Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Zebra balığı böbrek gelişimini anlamak için önemli bir modeldir. Burada, mezonephros gelişimi sırasında zebra balığı larvalarında ve yavrularda gen ekspresyonunu tespit etmek için bir in situ melezleme protokolü optimize edilmiştir.

Özet

Zebra balığı ömrü boyunca iki böbrek yapısı oluşturur. Pronephros (embriyonik böbrek) embriyonik gelişim sırasında oluşur ve döllenmeden 2 gün sonra çalışmaya başlar. Sadece iki nefrondan oluşan pronephros, artan vücut kütlesi nedeniyle daha fazla böbrek fonksiyonu gerekli olana kadar larva yaşamı boyunca tek böbrek görevi görür. Bu yüksek taleple başa çıkmak için, metamorfoz sırasında mezonephros (yetişkin böbrek) oluşmaya başlar. Yeni birincil nefronlar pronephros'a kaynaşır ve bağlı lümenler oluşturur. Daha sonra, ikincil nefronlar, mezonephros'ta bir dallanma ağı oluşturmak için birincil olanlara (vb.) kaynaşır. Araştırmaların büyük çoğunluğu embriyo kullanma kolaylığı nedeniyle pronephros üzerinde yoğunlaşmıştır. Bu nedenle, mezonephros gelişimini daha iyi anlamak için daha yaşlı ve daha büyük larvaları ve yavru balıkları incelemek için teknikler geliştirmeye ihtiyaç vardır. Burada, gen ekspresyon analizi için bir in situ hibridizasyon protokolü, prob penetrasyonu, probların ve antikorların yıkanması ve mezomünleri daha iyi görselleştirmek için pigmentlerin ağartılması için optimize edilmiştir. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı, progenitör hücreleri ve nascent nephronların distal tübüllerini etiketlemek için kullanılır. Bu protokol mesonephros araştırmalarındaki boşluğu dolduruyor. Yeni böbrek dokularının mevcut nefronlarla nasıl oluştuğunu ve bütünleşip yenileyici tedaviler hakkında fikir verdiğini anlamak için çok önemli bir modeldir.

Giriş

Zebra balığı embriyosu, küçük boyutu, şeffaflığı, mevcut araçları ve beş güne kadar beslenmeden hayatta kalması nedeniyle doku gelişimini incelemek için önemli bir modeldir1,2. Böbrek gelişiminin anlaşılmasına ve zebra balıkları ile memeliler arasındaki korumanın korunmasına büyük katkıda bulunmuştur3,4,5. Böbrek, sıvı homeostazını korumada, kanı filtrelemede ve atıkların atılmasında önemli bir rol oynar6. Böbreğin fonksiyonel birimi olan nefron, uzun bir tübüle bağlı bir kan filtresinden oluşu....

Protokol

Zebra balığı larvalarının ve yavrularının kullanımı IUP IACUC (protokol #02-1920, #08-1920) tarafından onaylanmıştır. Çözüm içeriğinin ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Larvaların yükseltilmesi

NOT: Larvaları ve gençleri ilgi alanına yükseltmek 21 gün veya daha fazla sürecektir.

  1. Son yemeklerinden sonra öğleden sonra bir çiftleşme tankına 1 erkek ve 1 dişi balık ekleyerek çiftleşmek için yetişkin zebra balığı kurun.
    NOT: Tüm balık çiftleri çiftleşmez. Çiftleşme oranını belirlemek için 20 çift ayarlayarak başlayın ve gelecekteki denemelerde buna göre ayarlayın.

Sonuçlar

Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı kullanılarak, bu in situ hibridizasyon protokolünün mezonephros gelişimi sırasında böbrek progenitör hücrelerinin ve çeşitli nefron yapıların etiketlenmesinde etkili olduğu gösterilmiştir. Beklendiği gibi, merkezi sinir sistemi de bu transgenik çizgide etiketlenmiştir (gösterilmez). İlk mezofrerik nefron yaklaşık 5,2 mm'de oluşur, pronephros'a dorsal (Şekil 2A) ve bu nefron distal tübül EGFP10,12 ile etiketlenmişt.......

Tartışmalar

Burada açıklanan in situ hibridizasyon yöntemi mezonephros gelişimini incelemeye yöneliktir. Bununla birlikte, metamorfoz sırasında bağırsak, sinir sistemi, ölçekler ve pigmentasyon gibi diğer doku ve organların gelişimini incelemek için uygulanabilir14. Endojen genler veya transgenik çizgilerdeki floresan belirteçler için problar oluşturulabilir.

Larvaların, organları ve dokuları kendi bağlamlarında gözlemlemek için bozulmadan kalmala.......

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Pensilvanya Bilim Akademisi ve Pennsylvania Biyologlar Topluluğu ve Indiana University of Pennsylvania (Lisansüstü Çalışmalar ve Araştırma Okulu, Biyoloji Bölümü ve Cynthia Sushak Lisans BiyolojiSi Mükemmellik Fonu) tarafından finanse edildi. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı Dr. Neil Hukriede (Pittsburgh Üniversitesi) tarafından sağlanmıştır.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-fluorescein antibodyRoche/Sigma-Aldrich11426338910
Bleaching solution0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST
Blocking reagentRoche/Sigma-Aldrich11096176001Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction
Cell strainerFisher Scientific 22-363-549100 μm
E3 medium5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue
Eyelash manipulatorFisher ScientificNC1083208Use to manipulate larvae
Fixing solution4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down
Fluorescein probe synthesisRoche/Sigma-Aldrich11685619910
Glass vialFisher Scientific03-338B
Hatchfry encapsulationArgent
Hyb- solution50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20
Hyb+ solutionHYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin
MAB (10X)1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5
MABT1X MAB, 0.1% Tween-20
Maleic acidSigma-AldrichM0375
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
PBS (10X)8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4
PBST1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST21X PBS, 0.2% Tween-20
Powder foodMix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well
Proteinase KSigma-AldrichP5568Use to permeabilize larvae
Proteinase K solution20  μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST
Spirulina microfine powderArgent
SSC (20X)3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave
SSCT (0.2X)Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
SSCT (2X)Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
Staining buffer100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20
Staining solution200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer
Stopping solution1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST
Torula (yeast) RNASigma-AldrichR6625
TricaineSigma AldrichE105212%, pH 7
Wash buffer50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20

Referanslar

  1. Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
  2. Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 174zebra balb brekpronephrosmesonephroslhx1alarvaocuk

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Araştırma

Eğitim

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır