Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Zebra balığı böbrek gelişimini anlamak için önemli bir modeldir. Burada, mezonephros gelişimi sırasında zebra balığı larvalarında ve yavrularda gen ekspresyonunu tespit etmek için bir in situ melezleme protokolü optimize edilmiştir.
Zebra balığı ömrü boyunca iki böbrek yapısı oluşturur. Pronephros (embriyonik böbrek) embriyonik gelişim sırasında oluşur ve döllenmeden 2 gün sonra çalışmaya başlar. Sadece iki nefrondan oluşan pronephros, artan vücut kütlesi nedeniyle daha fazla böbrek fonksiyonu gerekli olana kadar larva yaşamı boyunca tek böbrek görevi görür. Bu yüksek taleple başa çıkmak için, metamorfoz sırasında mezonephros (yetişkin böbrek) oluşmaya başlar. Yeni birincil nefronlar pronephros'a kaynaşır ve bağlı lümenler oluşturur. Daha sonra, ikincil nefronlar, mezonephros'ta bir dallanma ağı oluşturmak için birincil olanlara (vb.) kaynaşır. Araştırmaların büyük çoğunluğu embriyo kullanma kolaylığı nedeniyle pronephros üzerinde yoğunlaşmıştır. Bu nedenle, mezonephros gelişimini daha iyi anlamak için daha yaşlı ve daha büyük larvaları ve yavru balıkları incelemek için teknikler geliştirmeye ihtiyaç vardır. Burada, gen ekspresyon analizi için bir in situ hibridizasyon protokolü, prob penetrasyonu, probların ve antikorların yıkanması ve mezomünleri daha iyi görselleştirmek için pigmentlerin ağartılması için optimize edilmiştir. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı, progenitör hücreleri ve nascent nephronların distal tübüllerini etiketlemek için kullanılır. Bu protokol mesonephros araştırmalarındaki boşluğu dolduruyor. Yeni böbrek dokularının mevcut nefronlarla nasıl oluştuğunu ve bütünleşip yenileyici tedaviler hakkında fikir verdiğini anlamak için çok önemli bir modeldir.
Zebra balığı embriyosu, küçük boyutu, şeffaflığı, mevcut araçları ve beş güne kadar beslenmeden hayatta kalması nedeniyle doku gelişimini incelemek için önemli bir modeldir1,2. Böbrek gelişiminin anlaşılmasına ve zebra balıkları ile memeliler arasındaki korumanın korunmasına büyük katkıda bulunmuştur3,4,5. Böbrek, sıvı homeostazını korumada, kanı filtrelemede ve atıkların atılmasında önemli bir rol oynar6. Böbreğin fonksiyonel birimi olan nefron, uzun bir tübüle bağlı bir kan filtresinden oluşu....
Zebra balığı larvalarının ve yavrularının kullanımı IUP IACUC (protokol #02-1920, #08-1920) tarafından onaylanmıştır. Çözüm içeriğinin ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Larvaların yükseltilmesi
NOT: Larvaları ve gençleri ilgi alanına yükseltmek 21 gün veya daha fazla sürecektir.
Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı kullanılarak, bu in situ hibridizasyon protokolünün mezonephros gelişimi sırasında böbrek progenitör hücrelerinin ve çeşitli nefron yapıların etiketlenmesinde etkili olduğu gösterilmiştir. Beklendiği gibi, merkezi sinir sistemi de bu transgenik çizgide etiketlenmiştir (gösterilmez). İlk mezofrerik nefron yaklaşık 5,2 mm'de oluşur, pronephros'a dorsal (Şekil 2A) ve bu nefron distal tübül EGFP10,12 ile etiketlenmişt.......
Burada açıklanan in situ hibridizasyon yöntemi mezonephros gelişimini incelemeye yöneliktir. Bununla birlikte, metamorfoz sırasında bağırsak, sinir sistemi, ölçekler ve pigmentasyon gibi diğer doku ve organların gelişimini incelemek için uygulanabilir14. Endojen genler veya transgenik çizgilerdeki floresan belirteçler için problar oluşturulabilir.
Larvaların, organları ve dokuları kendi bağlamlarında gözlemlemek için bozulmadan kalmala.......
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Pensilvanya Bilim Akademisi ve Pennsylvania Biyologlar Topluluğu ve Indiana University of Pennsylvania (Lisansüstü Çalışmalar ve Araştırma Okulu, Biyoloji Bölümü ve Cynthia Sushak Lisans BiyolojiSi Mükemmellik Fonu) tarafından finanse edildi. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı Dr. Neil Hukriede (Pittsburgh Üniversitesi) tarafından sağlanmıştır.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
Hatchfry encapsulation | Argent | ||
Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
Spirulina microfine powder | Argent | ||
SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiDaha Fazla Makale Keşfet
This article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır