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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Describimos la reducción de la lesión por reperfusión mediante irradiación a 670 nm en un modelo murino de isquemia y reperfusión mediante la colocación de torniquete. Esta irradiación de 670 nm redujo la respuesta inflamatoria, disminuyó el número de macrófagos proinflamatorios y aumentó los macrófagos protectores.

Resumen

El daño tisular y la necrosis por procesos inflamatorios son consecuencia de la lesión por isquemia-reperfusión (IRI). En el músculo esquelético, la isquemia reduce la capacidad energética aeróbica de las células musculares, lo que provoca alteraciones bioquímicas adversas e inflamación. El objetivo de este estudio es demostrar que la exposición a la luz infrarroja cercana (NIR) durante un período de isquemia reduce la IRI al disminuir la necrosis y la inflamación, además de disminuir los mármacos M1 proinflamatorios y aumentar los macrófagos M2 protectores. Los ratones C57/Bl6 se sometieron a isquemia de las extremidades posteriores inducida por torniquete unilateral durante 3 h seguida de reperfusión durante 15 o 30 min. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a 3 grupos. Al grupo 1 se le realizó IRI con reperfusión de 30 min. El grupo 2 se sometió a IRI con una reperfusión de 15 min. Cada grupo consistió en un 50% de ratones tratados con NO-NIR y un 50% con NIR con una exposición de 50 mW/cm2 durante 5 min/1 h después del cierre del torniquete. En el grupo 3 se anestesiaron animales simulados durante 3 h omitiendo la IRI.

Se realizó un láser de flujo Doppler en todos los ratones para confirmar la isquemia y la reperfusión. Los datos de flujo se expresaron como la relación entre la extremidad isquémica y el control contralateral. Los ratones fueron sacrificados después de la reperfusión, y los cuádriceps y gastrocnemio fueron cosechados. Se realizó inmunoprecipitación y western blot de los marcadores de macrófagos CD68 (M1) y CD206 (M2) y se normalizó a la expresión de CD14. La expresión de los marcadores inflamatorios CXCL1 y CXCL5 se redujo significativamente con el NIR en el grupo IRI. Se observó una disminución significativa de CD68 y un aumento de la expresión de CD206 en los animales que recibieron IR y NIR. La necrosis tisular disminuyó por NIR en el grupo IRI, como se visualizó mediante la tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC). Los hallazgos demuestran que la exposición a NIR redujo la IRI y mejoró la supervivencia de los tejidos. El NIR redujo la inflamación, disminuyó la M1 proinflamatoria y aumentó los macrófagos M2 protectores. La exposición a NIR redujo la inflamación y mejoró la regeneración, lo que condujo a la protección de los tejidos después de la isquemia.

Introducción

La lesión por isquemia-reperfusión (IRI) es un desafío clínico que se observa después de lesiones vasculares y el uso prolongado de torniquetes quirúrgicos. Estudios previos han demostrado que 60-90 min es el umbral superior para el tiempo de isquemia caliente, más allá del cual puede ocurrir un daño tisular irreversible. Más que cualquier otro factor, las limitaciones del tiempo de isquemia caliente limitan el éxito y el rescate de la reimplantación de las extremidades disvasculares 1,2.

En el músculo esquelético, la isquemia reduce la capacidad aeróbica de las células, lo que conduce a una inflamación aguda y alteraciones bioquímicas adversas. Estos efectos se ven agravados por la reperfusión, que estimula el reclutamiento de neutrófilos y la producción de radicales libres, dañando aún más el músculo esquelético. Esto puede ocurrir por oclusión vascular, ya sea como resultado de una lesión o el uso intencional de un torniquete para prevenir la hemorragia. Algunos de los mediadores clave en este proceso son la mieloperoxidasa (MPO), una enzima expresada por los neutrófilos que es integral para la función respiratoria y la producción de radicales libres3, y quimiocinas como CXCL1 y CXCL5 que sirven para reclutar neutrófilos a sitios de inflamación aguda4.

La arteria femoral no se diseccionó para imitar un torniquete abierto en caso de emergencia. Este enfoque también se basa en la reproducibilidad de la creación de isquemia y reperfusión, así como en un área libre de sangre consistente. Investigaciones anteriores han demostrado que la exposición a luz infrarroja no térmica (NIR) con una longitud de onda de 670 nm puede aumentar la colateralización vascular en una extremidad posterior isquémica de ratón con exposición a NIR durante días, mitigando los efectos de IRI5. Además, investigaciones anteriores han demostrado que la luz NIR puede inducir la polarización de los macrófagos en fenotipos proinflamatorios (M1) o procurritivos (M2)6.

Cualquier tratamiento que pueda minimizar el daño tisular y la muerte celular después de la hipoxia y la reperfusión sería beneficioso para aumentar el éxito del rescate de la extremidad después de las lesiones vasculares. Por lo tanto, el objetivo general es mejorar el IRI mediante la introducción del tratamiento con luz de 670 nm como una opción viable a otras modalidades de tratamiento. Este trabajo se basa en la hipótesis de que la exposición a la luz NIR durante un período de isquemia disminuye la inflamación y la necrosis tisular al disminuir la secreción de proteínas quimioatrayentes y la afluencia de células inflamatorias al inducir a los macrófagos a adquirir un fenotipo M2.

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Protocolo

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Protocolo: AUA#1517). Todas las investigaciones con ratones se llevaron a cabo de conformidad con la política de PHS.

1. Colocación del torniquete

NOTA: Se colocó un torniquete para inducir la isquemia y lograr un campo quirúrgico libre de sangre.

  1. Anestesiar un ratón C57/Bl6 con isoflurano en la cámara de inducción a una concentración del 3-5%.
  2. Retire el ratón de la cámara de inducción cuando no responda a los pellizcos de los dedos de los pies. Coloque el ratón en un cono de nariz para una anestesia continua al 1,5-2% en una almohadilla térmica con una alfombrilla no reflectante debajo de un generador de imágenes láser Doppler (LDI).
  3. Coloque el torniquete alrededor de la extremidad posterior izquierda (Figura 1).
    NOTA: No cierre el torniquete todavía. Mida primero el flujo sanguíneo (ver sección 2).

2. Medición del flujo sanguíneo por LDI

NOTA: Se midió el flujo sanguíneo para confirmar la oclusión y reperfusión adecuadas como se describió anteriormente7.

  1. Coloque el ratón anestesiado por debajo del LDI (26 cm) sobre una almohadilla térmica con una superficie no reflectante en posición prona con las piernas estiradas y las patas hacia arriba.
  2. Capture imágenes colocando el ratón dentro del área de captura del láser (16,1 cm x 16,1 cm).
    1. Ajuste el láser a una velocidad de escaneo de 4 ms/píxel. Capture imágenes con el software propietario pulsando el botón de grabación . Tome imágenes antes, durante la oclusión y durante la reperfusión haciendo clic en el botón de grabación .
      NOTA: Las imágenes son imágenes de mapa relacionadas con el flujo; el rojo es un buen flujo sanguíneo; El azul no es flujo sanguíneo. Confirme en la imagen que la extremidad posterior ocluida es azul. Del mismo modo, revise la imagen para confirmar que la extremidad posterior previamente ocluida está roja en la reperfusión. Es imperativo tener una alfombrilla no reflectante para el LDI; de lo contrario, el reflejo afectará a las imágenes.
  3. Analice las imágenes con el software proporcionado definiendo una región de interés. Establecer una relación entre la pierna isquémica y la de control.

3. Protocolo de isquemia y reperfusión

  1. Cierre el torniquete alrededor de la extremidad posterior del ratón anestesiado durante 3 h.
    NOTA: Apretar el torniquete crea isquemia, interrumpiendo el flujo sanguíneo.
  2. Abra el torniquete después de 3 h de oclusión; Abrir y perfundir la extremidad posterior durante 15 o 30 min.

4. Recolección de tejidos

  1. Aumentar la anestesia al 5% de isoflurano para anestesiar profundamente a los ratones. Realizar un neumotórax abriendo la cavidad torácica con unas tijeras afiladas para asegurar la muerte. Coseche los músculos gastrocnemii y cuádriceps 8,9,10.
  2. Congele el tejido recogido en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C para su posterior análisis.

5. Aplicación de NIR

NOTA: El NIR se aplica para disminuir la inflamación y reducir la lesión por reperfusión.

