In situ Hibridização em Larvas de Zebrafish e Juvenis durante o Desenvolvimento de Mesonephros

Resumo

O zebrafish é um modelo importante para entender o desenvolvimento renal. Aqui, um protocolo de hibridização in situ é otimizado para detectar expressão genética em larvas de zebrafish e juvenis durante o desenvolvimento de mesonepros.

Resumo

O zebrafish forma duas estruturas renais em sua vida. Os pronephros (rim embrionário) formam-se durante o desenvolvimento embrionário e começam a funcionar a 2 dias após a fertilização. Composto por apenas dois nefrões, os glifos servem como rim único durante a vida larval até que mais função renal seja necessária devido ao aumento da massa corporal. Para lidar com essa maior demanda, os mesonepros (rim adulto) começam a se formar durante a metamorfose. Os novos nefrons primários se fundem aos glifos e formam lúmens conectados. Em seguida, nefrões secundários se fundem aos primários (e assim por diante) para criar uma rede de ramificação nos mesonephros. A grande maioria das pesquisas está focada nos dispositivos proviros devido à facilidade de uso de embriões. Assim, é necessário desenvolver técnicas para estudar larvas mais antigas e maiores e peixes juvenis para entender melhor o desenvolvimento de mesonepros. Aqui, um protocolo de hibridização in situ para análise de expressão genética é otimizado para penetração de sondas, lavagem de sondas e anticorpos, e branqueamento de pigmentos para melhor visualizar os mesonephros. A linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP) é usada para rotular células progenitoras e os túbulos distais de nefrrons nascentes. Este protocolo preenche uma lacuna na pesquisa de mesonepros. É um modelo crucial para entender como os novos tecidos renais se formam e se integram com os nefrões existentes e fornecem insights sobre terapias regenerativas.

Introdução

O embrião de zebrafish é um modelo importante para estudar o desenvolvimento de tecidos devido ao seu pequeno tamanho, transparência, ferramentas disponíveis e sobrevivência sem se alimentar por até cinco ^dias1,2. Contribuiu muito para a compreensão do desenvolvimento renal e da conservação entre zebrafish e mamíferos3,4,5. O rim desempenha um papel essencial na manutenção da homeostase fluida, filtrando o sangue e excretando ^resíduos6. O nefron, a unidade funcional do rim, compreende um filtro sanguíneo conectado a um túbulo longo. Em zebrafish, duas estruturas renais se formam ao longo de sua vida. Os pronephros (o rim embrionário temporário) formam-se primeiro durante o desenvolvimento precoce. Consiste em dois nefrões correndo ao longo do eixo anterior-posterior e torna-se funcional em cerca de 2 dias após a fertilização (dpf). A utilidade dos tubérculos está em sua simplicidade, tendo apenas dois nefrões que são em sua maioria lineares e fáceis de visualizar (embora o túbulo proximal convolutado comece a enrolar em três dpf)³. Isso facilitou não apenas estudos de seu desenvolvimento precoce a partir do mesoderm intermediário, mas também do padrão de segmentação e reparo de túbulos7,8.

A utilidade do zebrafish torna-se limitada após cinco dpf, quando a gema é diminuída e as larvas dependem da alimentação no sistema ^aquático9. Com cerca de 2 semanas de idade, as larvas passam por metamorfose em juvenis, onde novos tecidos se formam e tecidos antigos são perdidos e/ou ^{reorganizados9}. É também quando os mesonephros (o rim adulto permanente) formam 10,11,12. O primeiro nefron adulto forma-se perto do sexto somite, e funde-se com o túbulo distal precoce dos tubérculos. Nephrons adicionais são adicionados posteriormente a esta posição inicialmente, mas também para o anterior mais tarde. Os néfirons primários nesta primeira onda se fundem aos túbulos dos tubérculos e compartilham um lúmen comum para depositar seus resíduos. Nefrões secundários formam-se na próxima onda e fundem-se aos nefrões primários. Este processo reiterativo cria um mesonepros que é ramificado, um pouco semelhante ao rim mamífero. Presumivelmente, os tubérculos eventualmente perdem sua identidade túbula e se tornam dois grandes dutos coletores onde todos os nefrões drenam seus ^resíduos13.

Antes da formação do primeiro nefron adulto, células progenitoras únicas começam a aparecer em larvas de ~4 mm (comprimento total) (~10 dpf). Essas células, que estão marcadas na linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP), aderem aosphros propensos e parecem migrar para futuros locais de nefrogenese. As células únicas se fundem em aglomerados, que se diferenciam em novos ^nefrões12. Não está claro onde essas células residem ou quais genes elas expressam antes do início da mesonofrogenese.

Compreender o desenvolvimento de mesonephros fornece insights sobre o rim mamífero de maneiras que os pronephros não podem. Estes incluem a formação de agregados nefrogenicos a partir de células progenitoras únicas, integração funcional de novos nefrões com os existentes, e morfogênese ramificada. No entanto, há limitações para estudar o desenvolvimento pós-cisônico. As larvas são menos transparentes devido ao seu tamanho maior e ter pigmentação. O cronograma de desenvolvimento não é síncronto entre os animais individuais e é altamente dependente de fatores ambientais, como alimentação e aglomeração ^{de 9,14}. Embora os reagentes de knockdown existam, eles são menos eficazes em larvas em comparação com ^embriões15. Neste protocolo, é descrito um método de hibridização in situ para determinar a expressão genética durante o desenvolvimento de mesonepros de zebrafish. Várias etapas são otimizadas para aumentar a visualização dos mesonephros e penetração e lavagem da sonda e anticorpo. A linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP) é usada juntamente com uma sonda para EGFP para rotular células progenitoras únicas, agregados nefrogenicos e os túbulos distais de nefrrons nascentes. Este método fornecerá uma compreensão mais profunda do desenvolvimento de mesonepros e uma visão sobre terapias regenerativas.

Protocolo

O uso de larvas de zebrafish e juvenis é aprovado pelo IUP IACUC (protocolo nº 02-1920, #08-1920). Os detalhes do conteúdo da solução estão listados na Tabela de Materiais.

1. Criar larvas

NOTA: Levará até 21 dias ou mais para elevar larvas e juvenis ao estágio de interesse.

1. Configure zebrafish adulto para acasalar adicionando 1 peixe macho e 1 fêmea em um tanque de acasalamento no final da tarde após sua última refeição.
   NOTA: Nem todos os pares de peixes vão acasalar. Comece por configurar 20 pares para determinar a taxa de acasalamento e ajustar-se de acordo em experimentos futuros.
2. No dia seguinte, após o término do acasalamento dos peixes (por volta das 13h), recolhe os embriões com meio E3 em placas de Petri.
   1. Certifique-se de que não há mais de 30 embriões por placa.
   2. Remova detritos (como fezes) das placas de Petri e adicione 20 mL de meio E3.
   3. Incubar a 28,5 °C por 1 dia.
3. Coloque o zebrafish adulto de volta no sistema aquático.
4. A 1 dpf, substitua o meio E3 por E3 fresco.
   1. Incubar a 28,5 °C por mais 4 dias até 5 dpf.
5. Coloque uma tela de 400 μm em um tanque de 2,8 L e encha-a com 2 cm de água do sistema.
   1. Adicione as larvas de 5 dpf de 1 placa (até 30 larvas totais).
   2. Coloque o tanque no sistema aquático, mas não inicie o fluxo de água.
6. Alimente as larvas 4 mL de alimentos em pó duas vezes ao dia até 14 dpf.
7. A 6 dpf, inicie o fluxo de água a 1 gotejamento por segundo.
   NOTA: Verifique o fluxo de água diariamente e ajuste de acordo.
8. Em 8 dpf, aumente o fluxo de água para um fluxo lento e constante.
9. Aos 14 dpf, alimente camarão de salmoura ao vivo, além do alimento em pó.

2. Dia 1 - 2: Fixação de larvas

1. Remova um tanque de larvas no ponto de tempo desejado.
2. Encha uma placa de Petri com 20 mL de água do sistema.
3. Use uma rede de malha fina para colher suavemente as larvas e trazê-las para a superfície da água.
   1. Corte a ponta de uma pipeta de transferência para dar uma abertura mais ampla e transfira as larvas para a placa de Petri. A boca de pipeta maior permite a transferência de várias larvas pequenas ou algumas maiores ao mesmo tempo.
4. Adicione 2 mL de tricaine (2%, pH 7 estoque) para imobilizar as larvas.
   1. Depois que as larvas pararem de se mover, remova a maior parte da água e adicione 10 mL de tricaine. Espere 15 min para que as larvas sejam eutanizadas.
   2. Opcional: Para menores de 8 mm, corte as cabeças e caudas com uma lâmina de barbear (após a eutanásia) sob um microscópio dissecando para melhorar a penetração da solução de fixação. Certifique-se de registrar o comprimento total de cada animal antes de cortar a cabeça e a cauda e isolar cada um em sua própria placa de Petri. Consulte a etapa 3 sobre como medir os animais.
5. Substitua o tricaine por 20 mL de solução de fixação (4% paraformaldeído, 1% DMSO). Coloque a tampa de volta na placa de Petri e arrase lentamente em um capô de fumaça.
   NOTA: É importante usar uma plataforma de balanço. Uma plataforma de agitação com um movimento circular fará com que o eixo animal seja curvado. Use apenas uma solução de fixação fresca (não pré-feita congelada).
   ATENÇÃO: A solução de fixação contém paraformaldeído, que é um provável cancerígeno. Use capô de fumaça (ou máscara) e luvas para medir o pó.
6. Após 30 min, substitua a solução de fixação por uma nova solução de fixação.
   1. Colete a solução de fixação usada em um recipiente de resíduos separado para o descarte adequado.
   2. Transfira as larvas para um tubo de 50 mL contendo 25 mL de solução de fixação fresca.
   3. Certifique-se de que a tampa está apertada e arrase lentamente a 4 °C por 2 dias. É possível incubar mais por conveniência.

3. Dia 3: Medindo larvas

1. Em um capô de fumaça, substitua a solução de fixação por 20 mL de PBST.
2. Transfira as larvas para uma placa de Petri.
3. Coloque uma régua plana em um microscópio dissecando e coloque a placa de Petri em cima da régua.
4. Use um manipulador de cílios para mover cada larva para a régua para medir seu comprimento total (do focinho até a ponta da barbatana caudal) (Figura 1).
5. Combine várias larvas de comprimentos semelhantes (por exemplo, 5,0 mm e 5,1 mm) em um frasco de vidro de 5,5 mL, até 10 larvas por frasco.

4. Dia 3 - 4: Desidratação

1. Substitua o PBST por 4 mL de 100% de metanol. Balance o frasco por 5 minutos em temperatura ambiente.
2. Substitua o metanol por metanol fresco e pedra por 5 minutos. Repita mais uma vez.
3. Guarde o frasco a -20 °C durante 2 dias. É possível incubar mais por conveniência.

5. Dia 5: Reidratação

1. Aqueça o frasco à temperatura ambiente.
2. Substitua o metanol por 4 mL de 75% de metanol/25% PBST. Rocha por 5 minutos em temperatura ambiente.
3. Substitua a solução na etapa 5.2 por 4 mL de 50% de metanol/50% PBST e a rocha por 5 min.
4. Substitua a solução na etapa 5.3 por 4 mL de 25% de metanol/75% PBST e a rocha por 5 min.
5. Substitua a solução na etapa 5.4 por 4 mL PBST e a rocha por 10 minutos.
6. Substitua o PBST por 4 mL de PBST fresco e a rocha por 10 minutos. Repita mais uma vez.

6. Dia 5: Proteinase K digest

1. Substitua o PBST por 2 mL da solução proteinase K (20 μg/mL, 1% de concentração final de DMSO em PBST) e rocha em temperatura ambiente por 30 minutos.
   NOTA: Larvas com mais de 6 mm precisarão de um tempo de incubação mais longo e/ou uma maior concentração de proteínas. A hora exata e a concentração precisarão ser determinadas empiricamente. Comece com um aumento de 10 minutos no tempo de incubação para cada 0,5 mm maior que 6 mm.
2. Substitua a solução proteinase K por 4 mL de PBST e a rocha por 10 min.
3. Substitua o PBST por 4 mL de PBST fresco e a rocha por 10 minutos. Repita mais uma vez.
4. Substitua o PBST por 4 mL de solução de fixação fresca e a rocha por 1h. É possível incubar mais a 4 °C por conveniência.

7. Dia 5: Branqueamento

1. Substitua a solução de fixação por 4 mL de PBST e a rocha em temperatura ambiente por 10 minutos.
2. Substitua o PBST por 4 mL de PBST fresco e a rocha por 10 minutos. Repita mais uma vez.
3. Transfira as larvas para uma placa de 6 poços (até 10 larvas por poço).
4. Substitua o PBST por 3 mL de solução de branqueamento fresco.
5. Afinar à temperatura ambiente e monitorar a pigmentação sob um microscópio dissecando a cada 5 minutos. Procure o desaparecimento da pigmentação ao longo dos mesonephros (dorsal à bexiga e intestino).
   NOTA: Para larvas de até 6 mm de comprimento, levará até 20 minutos para branquear a pigmentação em torno dos mesonephros. Não alvejar mais tempo do que o necessário para preservar a integridade das larvas.
6. Transfira as larvas de volta para um frasco de vidro.
7. Substitua a solução de branqueamento por 4 mL de PBST. Rocha por 10 minutos.
8. Substitua o PBST por 4 mL de PBST fresco e a rocha por 10 minutos. Repita mais uma vez.
9. Substitua o PBST por 4 mL de solução de fixação fresca e a rocha por 1h. É possível incubar mais a 4 °C por conveniência.

8. Dia 5: Pré-lubrificação

NOTA: Para as etapas feitas a 70 °C, é importante trabalhar rapidamente para minimizar o resfriamento do frasco.

1. Substitua a solução de fixação por 4 mL de PBST e a rocha em temperatura ambiente por 10 minutos.
2. Substitua o PBST por 4 mL de PBST fresco e a rocha por 10 minutos. Repita mais uma vez.
3. Substitua o PBST por 4 mL da solução Hyb e a rocha em temperatura ambiente por 10 minutos.
   ATENÇÃO: As soluções hyb-, hyb+e sonda contêm formamida, o que pode irritar a pele. Use luvas para lidar com essas soluções.
4. Substitua o Hyb- por 4 mL de Hyb fresco e pedra por 10 minutos. Repita mais uma vez.
   1. Colete as soluções de Hyb-, Hyb+e sonda usadas em um recipiente de resíduos separado para o descarte adequado.
5. Substitua o Hyb- por 4 mL da solução Hyb+.
6. Incubar o frasco a 70 °C durante a noite.
7. Diluir a sonda EGFP-fluoresceína 1:100 em 500 μL de Hyb+ e incubar-a O/N a 70 °C.
   NOTA: Siga as instruções do fabricante para a síntese da sonda.

9. Dia 6: Hibridização da sonda

1. Substitua a solução Hyb+ no frasco com a sonda pré-aquecido e incubar a 70 °C durante a noite.
   NOTA: Larvas com mais de 6 mm precisam de 2 dias de incubação.
2. Pré-aqueça as soluções de tampão de lavagem, 2x SSCT e 0,2x SSCT a 70 °C durante a noite.

10. Dia 7: Lavagem da sonda

1. Substitua a sonda por 4 mL do tampão de lavagem pré-aquecido e incubar a 70 °C por 30 min.
   1. Colete a sonda usada em um recipiente de resíduos separado para o descarte adequado.
2. Substitua o tampão de lavagem por 4 mL de tampão de lavagem fresco e incubar a 70 °C por 30 min.
3. Substitua o tampão de lavagem por 4 mL da solução SSCT 2x pré-aquecido e incuba-o a 70 °C por 15 min.
4. Adicione 50 mL de SSCT pré-aquecidos de 0,2x em um tubo de 50 mL.
   1. Insira um coador de células (100 μm) na parte superior do tubo. Certifique-se de que o coador da célula seja empurrado até que pare.
   2. Transfira as larvas do frasco de vidro para o coador celular. Certifique-se de que as larvas estão submersas no tampão e incubar a 70 °C por 2 h.
5. Prepare um novo tubo contendo 50 mL de SSCT pré-aquecidos 0,2x.
   1. Transfira o coador de células da etapa 10.4.2 para o novo tubo de 0,2x SSCT e incubar a 70 °C por 2 h.
   2. Repita o passo 10.5 mais uma vez.

11. Dia 7: Bloqueio

1. Transfira as larvas para um novo frasco de vidro e esfrie para temperatura ambiente.
2. Substitua o SSCT 0,2x por 4 mL de 67% 0,2x SSCT/33% MABT e a rocha à temperatura ambiente por 10 minutos.
3. Substitua a solução na etapa 11.2 por 4 mL de 33% 0,2x SSCT/67% MABT e rocha por 10 min.
4. Substitua a solução na etapa 11.3 por 4 mL de MABT e a rocha por 10 minutos.
5. Substitua o MABT por 4 mL de MABT fresco e a rocha por 10 minutos. Repita mais uma vez.
6. Substitua o MABT por 4 mL da solução de bloqueio e incubar a 4 °C durante a noite. É possível incubar mais por conveniência.

12. Dia 8 - 9: Incubação de anticorpos

1. Diluir o anticorpo anti-fluoresceína 1:5.000 em 500 μL solução de bloqueio.
2. Substitua a solução de bloqueio pela solução de anticorpos e incubar a 4 °C por 2 dias. É possível incubar mais por conveniência.
   1. Gire o frasco duas vezes por dia para agitar as larvas.
      NOTA: Larvas com mais de 6 mm precisam de mais 1-2 dias de incubação.

