit olmayan varyanslı iki örnek t-test).

Testlerin iki seçenekli tercih nicelemesi için kullanılabileceğini göstermek için, sineklere% 1 maya özü ile% 4 sakkaroz çözeltisi ile% 15 etanol ve% 1 maya özü ile desteklenmiş% 4 sakkaroz çözeltisi arasında bir seçim yapıldı. Hem erkekler hem de dişiler, erkekler için 0.974 ± 0.026 ve kadınlarda 0.876 ± 0.06 tercih indeksleri (ortalama ± SEM) ile etanol ve maya özü ile çözelti için ezici bir tercih gösterdi (Şekil 8).

Şekil 8: MFA kullanılarak tercih nicelemesi. % 4 sakkaroz tüketimine karşı% 4 sakkaroz erkek ve dişi sinekler için% 15 etanol ve maya özü ile desteklenmiştir (n = her cinsiyet için 33). Erkek sinekler, kontrol sakkaroz çözeltisinden daha fazla etanol çözeltisi tüketti (0.511 μL ± 0.029 μL'ye karşı 0.00 μL ± 0.017 μL; p = 4.06e^-10; iki örnekli t-test). Dişi sinekler ayrıca kontrol sakkaroz çözeltisinden daha fazla etanol çözeltisi tüketti (0.939 μL ± 0.044 μL'ye karşı 0.132 μL ± 0.044 μL; p = 7.38e^-17; iki örnekli t-test). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S.1: Videoda delikli kuyudan beslenen bir sinek ve boyalı çözeltiyi yutarak mavi karın lekesi birikintisi görülüyor. Şekil 7A'dadurağan bir görüntü gösterilmiştir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya S.2: Mikro Plaka Besleyici Tahlil Bağlayıcı. Bu, MFA'da kullanılan bağlayıcının 3D yazdırılabilir bir yapısıdır. MFA için baskı malzemesi Naylon PA12 kullanılmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya S.3: Mikro plaka Besleyici Test Bariyer Şeridi. Bu, sineklerin besleyici plakasına maruz kalmasını geçiştirmek için kullanılan plastik bariyer şeritlerinin tasarımını içerir. Tek bir bağlayıcı on iki adede kadar bariyer şeridi kullanabilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya S.4: Mikro Plaka Besleyici Tahlil için ambalaj açma ve imalat talimatları. Bağlayıcı ve bariyer şeritlerini açmak için talimatlar dahildir. Maruz kalma sırasında buharlaşmayı sınırlamak için kullanılan iç kapak, dış kapak ve ikincil kap için imalat talimatları dahildir. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya S.5:Mikro Plaka Besleyici Test (MFA) ve 1 seçenekli tek sinekli CApillary FEeder (CAFE) test maliyet karşılaştırması. Tek bir hat için 72 sinek / cinsiyet test etmek iki set MFA ekipmanı (bağlayıcı + plaka + bariyer şeridi) gerektirirken, CAFE her kültür şişesi için sadece 1 kılcal damara ihtiyaç duyacaktır. MFA için ilk yatırımdaki büyük farka rağmen, yinelenen maliyetlerdeki büyük fark (sırasıyla 14,80 $ vs 46,08 $ ) sadece 4 satırı test ettikten sonra ön maliyetlerin geri kazanılmasına izin verecektir (kırılma noktası). Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Çalışma, Drosophila'dakitüketimi ölçmek için yeni bir protokol açıklanmaktadır: Mikro Plaka Besleyici Tahlili (MFA). Bu tahlilde sinekler, kontrollü boyutlu perforasyonlar yoluyla 1536 kuyulu bir mikro plakanın sızdırmaz kuyularından tüketir (Şekil 1, Şekil 2; Tamamlayıcı Video S.1). Sıvı gıdalar mikro plaka ile boyanıp sağlandığından, bir mikro plaka spektrofotometresi kullanılarak gıdanın optik emicisinin ölçümleri elde edilebilir (Şekil 3). Bu şekilde tüketim, tüketim öncesi ve sonrası emilin karşılaştırılması ve daha sonra bu oranın tüketimden önce dağıtılan bilinen hacme uygulanması ile belirlenir. Bu, boyalı ortamın farklı hacimlerinin emilimini ölçerek ampirik olarak doğrulandı (Şekil 3B).

Bu tahlil geliştirmek için, tüketimin emicine dayalı nicelleştirilmesinden yararlanabilecek bir cihaza ihtiyaç vardı. Sinekleri mikro plaka biçiminde test etmek çekicidir, çünkü yiyecek dağıtmak için kullanılan mikro plakayı tamamlar ve bağlayıcı geometriyi ayarlayarak birden fazla plaka formatından (örneğin, 6, 12, 48 veya 96 kuyu formatları) seçim yapma esnekliği sağlar. Bireysel sinek kültürüne izin vermek için 96 kuyulu bir mikro plaka formatı seçildi.

