İskemi / Reperfüzyon Hasarının Termal Olmayan Kızılötesi Işık Tedavisi ve Makrofaj Farklılaşmasının Müteakip Analizi

Özet

Bir fare iskemi modelinde 670 nm ışınlama ile reperfüzyon hasarının azaltılmasını ve turnike yerleştirilmesi ile reperfüzyonu tarif ediyoruz. Bu 670 nm ışınlama, inflamatuar yanıtı azalttı, proinflamatuar makrofajların sayısını azalttı ve koruyucu makrofajları artırdı.

Özet

Enflamatuar süreçlerden kaynaklanan doku hasarı ve nekroz, iskemi reperfüzyon hasarının (IRI) bir sonucudur. İskelet kasında iskemi, kas hücrelerinin aerobik enerji kapasitesini azaltarak olumsuz biyokimyasal değişikliklere ve iltihaplanmaya yol açar. Bu çalışmanın amacı, bir iskemi döneminde yakın kızılötesi ışığa (NIR) maruz kalmanın, proinflamatuar M1'i azaltmak ve koruyucu M2 makrofajlarını arttırmak, nekroz ve inflamasyonu azaltarak IRI'yi azalttığını göstermektir. C57 / Bl6 farelerine 3 saat boyunca tek taraflı turnike ile indüklenen arka bacak iskemisi uygulandı ve ardından 15 veya 30 dakika boyunca reperfüzyon uygulandı. Fareler rastgele 3 gruba ayrıldı. Grup 1'e 30 dk reperfüzyon ile IRI uygulandı. Grup 2'ye 15 dk reperfüzyon ile IRI uygulandı. Her grup, turnike kapatıldıktan sonra 5 dakika / 1 saat boyunca 50 mW /^cm2 maruziyeti olan% 50 NIR ve% 50 NIR ile tedavi edilen farelerden oluşuyordu. Grup 3, IRI atlanarak 3 saat boyunca uyuşturulan sahte hayvanlardı.

İskemi ve reperfüzyonu doğrulamak için tüm farelere lazer doppler akım görüntülemesi yapıldı. Akım verileri iskemik ekstremite oranı ve kontralateral kontrol olarak ifade edildi. Farelere reperfüzyondan sonra ötenazi yapıldı ve kuadriseps ve gastroknemius hasat edildi. İmmünopresipitasyon ve western blot makrofaj belirteçleri CD68 (M1) ve CD206 (M2) yapıldı ve CD14 ekspresyonuna normalize edildi. İnflamatuar belirteçler CXCL1 ve CXCL5'in ekspresyonu, IRI grubunda NIR tarafından önemli ölçüde azaltılmıştır. IR ve NIR alan hayvanlarda CD68'de önemli bir azalma ve CD206 ekspresyonunda bir artış gözlenmiştir. Doku nekrozu, 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) boyaması ile görselleştirildiği gibi IRI grubunda NIR ile azaldı. Bulgular, NIR'ye maruz kalmanın IRI'yi azalttığını ve doku sağkalımını iyileştirdiğini göstermektedir. NIR iltihabı azalttı, proinflamatuar M1'i azalttı ve koruyucu M2 makrofajlarını artırdı. NIR'ye maruz kalma, iltihabı azalttı ve rejenerasyonu artırdı, bu da iskemiyi takiben doku korumasına yol açtı.

Giriş

İskemi reperfüzyon yaralanması (IRI), vasküler yaralanmalar ve uzun süreli cerrahi turnike kullanımı sonrası görülen klinik bir zorluktur. Önceki çalışmalar, 60-90 dakikanın sıcak iskemi süresi için üst eşik olduğunu ve bunun ötesinde geri dönüşü olmayan doku hasarının meydana gelebileceğini göstermiştir. Sıcak iskemi süresinin sınırlamaları, disvasküler ekstremitelerin reimplantasyonunun başarısını ve kurtarılmasını diğer tüm faktörlerden daha fazla sınırlar ^1,2.

İskelet kasında iskemi, hücrelerin aerobik kapasitesini azaltarak akut inflamasyona ve olumsuz biyokimyasal değişikliklere yol açar. Bu etkiler, nötrofillerin alımını ve serbest radikallerin üretimini uyaran ve iskelet kasına daha fazla zarar veren reperfüzyon ile daha da kötüleşir. Bu, yaralanma sonucu veya kanamayı önlemek için kasıtlı olarak bir turnike kullanılması sonucu olsun, damar tıkanıklığından kaynaklanabilir. Bu süreçteki anahtar aracılardan bazıları, solunum patlaması fonksiyonunun ve serbest radikallerin³ üretiminin ayrılmaz bir parçası olan nötrofiller tarafından eksprese edilen bir enzim olan miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofilleri akut inflamasyon bölgelerine toplamaya yarayan CXCL1 ve CXCL5 gibi kemokinlerdir⁴.

Femoral arter, acil bir durumda açık bir turnikeyi taklit etmek için diseke edilmedi. Bu yaklaşım aynı zamanda iskemi ve reperfüzyon yaratmanın yanı sıra tutarlı bir kansız alan yaratmanın tekrarlanabilirliğine de dayanmaktadır. Önceki araştırmalar, 670 nm dalga boyuna sahip termal olmayan kızılötesi (NIR) ışığa maruz kalmanın, günler boyunca NIR'ye maruz kalan bir fare iskemik arka ayağında vasküler teminatlanmayı artırabileceğini ve IRI^5'in etkilerini hafifletebileceğini göstermiştir. Ek olarak, önceki araştırmalar, NIR ışığının makrofajların proinflamatuar (M1) veya prohealing (M2) fenotiplerine^{polarizasyonunu} indükleyebileceğini göstermiştir 6.

Hipoksi ve reperfüzyonu takiben doku hasarını ve hücresel ölümü en aza indirebilecek herhangi bir tedavi, vasküler yaralanmalar sonrası ekstremite kurtarma başarısını artırmada faydalı olacaktır. Bu nedenle, genel amaç, diğer tedavi yöntemlerine uygun bir seçenek olarak 670 nm ışık tedavisini sunarak IRI'yi iyileştirmektir. Bu makale, bir iskemi döneminde NIR ışığına maruz kalmanın, kemoatraktan proteinlerin salgılanmasını ve makrofajları bir M2 fenotipi almaya teşvik ederek inflamatuar hücrelerin akışını azaltarak iltihabı ve doku nekrozunu azalttığı hipotezine dayanmaktadır.

Protokol

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki tavsiyelere sıkı sıkıya bağlı olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol: AUA#1517). Farelerle ilgili tüm araştırmalar PHS politikasına uygun olarak yürütülmüştür.

1. Turnike yerleştirme

NOT: İskemiyi indüklemek ve kansız bir cerrahi alan elde etmek için bir turnike yerleştirildi.

1. İndüksiyon odasında %3-5'lik bir konsantrasyonda izofluran içeren bir C57/Bl6 faresini anestezik hale getirin.
2. Ayak parmağı sıkışmalarına yanıt vermediğinde fareyi indüksiyon odasından çıkarın. Fareyi, bir lazer doppler görüntüleyicinin (LDI) altında yansıtıcı olmayan bir mat bulunan bir ısıtma yastığı üzerinde% 1.5-2'de devam eden anestezi için bir burun konisine yerleştirin.
3. Turnikeyi sol arka bacağın etrafına yerleştirin (Şekil 1).
   NOT: Turnikeyi henüz kapatmayın. Önce kan akışını ölçün (bkz. bölüm 2).

2. LDI ile kan akışı ölçümü

NOT: Daha önce tarif edildiği gibi uygun oklüzyon ve reperfüzyonu doğrulamak için kan akışı ölçüldü⁷.

1. Anestezi uygulanmış fareyi LDI'nin (26 cm) altına, gergin bacaklar ve pençeler yukarı bakacak şekilde yüzüstü pozisyonda, yansıtıcı olmayan bir yüzeye sahip bir ısıtma yastığına yerleştirin.
2. Fareyi lazerin yakalama alanına (16,1 cm x 16,1 cm) yerleştirerek görüntü yakalayın.
   1. Lazeri 4 ms/piksel tarama hızına ayarlayın. Kayıt düğmesine basarak özel yazılımla görüntü yakalayın. Oklüzyon öncesinde, sırasında ve reperfüzyon sırasında kayıt düğmesine tıklayarak görüntü alın.
      NOT: Görüntüler akışla ilgili harita görüntüleridir; kırmızı iyi kan akışıdır; Mavi kan akışı değildir. Resimde tıkalı arka bacağın mavi olduğunu onaylayın. Benzer şekilde, daha önce tıkanmış arka bacağın reperfüzyonda kırmızı olduğunu doğrulamak için görüntüyü kontrol edin. LDI için yansıtıcı olmayan bir mata sahip olmak zorunludur; Aksi takdirde, yansıma görüntüleri etkileyecektir.
3. Bir ilgi alanı tanımlayarak sağlanan yazılımla görüntüleri analiz edin. İskemik ve kontrol bacakları arasında bir oran oluşturun.

3. İskemi ve reperfüzyon protokolü

1. Anestezi uygulanmış farenin arka ayağının etrafındaki turnikeyi 3 saat boyunca kapatın.
   NOT: Turnikenin sıkılması iskemi yaratır ve kan akışını kesintiye uğratır.
2. 3 saatlik oklüzyondan sonra turnikeyi açın; Arka ayağı 15 veya 30 dakika açın ve perfüze edin.

4. Doku hasadı

1. Fareleri derinlemesine uyuşturmak için anesteziyi% 5 izoflurana yükseltin. Ölümü sağlamak için göğüs boşluğunu keskin bir makasla açarak pnömotoraks yapın. Gastroknemii ve kuadriseps kaslarını^{toplayın 8,9,10}.
2. Toplanan dokuyu sıvı nitrojen içinde dondurun ve daha fazla analiz için -80 ° C'de saklayın.

5. NIR uygulaması

NOT: NIR, iltihabı azaltmak ve reperfüzyon hasarını azaltmak için uygulanır.

1. Oklüzyon sırasında saatte bir kez 5 dakika boyunca 100 mW yoğunlukta 670 nm NIR uygulayın.
2. Fiber optik ışık kaynağı ile arka ayağı ve ışık arasında 2.5 cm mesafe olacak şekilde hedef alın. Kontralateral bacağı NIR'ye maruz bırakmayın (kurulum için Şekil 1'e bakın).
3. İskemik dönem süresince NIR ışığını saatte 5 dakika parlatın.
4. Sahte grubu da aynı şekilde enstrümantize edin. Turnikeyi kapatmayın veya NIR'yi arka ayağa uygulamayın.
   NOT: NIR ışığının bir soğutucusu vardır. Işığa maruz kaldıktan sonra 5 dakika içinde sıcaklık artmaz¹¹.

6. Nekroz TTC

NOT: Doku nekrozu, kas dokusundaki nekrozun azalmasını görselleştirmek için değerlendirilir.

1. Taze kuadriseps kaslarını 37 ° C'de TTC ile 20-30 dakika boyunca pH 7.4'e ayarlanmış 0.1 M fosfat tamponunda %1 TTC içinde boyayın.
2. Bir formazan çökeltisinin varlığına bağlı olarak kırmızı, lekeli canlı dokuyu gözlemleyin.
   NOT: Kırmızı lekelenme, sağlıklı dokuda TTC'nin dehidrojenaz enzimleri tarafından azaltılmasına dayanır. Nekrotik doku lekesizdir¹⁰.
3. Analiz için TTC lekeli dilimlerin görüntülerini yakalayın ve ilgilenilen bir bölgeyi tanımlayarak nekrotik bölgeyi ölçün.

7. Klorotirozin için Batı analizi

1. Fareler iskemi/reperfüzyon protokolüne tabi tutulmalıdır (bölüm 3).
2. Dokuları hasat edin (bölüm 4) ve proteini daha önce tarif edildiği gibi izole edin¹². Bradford testi¹³ ile protein konsantrasyonunu belirleyin.
3. Daha önce tarif edildiği gibi 3-klorotirozin için elektroforez ve leke yapmak için toplam protein lizatını kullanın¹².
4. Gastroknemii'nin lizatları üzerinde bir batı lekesi yapın.
   1. 40 μL'de 25 μg toplam protein konsantrasyonu elde etmek için numunelere %5 merkaptoetanol içeren Laemmli numune tamponu ekleyin.
   2. Numuneleri %4-15 Tris-glisin uzatılmış jel üzerinde ( Malzeme Tablosuna bakınız) 50 mV'de 5 dakika boyunca çalıştırın. Boya cephesi bitene kadar voltajı 1 saat boyunca 100 mV'a yükseltin.
5. Jeli 1x transfer tamponunda (25 mM Tris, 190 mM glisin,% 20 metanol; gerekirse pH'ı 8.3'e ayarlayın) 10 dakika inkübe edin.
6. Transfer sandviçini (sünger, filtre, jel, selüloz membran, filtre, sünger) monte edin. Transfer aparatına yeniden kullanılabilir bir buz torbası yerleştirin. 100 mA'daki soğuk odada 30 dakika transfer edin.
   NOT: Transfer sandviçinde kabarcık sıkışmadığından, lekenin katot üzerinde ve jelin anot üzerinde olduğundan emin olun.
7. Lekeyi durulayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %0,05 Tween ile bloke edici tamponda ( Malzeme Tablosuna bakın) bloke edin. Birincil antikoru eklemeden önce lekeyi %5 Tween içeren Tris tamponlu salin (TBS) ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
8. 3-klorotirozine karşı birincil poliklonal antikorlarla gece boyunca inkübe edin. Bloke edici tampondaki antikorları% 0.05 Tween (1: 1.000) ile seyreltin.
9. İkincil antikorlar olarak yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge eşek anti-fare IgG ve HRP-anti-keçi IgG (1: 10.000 seyreltme) kullanın.
10. Gelişmiş kemilüminesans (ECL) reaktifi ve bir görüntüleme sistemi kullanarak lekelerdeki kimlik bantlarını görselleştirin.
    1. Bileşenleri üreticinin protokolüne göre karıştırın ve ECL reaktiflerini ilgili bantlara bağlamak için 3 dakika boyunca leke ile inkübe edin.
    2. Lekeyi bir görüntüleme sistemi ile görüntüleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). Yoğunluğu ölçmek ve ilgilenilen bantların yoğunluk değerlerini kontrol bantlarınınkilere göre normalleştirmek için ImageJ gibi bir görüntüleme yazılımı kullanın.

8. CXCL1 ve CXCL5 için ELISA

1. Daha önce tarif edildiği gibi gastroknemii kaslarından toplam proteini izole edin¹².
2. Daha önce açıklandığı gibi CXCL1 ve CXCL5 için ELISA ile iltihaplanma derecesini^{değerlendirin 14} ve üreticinin talimatlarına göre.

9. İmmünopresipitasyon ve ardından batı analizi

1. Fareleri iskemi / reperfüzyon protokolüne tabi tutun (bölüm 3).
2. Dokuları hasat edin (bölüm 4) ve proteini daha önce tarif edildiği gibi izole edin¹². Bradford Tahlili¹³ ile protein konsantrasyonunu belirleyin.
3. Toplam protein lizatının makrofaj fraksiyonunu konsantre etmek için, daha önce¹⁵ tarif edildiği gibi CD14 için bir immünopresipitasyon gerçekleştirin.
4. Daha önce tarif edildiği gibi CD206 ve CD68 için elektroforez ve leke yapmak için CD14 immünopresipitatını kullanın¹².
5. Bölüm 7'de tarif edildiği gibi gastrocnemii'nin lizatları üzerinde bir western lekesi uygulayın.
6. İmmünopresipitatları gece boyunca CD206 veya CD68'e karşı primer poliklonal antikorlarla inkübe edin. Antikorları TBS'de 1:200 oranında seyreltin.
7. İkincil antikorlar olarak HRP konjuge eşek anti-fare IgG ve HRP-anti-keçi IgG (1: 10.000 seyreltme) kullanın.
8. Üreticinin protokolüne göre bileşenleri karıştırdıktan sonra lekeye ECL reaktifi uygulayın ve ilgili bantları görselleştirmek için 3 dakika inkübe edin. Bir görüntüleme sistemi kullanarak lekeyi görüntüleyin.

10. İstatistiksel analiz

1. Tekrarlanan ölçümler için varyans analizi (ANOVA) ile gruplar içindeki ve arasındaki verilerin istatistiksel analizini yapın ve ardından Bonferroni'nin Öğrenci t-testini değiştirmesi, p ≤ 0.05.
2. Verileri, ortalamanın (SEM) ± standart hata veya ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edin.

Sonuçlar

Flow ölçümleri iskemi ve reperfüzyonu doğruladı
NIR ışık yerleşimi ve deney protokolü Şekil 1'de gösterilmiştir. NIR maruziyetinin iskelet kası IRI üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir murin arka bacak iskemi modeli geliştirildi ve kullanıldı. Beklendiği gibi, lazer doppler akı görüntüleme (Şekil 2A), turnikenin hem NIR ile tedavi edilen (n = 6) hem de ışıkla tedavi edilme...

Tartışmalar

Bu makale, arka bacaktaki inflamatuar yanıtı değiştirerek NIR ışık tedavisi ile reperfüzyon hasarının azaltılmasına odaklanan ilk çalışmalardan birini açıklamaktadır. İskemi, reperfüzyon hasarı ve NIR ışık tedavisi tamamen yeni değildir. Diğer çalışmalar NIR ışığı ile iskemi reperfüzyonuna odaklanmıştır. NIR ışık tedavisi, iskemi reperfüzyon hasarı sonrası miyokardiyal fract boyutunun azaltılmasında ve böbrek hasarının azaltılmasında ba?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium	Sigma Aldrich	17779-10X10ML-F	1% solution
4–15% Criterio TGX Stain-Free Protein Gel	BioRad	#5678084	Tris-glycine extended gels
4x Laemmli Sample Buffer - 1610747	BioRad	16110747
670 nm light source	NIR Technologies		custom made
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23227
BioRad ChemiDoc	Bio-Rad		Imaging system
Bio-Rad
β-mercaptoethanol	BioRad	1610710
CXCL1 ELISA	R&D Systems	DY453-05
CXCL5 ELISA	R&D Systems	DX000
Forane	Baxter	1001936040	isoflurane inhalant
goat anti-rabbit IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2004	1:10,000 dilution
Ice Accu ice pack
Laser doppler Imager	Moor	MOORLDI2-HIR
monoclonal CD14 antibody	Santa Cruz Biotechnologies	sc-515785	1:200 dilution
monoclonal CD206 antibody	Santa Cruz Biotechnologies	sc-58986	1:200 dilution
monoclonal CD68 antibody	Santa Cruz Biotechnologies	sc-20060	1:200 dilution
Pierce Protein free (TBS) blocking buffer			blocking buffer
polyclonal Chlorotyrosine Antibody	Hycult	HP5002	1:1,000 dilution
Protein A/G PLUS-Agarose	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2003
Super Signal West Femto	ThermoFisher	34095	enhanced chemiluminescence reagent