13. Dia 10 - 11: Lavagem de anticorpos

1. Substitua a solução de anticorpos por 4 mL de PBST e a rocha em temperatura ambiente por 10 minutos.
2. Substitua o PBST por 4 mL de PBST fresco e a rocha por 10 minutos. Repita mais uma vez.
3. Transfira as larvas para um tubo de 50 mL.
4. Adicione 40 mL de PBST2. Coloque o tubo de lado e a pedra a 4 °C durante a noite.
5. Substitua o PBST2 por 40 mL de PBST2 fresco e asse a 4 °C durante a noite. É possível incubar mais por conveniência.
   NOTA: Larvas com mais de 6 mm precisam de mais 1-2 dias de lavagem.

14. Dia 12: Manchas

1. Transfira as larvas para uma placa de 6 poços.
2. Substitua o PBST2 por 3 mL de tampão de coloração e rocha em temperatura ambiente por 5 minutos.
3. Substitua o tampão de coloração por 3 mL de tampão de coloração fresco e a rocha por 5 minutos. Repita mais uma vez.
4. Substitua o tampão de coloração por 3 mL da solução de coloração. Cubra com papel alumínio e monitore a mancha nas próximas horas.
   1. Para sondas com um sinal fraco, incubar a 4 °C durante a noite e substituir a solução de coloração por uma solução de coloração fresca uma vez no meio.
5. Quando a intensidade de coloração desejada for atingida, substitua a solução de coloração por 3 mL da solução de parada e a rocha por 30 minutos.
6. Substitua a solução de parada por 3 mL de solução de parada fresca e arrase por 30 minutos. Repita mais uma vez.
7. Transfira as larvas para um novo frasco de vidro e substitua a solução de parada por 4 mL de solução de fixação fresca e incubar por 1h à temperatura ambiente. É possível incubar mais a 4 °C por conveniência.
8. Armazene as larvas na solução de fixação no escuro a 4 °C por até um ano.

15. Dia 12: Imagem

1. Substitua a solução de fixação por 4 mL de PBST e a rocha em temperatura ambiente por 10 minutos.
2. Transfira as larvas para uma placa de 6 poços.
3. Substitua o PBST por 4 mL de PBST fresco e a rocha por 10 minutos. Repita mais uma vez.
4. Substitua o PBST por 3 mL de 50% de glicerol (em PBST) e a rocha por 10 min.
5. Substitua a solução na etapa 15.4 por 3 mL de 100% glicerol sem balançar por 10 minutos.
6. Use um microscópio dissecando para imaginar as larvas diretamente na placa de 6 poços ou transfira as larvas para um slide de depressão para imagem sob um microscópio composto. Use um manipulador de cílios para orientar as larvas.

Resultados

Utilizando a linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP), foi demonstrado que este protocolo de hibridização in situ é eficaz na rotulagem de células progenitoras renais e várias estruturas de nefrão durante o desenvolvimento de mesonephros. Como esperado, o sistema nervoso central também é rotulado nesta linha transgênica (não mostrada). O nefron mesoneférico inicial se forma em aproximadamente 5,2 mm, dorsal aos tenebrosos (Figura 2A), e o túbulo distal deste nefron é ...

Discussão

O método de hibridização in situ descrito aqui visa estudar o desenvolvimento de mesonepros. No entanto, pode ser aplicado para estudar o desenvolvimento de outros tecidos e órgãos durante a metamorfose, como intestino, sistema nervoso, escamas e ^{pigmentação14}. Sondas podem ser geradas para genes endógenos ou marcadores fluorescentes em linhas transgênicas.

É fundamental que as larvas permaneçam intactas para observar os órgãos e tecidos em seu con...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-fluorescein antibody	Roche/Sigma-Aldrich	11426338910
Bleaching solution			0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST
Blocking reagent	Roche/Sigma-Aldrich	11096176001	Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction
Cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549	100 μm
E3 medium			5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue
Eyelash manipulator	Fisher Scientific	NC1083208	Use to manipulate larvae
Fixing solution			4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down
Fluorescein probe synthesis	Roche/Sigma-Aldrich	11685619910
Glass vial	Fisher Scientific	03-338B
Hatchfry encapsulation	Argent
Hyb- solution			50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20
Hyb+ solution			HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin
MAB (10X)			1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5
MABT			1X MAB, 0.1% Tween-20
Maleic acid	Sigma-Aldrich	M0375
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127
PBS (10X)			8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4
PBST			1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST2			1X PBS, 0.2% Tween-20
Powder food			Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P5568	Use to permeabilize larvae
Proteinase K solution			20  μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST
Spirulina microfine powder	Argent
SSC (20X)			3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave
SSCT (0.2X)			Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
SSCT (2X)			Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
Staining buffer			100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20
Staining solution			200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer
Stopping solution			1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST
Torula (yeast) RNA	Sigma-Aldrich	R6625
Tricaine	Sigma Aldrich	E10521	2%, pH 7
Wash buffer			50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20