3D baskılı cihaz (Şekil 1) 1536 kuyulu besleyici plakasını 96 kuyulu kültür plakası ile hassas bir şekilde yönlendirerek her sinekten tüketim için besleyici plakasının 4 kuyusuna kadar erişim sağlar. Ayrıca, gövde plakasına sinek dağıtmak için yeterli zaman sağlamak ve test başlatmasını kontrol etmek için cihaz, ilgili kuyularındaki sinekleri içeren bariyer şeritlerini değiştirmeyi ve ihlalleri önlemeyi içerir. Bu parçaları temin etmek veya değiştirmek için gereken dosyalar sağlanır (Ek Dosyalar S.2-S.3), ve ilgili parçalar için gerekli imalat talimatları (Ek Dosya S.4).

MFA, Drosophila besleme davranışını izlemek için daha ayrıntılı yöntemleri tamamlayan basit bir yüksek aktarım hızı yöntemi sağlar^18,21,22. MFA, gıda alımını ölçmek için kullanılan diğer yöntemlere göre birden fazla avantaj sunar. Bir plaka okuyucu kullanılarak tüketimin ölçülmesi ile aktarım hızı artar. Bu, manuel ölçümleri ortadan kaldırır ve manuel veri girişini ortadan kaldırır. Veriler programlı ekstraksiyon ve işleme için de uygun. Ek olarak, daha yüksek verim, özellikle ortak besleyici tasarımlarına kıyasla, uygulanabilir biyolojik çoğaltma sayısını arttırır ve bu da tüketimdeki küçük farklılıkları tespit etme gücünü önemli ölçüde arttırır. MFA'yi kullanarak, tek bir deneyci, tahlilde bir gecede 500'den fazla sinek tüketimini veya tercihini ölçebilir. Testin çakışan koşuları ile 5 günlük bir sürede 2.000'den fazla sinek test edilebilir. Son olarak, mikro plakaların ve bağlayıcıların yeniden kullanılabilirliği nedeniyle uzun vadeli maliyet tasarrufu vardır (Ek Dosya S.5). MFA'nın kullanılmasıyla, test başına tahmini maliyet 14,80 $ kadar düşük olabilir ve ekipman için 127,60 $ peşin maliyet. Yüksek maliyetli hassas mikrokapsiller gerektiren klasik CApillary FEeder (CAFE) testini kullanarak, karşılaştırılabilir sayıda çoğaltma için test başına tahmini maliyet 46,08 USD'dir. Bu nedenle, gerekli ekipmanın elde etmek için önceden bir yatırım olsa da, yinelenen maliyetlerdeki azalma, özellikle tekrarlanan testlerin yapıldığı durumlarda önemli tasarruflara yol açabilir.

Tüm tahlillerde olduğu gibi, MFA'nın da belirli sınırlamaları vardır. Esas olarak, 1536 kuyulu mikro plakaları okuyabilen bir mikro plaka spektrofotometresine erişim gerektirir. Ek olarak, nicelik için absorbans ölçümlerine olan güven, yöntemi optik parazite karşı hassas hale getirir. Bu, test edilen örneklerin küçük bir alt kümesi için negatif tüketim değerleri olarak gösterir. Besin maddeleri, ilaçlar, farmasötikler veya ilgi çekici toksinlerin de testle uyumlu olması için suda çözünür olması gerekir.

Sınırlamalarına rağmen, bu yöntem Drosophila'dakitüketim davranışlarını ölçmek için yüksek verim yöntemi sunar. Ayrıca, kavrama cihazı birçok plaka formatını kabul etmek için kolayca değiştirilebilir ve çeşitli böcek türlerini barındırmasına izin verebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm Diameter Needles	Rave Scientific	RS-MN-52-001012
0.45 µm Syringe Filters	Olympus Plastics	25-245
10 mL Disposable Syringe	EXELINT	26200
Agarose	Fisher Scientific	BP1600
Barrier Strips (Laser Cut)	Ponoko	-	Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File:
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625501
Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets	Eppendorf	22638041
FD&C Blue #1	Spectrum Chemical Mfg Corp	FD110
Film Sealing Paddle	Fisher Scientific	50-563-280
Flystuff Flypad	Genesee Scientific	#59-114 and #59-119	CO2 Anesthesia: The Flypads  come in two sizes, either of which is appropriate
Microplate Coupler (3D Printed)	Shapeways	-	Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File:
Microplate Lids	Greiner Bio-One	656170
Molecular Devices SpectraMax iD5	Molecular Devices	-	Any microplate reader with 1536-well resolution will do.
Needle Probe Holder	Rave Scientific	RS-MN-52-001000
Polyester Sealing Film	Excel Scientific, Inc.	100-SEAL-PLT
Polystyrene 96-well microplates	Greiner Bio-One	655101
Polystyrene, Bottomless, 1536-well microplates	Greiner Bio-One	783000	Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing.
Rubber Bands
Sucrose	Sigma	S7903
Weather Stripping			1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422