In Situ Mesonephros Gelişimi Sırasında Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Melezleme

Özet

Zebra balığı böbrek gelişimini anlamak için önemli bir modeldir. Burada, mezonephros gelişimi sırasında zebra balığı larvalarında ve yavrularda gen ekspresyonunu tespit etmek için bir in situ melezleme protokolü optimize edilmiştir.

Özet

Zebra balığı ömrü boyunca iki böbrek yapısı oluşturur. Pronephros (embriyonik böbrek) embriyonik gelişim sırasında oluşur ve döllenmeden 2 gün sonra çalışmaya başlar. Sadece iki nefrondan oluşan pronephros, artan vücut kütlesi nedeniyle daha fazla böbrek fonksiyonu gerekli olana kadar larva yaşamı boyunca tek böbrek görevi görür. Bu yüksek taleple başa çıkmak için, metamorfoz sırasında mezonephros (yetişkin böbrek) oluşmaya başlar. Yeni birincil nefronlar pronephros'a kaynaşır ve bağlı lümenler oluşturur. Daha sonra, ikincil nefronlar, mezonephros'ta bir dallanma ağı oluşturmak için birincil olanlara (vb.) kaynaşır. Araştırmaların büyük çoğunluğu embriyo kullanma kolaylığı nedeniyle pronephros üzerinde yoğunlaşmıştır. Bu nedenle, mezonephros gelişimini daha iyi anlamak için daha yaşlı ve daha büyük larvaları ve yavru balıkları incelemek için teknikler geliştirmeye ihtiyaç vardır. Burada, gen ekspresyon analizi için bir in situ hibridizasyon protokolü, prob penetrasyonu, probların ve antikorların yıkanması ve mezomünleri daha iyi görselleştirmek için pigmentlerin ağartılması için optimize edilmiştir. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı, progenitör hücreleri ve nascent nephronların distal tübüllerini etiketlemek için kullanılır. Bu protokol mesonephros araştırmalarındaki boşluğu dolduruyor. Yeni böbrek dokularının mevcut nefronlarla nasıl oluştuğunu ve bütünleşip yenileyici tedaviler hakkında fikir verdiğini anlamak için çok önemli bir modeldir.

Giriş

Zebra balığı embriyosu, küçük boyutu, şeffaflığı, mevcut araçları ve beş güne kadar beslenmeden hayatta kalması nedeniyle doku gelişimini incelemek için önemli bir ^modeldir1,2. Böbrek gelişiminin anlaşılmasına ve zebra balıkları ile memeliler arasındaki korumanın ^korunmasına büyük katkıda bulunmuştur3,4,5. Böbrek, sıvı homeostazını korumada, kanı filtrelemede ve atıkların atılmasında önemli bir rol ^oynar6. Böbreğin fonksiyonel birimi olan nefron, uzun bir tübüle bağlı bir kan filtresinden oluşu....

Protokol

Zebra balığı larvalarının ve yavrularının kullanımı IUP IACUC (protokol #02-1920, #08-1920) tarafından onaylanmıştır. Çözüm içeriğinin ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Larvaların yükseltilmesi

NOT: Larvaları ve gençleri ilgi alanına yükseltmek 21 gün veya daha fazla sürecektir.

1. Son yemeklerinden sonra öğleden sonra bir çiftleşme tankına 1 erkek ve 1 dişi balık ekleyerek çiftleşmek için yetişkin zebra balığı kurun.
   NOT: Tüm balık çiftleri çiftleşmez. Çiftleşme oranını belirlemek için 20 çift ayarlayarak başlayın ve gelecekteki denemelerde buna göre ayarlayın.

Sonuçlar

Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı kullanılarak, bu in situ hibridizasyon protokolünün mezonephros gelişimi sırasında böbrek progenitör hücrelerinin ve çeşitli nefron yapıların etiketlenmesinde etkili olduğu gösterilmiştir. Beklendiği gibi, merkezi sinir sistemi de bu transgenik çizgide etiketlenmiştir (gösterilmez). İlk mezofrerik nefron yaklaşık 5,2 mm'de oluşur, pronephros'a dorsal (Şekil 2A) ve bu nefron distal tübül EGFP10,12 ile etiketlenmişt.......

Tartışmalar

Burada açıklanan in situ hibridizasyon yöntemi mezonephros gelişimini incelemeye yöneliktir. Bununla birlikte, metamorfoz sırasında bağırsak, sinir sistemi, ölçekler ve pigmentasyon gibi diğer doku ve organların gelişimini incelemek için ^{uygulanabilir14}. Endojen genler veya transgenik çizgilerdeki floresan belirteçler için problar oluşturulabilir.

Larvaların, organları ve dokuları kendi bağlamlarında gözlemlemek için bozulmadan kalmala.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-fluorescein antibody	Roche/Sigma-Aldrich	11426338910
Bleaching solution			0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST
Blocking reagent	Roche/Sigma-Aldrich	11096176001	Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction
Cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549	100 μm
E3 medium			5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue
Eyelash manipulator	Fisher Scientific	NC1083208	Use to manipulate larvae
Fixing solution			4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down
Fluorescein probe synthesis	Roche/Sigma-Aldrich	11685619910
Glass vial	Fisher Scientific	03-338B
Hatchfry encapsulation	Argent
Hyb- solution			50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20
Hyb+ solution			HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin
MAB (10X)			1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5
MABT			1X MAB, 0.1% Tween-20
Maleic acid	Sigma-Aldrich	M0375
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127
PBS (10X)			8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4
PBST			1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST2			1X PBS, 0.2% Tween-20
Powder food			Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P5568	Use to permeabilize larvae
Proteinase K solution			20  μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST
Spirulina microfine powder	Argent
SSC (20X)			3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave
SSCT (0.2X)			Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
SSCT (2X)			Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
Staining buffer			100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20
Staining solution			200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer
Stopping solution			1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST
Torula (yeast) RNA	Sigma-Aldrich	R6625
Tricaine	Sigma Aldrich	E10521	2%, pH 7
Wash buffer			50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20