  1. Aplique 670 nm NIR a una intensidad de 100 mW durante 5 min una vez por hora durante la oclusión.
  2. Dirija la extremidad posterior con la fuente de luz de fibra óptica a una distancia de 2,5 cm entre la extremidad posterior y la luz. No exponga la pierna contralateral al NIR (consulte la Figura 1 para ver la configuración).
  3. Ilumine la luz NIR durante 5 minutos por hora durante el período isquémico.
  4. Instrumenta el grupo falso de la misma manera. No cierre el torniquete ni aplique NIR en la extremidad posterior.
    NOTA: La luz NIR tiene un disipador de calor. La temperatura no aumenta dentro de los 5 minutos posteriores a la exposición a la luz11.

6. Necrosis TTC

NOTA: La necrosis tisular se evalúa para visualizar la reducción de la necrosis en el tejido muscular.

  1. Teñir los músculos frescos del cuádriceps con TTC a 37 °C durante 20-30 min en TTC al 1% en tampón de fosfato 0,1 M ajustado a pH 7,4.
  2. Observe tejido vivo rojo teñido en función de la presencia de un precipitado de formazano.
    NOTA: La tinción roja se basa en la reducción de TTC por las enzimas deshidrogenasas en el tejido sano. El tejido necrótico no está teñido10.
  3. Capture imágenes de cortes teñidos con TTC para su análisis y mida la región necrótica definiendo una región de interés.

7. Análisis occidental para la clorotirosina

  1. Someter a los ratones al protocolo de isquemia/reperfusión (sección 3).
  2. Recolectar tejidos (sección 4) y aislar la proteína como se describió anteriormente12. Determine la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford13.
  3. Utilice el lisado de proteína total para realizar la electroforesis y la transferencia de 3-clorotirosina como se describió anteriormente12.
  4. Realizar un western blot sobre los lisados del gastrocnemio.
    1. Añada a las muestras un tampón de muestra Laemmli que contenga un 5% de mercaptoetanol para obtener una concentración de 25 μg de proteína total en 40 μL.
    2. Ejecute las muestras en un gel extendido de trisglicina al 4-15% (consulte la tabla de materiales) a 50 mV durante 5 minutos. Aumente el voltaje a 100 mV durante 1 h hasta que se agote el frente de tinte.
  5. Incubar el gel en 1x tampón de transferencia (25 mM de Tris, 190 mM de glicina, 20% de metanol; ajuste el pH a 8,3 si es necesario) durante 10 min.
  6. Montar el sándwich de transferencia (esponja, filtro, gel, membrana de celulosa, filtro, esponja). Coloque una bolsa de hielo reutilizable en el aparato de transferencia. Trasvasar durante 30 min en la cámara frigorífica a 100 mA.
    NOTA: Asegúrese de que no queden burbujas atrapadas en el sándwich de transferencia, la mancha esté en el cátodo y el gel en el ánodo.
  7. Enjuague la mancha y bloquéela en un tampón de bloqueo (consulte la Tabla de materiales) con 0.05% Tween durante 30 min a temperatura ambiente. Lave la mancha con solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenga 5% de Tween tres veces durante 5 minutos cada una antes de agregar el anticuerpo primario.
  8. Incubar durante la noche con los anticuerpos policlonales primarios contra la 3-clorotirosina. Diluir los anticuerpos en tampón bloqueante con 0,05% Tween (1:1.000).
  9. Utilice la IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) y la IgG anti-cabra HRP (dilución 1:10.000) como anticuerpos secundarios.
  10. Visualice las bandas de identidad en las manchas utilizando un reactivo de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y un sistema de imágenes.
    1. Mezcle los componentes según el protocolo del fabricante e incubelos con el blot durante 3 min para unir los reactivos ECL a las bandas de interés.
    2. Visualice la mancha con un sistema de imágenes (consulte la Tabla de materiales). Utilice software de generación de imágenes como ImageJ para medir la densidad y normalizar los valores de densidad de las bandas de interés con los de las bandas de control.

8. ELISA para CXCL1 y CXCL5

  1. Aísle la proteína total de los músculos gastrocnemios como se describió anteriormente12.
  2. Evalúe el grado de inflamación mediante ELISA para CXCL1 y CXCL5 como se describió anteriormente14 y de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

9. Inmunoprecipitación seguida de análisis occidental

  1. Someter a los ratones al protocolo de isquemia/reperfusión (sección 3).
  2. Recolectar los tejidos (sección 4) y aislar la proteína como se describió anteriormente12. Determine la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford13.
  3. Para concentrar la fracción de macrófagos del lisado total de proteínas, se realiza una inmunoprecipitación para CD14 como se ha descrito anteriormente15.
  4. Utilice el inmunoprecipitado CD14 para realizar electroforesis y transferencia para CD206 y CD68 como se describió anteriormente12.
  5. Realizar un western blot sobre los lisados del gastrocnemii como se describe en la sección 7.
  6. Incubar los inmunoprecipitados durante la noche con los anticuerpos policlonales primarios contra CD206 o CD68. Diluir los anticuerpos 1:200 en TBS.
  7. Utilice IgG anti-ratón conjugada con HRP y HRP-anti-cabra IgG (dilución 1:10.000) como anticuerpos secundarios.
  8. Aplique el reactivo ECL al blot después de mezclar los componentes según el protocolo del fabricante e incube durante 3 minutos para visualizar las bandas de interés. Tome una imagen de la mancha con un sistema de diagnóstico por imágenes.

10. Análisis estadístico

  1. Realizar análisis estadístico de datos dentro y entre grupos con análisis de varianza (ANOVA) para medidas repetidas seguidas de la modificación de Bonferroni de la prueba t de Student, p ≤ 0,05.
  2. Exprese los datos como media ± error estándar de la media (SEM) o media ± desviación estándar (DE).

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Resultados

Las mediciones de flujo confirmaron isquemia y reperfusión
La ubicación de la luz NIR y el protocolo experimental se muestran en la Figura 1. Se desarrolló y empleó un modelo de isquemia murina de la extremidad posterior para evaluar el efecto de la exposición a NIR sobre la IRI del músculo esquelético. Como se esperaba, las imágenes de flujo Doppler láser (Figura 2A) verificaron que el torniquete fu...

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Discusión

Este artículo describe uno de los primeros estudios que se centró en la reducción de la lesión por reperfusión mediante el tratamiento con luz NIR mediante el cambio de la respuesta inflamatoria en la extremidad posterior. La isquemia, la lesión por reperfusión y el tratamiento con luz NIR no son del todo novedosos. Otros estudios se centraron en la reperfusión de isquemia con luz NIR. El tratamiento con luz NIR se ha utilizado con éxito en la reducción del tamaño del infract ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos al Departamento de Cirugía Ortopédica por financiar este estudio. También agradecemos a Brian Lindemer y Grant Broeckel por su apoyo técnico.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2,3,5-TriphenyltetrazoliumSigma Aldrich17779-10X10ML-F1% solution
4–15% Criterio TGX Stain-Free Protein GelBioRad#5678084Tris-glycine extended gels
4x Laemmli Sample Buffer - 1610747BioRad16110747
670 nm light sourceNIR Technologiescustom made
BCA Protein Assay KitThermo Fisher23227
BioRad ChemiDocBio-RadImaging system
Bio-Rad
β-mercaptoethanolBioRad1610710
CXCL1 ELISAR&D SystemsDY453-05
CXCL5 ELISAR&D SystemsDX000
ForaneBaxter1001936040isoflurane inhalant
goat anti-rabbit IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-20041:10,000 dilution
Ice Accu ice pack
Laser doppler ImagerMoorMOORLDI2-HIR
monoclonal CD14 antibodySanta Cruz Biotechnologiessc-5157851:200 dilution
monoclonal CD206 antibodySanta Cruz Biotechnologiessc-589861:200 dilution
monoclonal CD68 antibodySanta Cruz Biotechnologiessc-200601:200 dilution
Pierce Protein free (TBS) blocking bufferblocking buffer
polyclonal Chlorotyrosine AntibodyHycultHP50021:1,000 dilution
Protein A/G PLUS-AgaroseSanta Cruz Biotechnologiessc-2003
Super Signal West FemtoThermoFisher34095enhanced chemiluminescence reagent

Referencias

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